Дозозависимое влияние альфа-токоферола ацетата на показатели перекисного окисления липидов в эксперименте Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Коллектив авторов., 2007 УДК 615.356:577.161.3].015.42

ДОЗОЗАВИСИМОЕ ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА АЦЕТАТА НА ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В

ЭКСПЕРИМЕНТЕ

В.Г. Макарова, Е.Н.Якушева, В.В.Шумский

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова

В работе исследуется действие курсового назначения различных доз альфа-токоферола ацетата на интенсивность перекисного окисления липидов и активность глутатионтрансферазы при свободнорадикальной патологии.

Активация перекисного окисления липидов - процесс, характерный для патогенеза ишемической болезни сердца, атеросклероза [3], инсульта [6], болезни Паркинсона [17], злокачественных новообразований [8] и другой патологии. Витамин Е (альфа-токоферол) является классическим антиоксидантом [2], защищающим полиненасыщенные жирные кислоты от свободнорадикального окисления [4]. Данный препарат используется в комплексной терапии многих заболеваний. Известно, что альфа-токоферол уменьшает прогрессирование болезни Альцгеймера [16], хронического бронхита [11]. Рационально применение альфа-токоферола в комплексной терапии ишемической болезни сердца [7], в том числе инфаркта миокрада [5]. Его эффекты реализуются за счет того, что молекула токоферола способна встраиваться в липидный бислой клеточных мембран и прерывать реакции перекисного окисления липидов. Известно, что препарат повышает активность некоторых антиоксидантных ферментов, в том числе глутатионтрансферазы [9]. Однако как антиоксидант фенольной структуры, в некоторых условиях, за счет накопления феноксильного радикала токоферола он проявляет противоположные, т.е. прооксидантные свойства [12,13]. Уточнение влияния альфа-токоферола на показатели ПОЛ необходимо для оптимизации антиоксидантной терапии.

Цель исследования: изучить дозозависимое влияние альфа-токоферола на ПОЛ в условиях экспериментальной острой гипоксической гипоксии (ОГГ).

Материалы и методы

Эксперимент выполнен на 67 белых беспородных крысах-самцах массой 200 ± 20 г. Животным четырех опытных серий (n=12) ежедневно внутрижелудочно вводили масляный раствор альфа-токоферола ацетата (ICN Pharmaceutical) из расчета 25 и 250 мг/кг массы в течение 3 и 7 суток. Животные контрольных серий (интактные, n=7, и контроль гипоксии, n=12) получали растворитель (оливковое масло) в аналогичном обьеме в течение 7 дней. После указанных сроков животных опытных серий подвергли воздействию ОГГ. Гипоксию моделировали путем экспозиции крыс в барокамере объемом 0,125 м3 с приточно-вытяжной вентиляцией, в которой создавалось разрежение воздуха, адекватное высоте 7500-8000 метров. Экспозиция продолжалась 6 часов, длительность «подъема» и «спуска» - 20 минут,

это время не учитывалось в общей продолжительности сеанса. Летальность во время моделирования патологии составила 40%.

Для оценки активности ПОЛ в гомогенатах печени, почек и сердца спектрофотометрически исследовали фоновое содержание малонового диальдегида (МДА) по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой [10]. Активность глутатионтрансферазы в гомогенатах определяли по реакции с 1-хлор-2,4-динитробензолом [15]. Определение выполняли на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Хьюмалайзер-2000» (Германия).

Достоверность различий средних величин оценивали по критерию Стьюдента, исходя из уровня вероятности безошибочного прогноза 95% (р<0,05).

Результаты и их обсуждение

Содержание МДА в гомогенатах печени, почек и миокарда интактных животных составило соответственно 132,14±6,47; 123,71±6,79 и 81,92±3,78 нмоль/мг.

