CC BY
11
Лесной вестник /Forestry Bulletin, 2024. Т. 28. № 1. С. 56-67. ISSN 2542-1468 Lesnoy vestnik /Forestry Bulletin, 2024, vol. 28, no. 1, pp. 56-67. ISSN 2542-1468
Biological and technological aspects of forestry
УДК 57.089.3:581.331.2 DOI: 10.18698/2542-1468-2024-1-56-67 Шифр ВАК 4.1.2
ДОСТОВЕРНОСТЬ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ КАЧЕСТВА ПЫЛЬЦЫ ХВОЙНЫХ РАСТЕНИЙ
М.В. Сурсо
ФГБУН «Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук», Россия, 163020, г. Архангельск, пр. Никольский, д. 20
Приведены результаты определения жизнеспособности пыльцы хвойных видов растений косвенными методами. Предложенные методологические подходы позволили исключить возможные ошибочные оценки при интерпретации результатов тестирования жизнеспособности пыльцы. Установлено, что флуоресцентные методы чаще всего завышают фактическую жизнеспособность пыльцы, определенную прямыми методами. Большинство из использованных в опытах флуорохромов малопригодны для оценки жизнеспособности пыльцы. Визуальная оценка общей и специфичной ферментативной активности пыльцы показала результаты, близкие к ее фактической жизнеспособности. Методы, в основе которых лежит выявление ферментативной активности могут быть рекомендованы для экспресс-диагностики качества пыльцы хвойных растений.
Ключевые слова: пыльца, жизнеспособность, хвойные, флуоресценция, ферменты
Ссылка для цитирования: Сурсо М.В. Достоверность методов экспресс-диагностики качества пыльцы хвойных растений // Лесной вестник / Forestry Bulletin, 2024. Т. 28. № 1. С. 56-67. DOI: 10.18698/2542-1468-2024-1-56-67
Жизнеспособность пыльцы определяется ее способностью к прорастанию в пыльцевые трубки нормальной длины и, преимущественно, выражается долей проросших in vitro пыльцевых зерен. Проращивание пыльцы на искусственных средах — прямой и наиболее надежный метод оценки ее качества, имеющий, однако ряд недостатков: субстрат может зарастать мицелием грибов, спорами которых часто заражена пыльца; возникают так называемые «популяционные эффекты» [1]; равномерность высева во многом предопределяется навыками исследователя; требуется проведение продолжительных наблюдений.
Цель работы
Цель работы — оценка достоверности результатов определения жизнеспособности пыльцы хвойных видов растений косвенными методами.
Косвенные (непрямые) методы определения качества пыльцы приобрели популярность вследствие простоты применения и быстрого получения конечных результатов. Однако они отражают не фактическую жизнеспособность пыльцы, а лишь ее доброкачественность. Связь между доброкачественностью (Q), жизнеспособностью (V) и фертильностью (F) пыльцы можно выразить простым соотношением: Q > V> F.
Наибольшее распространение получили косвенные методы, основанные на выявлении в пыльце активности ферментов: пероксидазы [2, 3],
© Автор(ы), 2024
сукцинатдегидрогеназы [4], галактозидазы [5] и др. Многие авторы, использовавшие эти методы в своих исследованиях, отмечали несколько завышенные, по сравнению с традиционным проращиванием, результаты [6, 7], другие считают их не вполне надежными и не имеющими положительной корреляции с тестами на проращивание in vitro [8, 9]. Методы, основанные на окрашивании пыльцы традиционными гистологическими красителями [10-13], также чаще всего завышают результаты и лишь дают представление об особенностях морфологической структуры пыльцевых зерен. Иногда косвенные методы остаются единственно возможными при определении качества пыльцы, например, лиственницы (Larix sibirica Ledeb.), проращивание которой затруднено из-за длительного латентного периода [14].
Широкое распространение приобрели люминесцентные методы определения качества пыльцы растений. Наиболее популярными флуоресцентными красителями на настоящее время остаются акридиновый оранжевый [15], флуо-ресцеин диацетат [16, 17] и его модификации и некоторые другие. С развитием техники флуоресцентной микроскопии этот перечень постоянно пополняется.