Фоновое содержание МДА в исследуемых тканях у животных с ОГГ и при профилактическом курсовом введении альфа-токоферола в двух дозах перед моделированием острой гипоксической гипоксии представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Фоновое содержание МДА в печени, почках и миокарде контрольных животных и при профилактическом курсовом введении витамина Е в двух

дозах на фоне О1 § І

^^Доза и »урс Орган Контроль ОГГ 25мг 3сут 25мг 7сут 250мг 3сут 250мг 7сут

Печень ^ 215,32± 11,23 *71,80±5,64 *32,30±2,45 *36,63±2,47 * 14,90±1,24

Почки 153,82±8,95 135,39±5,76 * 124,51±5,50 *95,23±5,54 *87,90±4,93

Миокард 250,64± 14,80 211,50± 13,78 *180,54± 12,37 *175,51± 9,21 *120,32± 6,86

Примечание: здесь и далее * отмечены значения, различия которых с контролем ОГГ статистически достоверны (р<0,05)

У животных с контролем ОГГ отмечалось достоверное повышение содержания МДА в ткани печени, почек и миокарда на 36,8%, 19,6% и 67,6% соответственно, по сравнению с данными у интактных животных.

В печени при профилактическом введении витамина Е в дозе 25 мг/кг массы в течении 3 и 7 суток фоновое содержание МДА достоверно понижалось по сравнению с контролем гипоксии на 66,7% и 85,0% соответственно, введение препарата в дозе 250 мг/кг массы вызвало достоверное снижение данного показателя соответственно на 83,0% и 93,3%. При этом во все сроки применения обеих доз отмечалось достоверное уменьшение содержания МДА по сравнению с уровем у интактных животных (рис 1).

*

р

е

део

с

о

|_

о

в

о

н

о

*

е

е

м

з

-10

-20

-30

-40

-50

-60

-70

-80

-90

-100

*

*

*

•к

Рис 1. Изменение фонового содержания МДА в ткани печени на фоне профилактического курсового назначения альфа-токоферола ацетата при острой гипоксической гипоксии (в процентах по сравнению с контролем ОГГ).

Профилактическое введение альфа-токоферола ацетата в дозе 25 мг/кг массы перед моделированием ОГГ снижало содержание МДА в ткани почек на 3 сутки на 11,0% (р>0,05), на 7 сутки на 19,0% (р<0,05) по сравнению с контролем патологии. Назначение препарата в дозе 250 мг/кг массы достоверно уменьшало содержание МДА в почках в исследуемые сроки соответственно на 38,1% и 42,9%. При использовании витамина Е в высокой дозе в течении 3 и 7 суток наблюдалось достоверное снижение содержания МДА по сравнению с уровнем нормы (рис 2).

-5

-10

-15

■20

■25

■30

■35

Л

е

д

о

с

е

о

в

о

н

о

*

е

І -40 з

-45

-50

Рис 2. Изменение фонового содержания МДА в ткани почек на фоне профилактического курсового назначения альфа-токоферола ацетата при острой гипоксической гипоксии (в процентах по сравнению с контролем ОГГ).

Профилактическое введение альфа - токоферола ацетата в дозе 25 мг/кг массы приводило к снижению содержания МДА в миокарде на 3 сутки на 15,6% (р>0,05); на 7 сутки показатель достоверно уменьшился на 28,0% по сравнению с контролем ОГГ. Назначение препарата в большой дозе вызывало достоверное понижение уровня МДА в сердце на 30,0% и 52,0% соответственно на 3 и 7 сутки опыта. Нормализации содержания МДА до уровня у интактных животных при использовании обеих доз отмечено не было (рис 3).

*

*

*

*

*

*

*

*

е

н

е

м

з

*

р

е

д

о

с

Є

о

в

о

-10

-20

30

-40

о

-50

е

-60

-70

-80

Рис 3. Изменение фонового содержания МДА в миокарде на фоне профилактического курсового назначения альфа-токоферола ацетата при острой гипоксической гипоксии (в процентах по сравнению с контролем ОГГ).

Активность глутатионтрансферазы в тканях печени, почек и миокарда у интактных животных составила соответственно 1920,68±210,52, 984,17±95,22 и 790,45±78,39 мкмоль/мин/мг.

Активность глутатионтрансферазы в исследуемых тканях у животных с ОГГ и при профилактическом курсовом введении альфа-токоферола в двух дозах перед моделированием острой гипоксической гипоксии представлена в таблице 2.