Для оценки качества пыльцы, наряду с визуальными можно использовать методы, основанные на корреляции физико-химических свойств протоплазмы пыльцы с ее фактической жизнеспособностью [18].
Основную проблему при интерпретации результатов оценки качества пыльцы косвенными методами представляет отсутствие четких критериев селективности красителей к пыльце с разной жизнеспособностью. Использование в качестве контроля образцов пыльцы, некроти-рованной термическим шоком или химическим воздействием не вполне корректно, поскольку такие воздействия могут вызывать деформацию внутренних структур пыльцевого зерна и дезинтеграцию высокомолекулярных соединений.
В настоящей работе в качестве контроля селективности красителей была использована пыльца различных видов хвойных растений, которая хранилась в течение длительного (от 26 до 33 лет) времени при температуре +1...+2 °C в эксикаторах над безводным хлоридом кальция. При таких условиях пыльца, например, сосны может сохранять жизнеспособность в течение 10 лет и более (табл. 1). Через 15 лет пыльца полностью утрачивает способность к прорастанию, хотя все ее морфологические структуры сохраняются.
Таблица 1 Результаты проращивания пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) после разных сроков хранения Results of common pine (Pinus sylvestris L.) pollen germination after different storage periods
Продолжительность хранения, лет Проращивание на минеральной среде Нигаарда Проращивание на агаровом субстрате (концентрация сахарозы 10 %)
М ± тМ CV, % М ± тМ CV, %
0 66,4 ± 5,4 12,6 91,5 ± 2,5 5,4
2 14,0 ± 2,5 21,4 59,1 ± 6,3 18,5
3 0 - 36,9 ± 1,8 6,5
4 0 - 28,6 ± 7,0 34,5
6 0 - 20,2 ± 0,9 8,9
10 0 - 13,6 ± 1,4 7,2
15 0 - 0 -
Такой методологический подход позволил исключить возможные ошибочные оценки при интерпретации результатов тестирования жизнеспособности пыльцы.
Материалы и методы
Проращивание пыльцы хвойных видов растений проводили в чашках Петри на среде, содержащей 1%-й агар и 5- или 10%-ю сахарозу в термостате при температуре +26,5 °С. Продолжительность проращивания свежесобранной пыльцы ели составила 72 ч, сосны — 96, можжевельника — 168 ч. Пыльца сосны и ели считалась проросшей, если длина пыльцевой
трубки более чем в 2 раза превышала высоту тела зерна. Жизнеспособность пыльцы можжевельника определялась как сумма половины количества пыльцевых зерен, сформировавших внутри гидрофильной капсулы двухклеточный микрогаметофит туфелькообразной формы, и всего количества пыльцевых зерен, сформировавших пыльцевые трубки, кончики которых вышли из гидрофильной капсулы наружу. Сроки проращивания старой пыльцы не регламентировались и определялись темпами развития микрофлоры на поверхности среды. Проращивание завершали после существенного зарастания среды мицелием при отсутствии видимых признаков жизнеспособности пыльцы.
Растворы красителей для флуоресцентной микроскопии готовили с учетом рекомендаций компаний-производителей и литературных данных. Окрашенные препараты пыльцы просматривали и фотографировали на люминесцентном микроскопе Altami Lum 1 Led с соответствующими светофильтрами.
Принятые обозначения:
DAPI — 4',6-диамидино-2-фенилиндол;
FDA — флуоресцеин диацетат;
EthD-III — этидиум гомодимер III;
Hoechst 33342 — тригидрат тригидрохлори-да 2'-[4-этоксифенил]-5-[4-метил-1-пиперази-нил]-2,5'-би-1Н-бензимидазола;
ДМСО — диметилсульфоксид;
MTT — 3- (4, 5-диметилтиазолил 1-2) 2, 5-ди-фенил-тетразолий;
ADH — алкогольдегидрогеназа (EC 1.1.1.1.);
GDH — глутаматдгидрогеназа (EC 1.4.1.2.);
MDH — малатдегидрогеназа (EC 1.1.1.37.);
SkDH — шикиматдегидрогеназа (EC 1.1.1.25.);
АО — акридиновый оранжевый.
Стоковый 14,3 мМ раствор DAPI готовили растворением 5 мг этого красителя в 1 мл диме-тилформамида. Для приготовления промежуточного 300 мкМ раствора DAPI к 2,1 мкл стокового раствора добавляли 100 мкл фосфатного буфера, pH 7,4. Рабочий раствор 300 нМ DAPI готовили разбавлением промежуточного раствора в фосфатном буфере в пропорции 1:1000. Окрашивание пыльцы проводили в рабочем растворе в течение нескольких минут в темноте при комнатной температуре.
Стоковый раствор флуоресцеин диацетата (5 мг FDA в 1 мл ацетона) хранили при температуре -20 °С. Перед использованием стоковый раствор FDA разбавляли деионизированной дистиллированной водой в соотношении 1:1000. Окрашивание пыльцы проводили на вращающемся шейкере в темноте при комнатной температуре в течение 10.. .20 минут.
Стоковый раствор Hoechst 33342 готовили растворением 10 мг красителя в 1 мл ДМСО. Для приготовления рабочего раствора стоковый раствор Hoechst 33342 разбавляли фосфатным буфером, pH 7,4 в соотношении 1:10 000. Окрашивание пыльцы производили в рабочем растворе красителя в течение 20...30 мин в темноте при температуре 37 °C. Перед просмотром пыльцу трижды промывали в фосфатном буфере, нагретом до 37 °C.
Стоковый раствор акридинового оранжевого представлял 0,1%-й водный раствор красителя. Перед использованием его разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:10 000. Для окрашивания пыльцы к объему водной суспензии пыльцы добавляли равный объем рабочего раствора АО. Окрашивание проводили в темноте в течение 10.20 мин при комнатной температуре на вращающемся шейкере.
Рабочий раствор кальцеина AM готовили растворением 10 мкл заводского препарата кальцеи-на АМ (Biotium), нагретого до комнатной температуры, в 10 мл фосфатного буфера. Окрашивание пыльцы проводили в течение 30.40 мин в темноте при температуре 37 °C. Перед просмотром пыльцу трижды промывали в фосфатном буфере, нагретом до 37 °C.
Для оценки числа апоптотических и некротических пыльцевых зерен использовали многокомпонентный препарат Apoptotic, Necrotic and Healthy Cells (Biotium). Однократный связывающий буфер готовили добавлением к одному объему пятикратного связывающего буфера ан-нексина V четырех объемов дистиллированной воды. В исследуемый образец пыльцы добавляли 100 мкл связывающего буфера, 5 мкл аннек-сина V CF ® 488A и 5 мкл EthD-III. Краситель Hoechst 33342 в состав препарата не вводили. Суспензионную культуру инкубировали в течение 15.30 мин в темноте при комнатной температуре на вращающемся шейкере.
Для выявления активности ферментов: ADH, GDH, MDH и SkDH в пыльце готовили инкубирующие растворы по протоколам для изофер-ментного анализа [19]. Навески реактивов при этом увеличивали вдвое. К водной суспензии пыльцы добавляли равный объем инкубирующего раствора. Полученную смесь инкубировали в течение 2-3 ч в темноте на вращающемся шейкере при температуре 35 °С. Для выявления общей активности дегидрогеназ пыльцу инкубировали в таких же условиях в течение 1-2 ч в 5%-м водном растворе сахарозы, содержащем тетразолиевый краситель MTT в концентрации 0,2 мг/мл. Затем каплю суспензии, содержащей небольшое количество пыльцы, переносили на предметное стекло и высушивали в термостате при температуре 35 °С.