Таблица 2.

Изменение активности глутатионтрансферазы в печени, почках и миокарде контрольных животных и при профилактическом курсовом введении

Доза и ^^орган КУРс Контроль ОГГ 25мг 3сут 25мг 7сут 250мг 3сут 250мг 7сут

Печень 4 1584,37± 120,49 1693,34± 154,25 *1759,83± 166,19 *1778,82± 173,34 *2049,73± 194,42

Почки 730,49± 65,39 763,58± 74,64 776,72± 78,56 779,64± 81,71 *797,17± 74,62

Миокард 560,41± 58,18 580,16± 57,92 582,96± 58,17 585,23± 57,64 589,68± 59,26

У животных с контролем ОГГ в гомогенатах печени, почек и миокарда активность фермента достоверно уменьшалась на 17,5%, 25,8% и 29,1% соответственно, по сравнению с данными у интактных животных.

В ткани печени при профилактическом назначении витамина Е в дозе 25 мг/кг массы в течение 3 суток активность фермента повысилась на 6,9% (р>0,05), 7 суток - на 11,1% (р<0,05) по сравнению с контролем ОГГ. При назначении витамина Е в дозе 250 мг/кг на 3 и 7 сутки активность глутатионтрансферазы достоверно увеличилась на 12,3% и 23,7% соответственно. Нормализация активности глутатионтрансферазы отмечалась только при введении витамина в большой дозе в течение 7 суток (рис 4).

30

_а

со

го ф -&

£ 25

ГО н о

*

*

*

о

0

1

т

го

ф

ф

ф

20

15

10

25*3

25*7 250*3 250*7

доза и срок введения витамина Е

интакт

5

0

Рис 4 Изменение активности глутатионтрансферазы в ткани печени на фоне профилактического курсового назначения альфа-токоферола ацетата при острой гипоксической гипоксии (в процентах по сравнению с контролем ОГГ).

В ткани почек при 3-х и 7-дневном профилактическом введении витамина Е перед моделированием ОГГ в малой дозе отмечалась тенденция к повышению активности фермента. Назначение препарата в дозе 250 мг/кг массы вызывало достоверное нарастание активности фермента на 9,2% при увеличении курса введения до 7 суток. Нормализация активности фермента до уровня у интактных животных не отмечалась.

Профилактическое назначение альфа-токоферола в обеих исследуемых дозах при 3х и 7-дневном назначении приводило к незначительному и недостоверному увеличению активности фермента в миокарде.

Таким образом, во всех сериях опыта, независимо от назначаемой дозы витамина Е, отмечался антиоксидантный эффект. Иннверсии антиоксидантного эффекта в прооксидантный при назначении высокой дозы не выявлялось, что может быть связано с наличием в клетке системы восстановления феноксильного радикала аскорбатом, которая предотвращает накопление потенциально прооксидантного агента [3].

Глутатионтрансфераза- фермент, восстанавливающий мембранные гидроперекиси фосфолипидов непосредственно в мембранах, без предварительного гидролиза фосфолипазой А2. [1]. Данный фермент является белком и подвергается

оксидативной модификации [14], что вызывает уменьшение или ликвидацию функциональной активности. Как липидный фенольный антиоксидант, токоферол за счет своего прямого действия предотвращает повреждение фермента активными формами кислорода и, таким образом, косвенно усиливает антиоксидантную защиту клетки.

Выводы

1. Острая гипоксическая гипоксия приводит к активации ПОЛ, характеризующейся увеличением содержания МДА и снижением активности глутатионтрансферазы.

2. Профилактическое 3- и 7-дневное введение альфа-токоферола при острой гипоксической гипоксии в дозах 25 и 250 мг/кг массы вызывает понижение интенсивности перекисного окисления липидов, проявляющееся уменьшением фоновой концентрации МДА и повышением активности глутатионтрансферазы, наиболее выраженное в ткани печени и почек.