На высушенный образец наносили каплю 50%-го глицерола, пыльцу равномерно распределяли по поверхности предметного стекла и накрывали покровным стеклом [20-22]. По нашим наблюдениям, процедура высушивания препаратов при окрашивании пыльцы красителем MTT является излишней. К тому же при этом часто происходит деформация внутренних структур пыльцевых зерен, поэтому в дальнейшем ограничились инкубированием пыльцы в растворе красителя. Препараты, окрашенные на ферменты, просматривали и фотографировали на прямом лабораторном микроскопе Axio Scope A1 (Zeiss).
Результаты и обсуждение
Примеры флуоресценции образцов свежесобранной и старой пыльцы можжевельника обыкновенного (Juniperus communis L.), ели (Picea abies L. (Karst.) x P obovata Ledeb.) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), окрашенных флуорохромами, приведены в табл. 2-4.
Окрашивание пыльцы флуоресцеин диаце-татом широко распространенная процедура для оценки качества пыльцы [23-31]. Метод основан на способности FDA проникать сквозь мембраны внутрь живых клеток и в его преобразовании во флуоресцирующие производные [32].
Доброкачественная свежесобранная пыльца (q2) сосны, ели и можжевельника имела яркую флуоресценцию всего тела зерна или его центральной части. В сомнительных случаях (qx) слабая флуоресценция наблюдалась в центральной части тела зерна, в месте локализации вегетативного ядра (у видов Pinaceae) или ядра микроспоры (у можжевельника). Полное отсутствие флуоресценции свидетельствовало о явно некачественной пыльце. Доброкачественность пыльцы Q в каждом образце определяли как Е (0,5qx + q2) [31]. В большинстве случаев результаты проращивания и окрашивания свежесобранной пыльцы красителем FDA оказались весьма близкими (табл. 5).
Окрашивание красителем FDA старой (нежизнеспособной) пыльцы показало, что у небольшого числа пыльцевых зерен некоторых видов хвойных растений способность к флуоресценции сохранилась.
Другой флуорохром, который часто используется для оценки качества пыльцы — акридиновый оранжевый, избирательно реагирующий с ДНК и РНК клетки. В концентрациях, необходимых для возбуждения люминесценции, АО обладает минимальной токсичностью, что делает его почти идеальным витальным красителем. По наблюдениям Г.М. Козубова [15], при окрашивании пыльцы сосны акридиновым оранжевым в жизнеспособных пыльцевых зернах наблюдалась
Таблица 2
Характер флуоресценции свежесобранной и старой пыльцы можжевельника обыкновенного (Juniperus communis L.) Fluorescence character of freshly collected and old pollen of ground cedar (Juniperus communis L.)
Краситель
Свежесобранная жизнеспособная пыльца
Старая нежизнеспособная пыльца
FDA
Акридиновый оранжевый
DAPI
Hoechst 33342
Кальцеин AM
ярко-зеленая флуоресценция ядер и оранжевая — цитоплазмы. У пыльцевых зерен с пониженной жизнеспособностью наблюдалась однотонная зеленовато-желтая флуоресценция ядер и цитоплазмы. Из табл. 2-5 следует, что с годами спо-
собность к флуоресценции структур пыльцевых зерен, окрашенных АО, не снижается и никак не связана с жизнеспособностью пыльцы.
Одним из наиболее популярных ядерных флуоресцентных красителей в настоящее время
Таблица 3
Характер флуоресценции свежесобранной и старой пыльцы ели (Picea abies L. (Karst.) x P. obovata Ledeb.) Fluorescence character of freshly collected and old pollen of spruce (Picea abies L. (Karst.) x P obovata Ledeb.)