3. Нормализация содержания МДА достигается в ткани печени при профилактическом назначении обеих доз витамина Е при ОГГ курсами 3 и 7 дней, в ткани почек - при введении витамина в дозе 250 мг/кг в течение 3 и 7 суток. Нормализация активности глутатионтрансферазы наблюдается только в ткани печени при назначении витамина Е при ОГГ в высокой дозе в течение 7 суток.

4.Инверсия антиоксидантного действия в прооксидантное при назначении указанных доз в условиях острой гипоксической гипоксии не обнаружена.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Бондарь Т.Н., Ланкин В.З., Антоновский В. Л. Восстановление органических гидропероксидов глутатионпероксидазой и глутатион-8-трансферазой: влияние структуры субстрата / Т.Н.Бондарь, В.З.Ланкин, В. Л. Антоновский // Докл. АН СССР. - 1989. - Т. 304, № 1. - С. 217-220.

2. Зенков Н. К., Меньшикова Е. Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи совр. биол.- 1993.- Т. 113. № 3.- С. 286

3. Ланкин В.З., Вихерт А.И. Перекисное окисление липидов в этиологии и патогенезе атеросклероза // Архив патологии 1989 - №1 - с.80.

4. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях./В.З.Ланкин, А.К.Тихазе, Беленков Ю.Н.-М.,2001-78 с.

5. Л.А. Лещинский, И.В. Логачева, А.Н. Родионов, Т.И. Горнович, Н.М. Петров Эналаприл малеат и a-токоферол в лечении и реабилитации больных инфарктом миокарда.// Кардиология - 1998. - №11// www.mediasphera.ru/cardio/98/11/r1198ref.htm#3

6. Лукьянова Л. Д., Кислородозависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние/Л. Д. Лукьянова.-М,1982.-307с.

7. И.В. Неверов Место антиоксидантов в комплексной терапии пожилых больных ИБС.// Рос. мед. ж. - 2001. - №18 http://www.rmj.ru/rmj/t9/n18/767.htm

8. Н.В.Никифорова, Л.А.Ходырева, В.И.Кирпатовский, А.М.Чумаков Перекисное окисление липидов в злокачественных опухолях почек человека //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины-2001-Т.132№11-С.565

9. Ракита Д.Р., Луняков В.А., Гармаш В.Я., Строев Е.А.

Регуляция перекисного окисления липидов у больных бронхиальной астмой и возможности ее коррекции/ 6 Национальный конгресс по болезням органов дыхания Новосибирск, 1-4 июля 1996 г. http://www.pulmonology.ru/Sod/Tezis-96/part-48.htm

10. Стальная И.Д. Метод определения МДА с помощью ТБК / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.

11. Трубников Г. А., Журавлев Ю.И. Антиоксиданты в комплексной терапии больных хроническим бронхитом.// Рос. мед. ж. - 1998. - №2. - С.38-41.

12. Bowry V. W, Ingold. K. U. Extraordinary Kinetic Behavior of the alpha-Tocopheroxyl (Vitamin E) Radical.// J. Org. Chem., 60, 5456 (1995)..

13. Bowry VW, Stocker R. Tocopherol-mediated peroxidation: the pro-oxidant effect of vitamin E on the radical-initiated oxidation of human low-density lipoprotein.// J. Am. Chem. Soc. 1993;115:6029-6044.

14. Dean R.T., Fu Sh.,Stocker R., Davies M.J. // Ibid. 1997. Vol. 324, № 1. P. 1-18

15. Keen J.N. Glutathione transferases catalysis of nucleophylic reactions of glutathione / J.N. Keen, W.B. Iakoby // Biol. Chem. - 1978. - V. 253, № 16. - P. 5854-5858.

16. Selegiline or a-tocopherol slowed the progression of Alzheimer disease. ACP J Club 1997;127:67.

17. Waters С. M. Mechanisms of neuronal cell death. An overview // Mol. Chem. Neuropathol. - 1996. - Vol. 28, N 1-3. -P. 145-151.

In this work it is given the analysis of the influence of different alpha-tocopherol doses indication on the lipid peroxydation and activity of the glutathiontransferase in rat’s liver, kidneys and heart in the state of stimulated lipid peroxydation (acute hypoxic hypoxia).