Краситель
Свежесобранная жизнеспособная пыльца
Старая нежизнеспособная пыльца
FDA
Акридиновый оранжевый
DAPI
Hoechst 33342
Кальцеин AM
является DAPI. При связывании с ДНК он излучает синюю флуоресценцию [33]. У свежесобранной пыльцы, окрашенной DAPI, наблюдается яркая синяя флуоресценция ядер и цитоплазмы (см. табл. 2-4). Показатели жизнеспособности
свежесобранной пыльцы, полученные путем проращивания и методом окрашивания DAPI довольно близки (см. табл. 5). При окрашивании старой нежизнеспособной пыльцы выявились неоднородные результаты. Пыльцевые зерна
Таблица 4
Характер флуоресценции свежесобранной и старой пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) Fluorescence character of freshly collected and old pollen of common pine сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.)
Краситель
Свежесобранная жизнеспособная пыльца
Старая нежизнеспособная пыльца
FDA
Акридиновый оранжевый
DAPI
V:
* ш ♦ "
% *
• *
• »
• • • ,
• ♦ • w
Hoechst 33342
Кальцеин AM
сосны обыкновенной и близкой к ней горной сосны сохранили яркую флуоресценцию ядер, тогда как в пыльце ели, пихты, можжевельника, сосен Банкса и погребальной ядерная флуоресценция не проявлялась. В старой пыльце можжевельника
проявлялись некрозы ядер микроспор при сохранении флуоресценции цитоплазмы (см. табл. 2).
Другим популярным ядерным красителем является Hoechst 33342, который, связываясь с ДНК, при возбуждении ультрафиолетовым
Таблица 5
Результаты окрашивания пыльцы хвойных видов растений флуорохромами Results of pollen staining of coniferous plant species with fluorochromes
Вид Продолжительность хранения пыльцы, лет Жизнеспособность фактическая, % Тест на доброкачественность, %
Hoechst 33342 Акридиновый оранжевый Кальцеин AM FDA DAPI
Picea abies x P. obovata 0 62,5 ± 9,8 43,4 ± 8,8 37,7 ± 12,0 40,4 ± 14,4 70,2 ± 12,9 61,2 ± 10,1
Pinus sylvestris 0 92,1 ± 2,2 95,5 ± 3,4 64,4 ± 14,4 77,6 ± 12,2 98,0 ± 1,8 90,8 ± 4,4
Juniperus communis 0 66,8 ± 7,7 87,3 ± 7,4 43,8 ± 13,0 23,3 ± 7,8 62,5 ± 14,4 59,9 ± 8,0
Picea abies x P. obovata 30 0 84,4 ± 9,5 56,4 ± 11,9 0 < 0,1 0
Picea obovata 33 0 78,7 ± 11,3 55,5 ± 10,5 0 0 0
Abies sibirica 33 0 23,0 ± 7,8 85,4 ± 11,7 0 0 0
Pinus sylvestris 26 0 93,3 ± 5,4 69,6 ± 13,4 0 0 75,7 ± 11,1
Pinus banksiana 32 0 97,4 ± 2,2 65,4 ± 18,7 33,0 ± 9,4 < 0,1 35,6 ± 7,7
Pinus mugo 26 0 95,5 ± 3,4 75,5 ± 15,5 73,1 ± 15,5 0,6 ± 0,2 88,4 ± 10,4
Pinus х funebris 26 0 87,4 ± 6,0 43,3 ± 16,4 67,7 ± 17,6 1,1 ± 0,4 0
Pinus sibirica 26 0 67,1 ± 8,9 94,4 ± 2,5 20,5 ± 5,5 0 0
Juniperus communis 26 0 59,5 ± 6,6 44,4 ± 9,3 18,7 ± 6,0 5,5 ± 1,5 0,5 ± 0,2
светом излучает синюю флуоресценцию. Результаты окрашивания свежесобранной и старой пыльцы этим красителем не коррелируют с жизнеспособностью пыльцы, определенной путем проращивания (см. табл. 5). Во всех случаях наблюдался высокий уровень ядерной флуоресценции, что связано с сохранностью ДНК.
Широко используемым маркером для исследования целостности клеточных мембран и количественного определения живых клеток является кальцеин АМ. Как и АО, он не токсичен и в малых концентрациях является идеальным витальным красителем [34, 35]. Результаты, полученные при окрашивании пыльцы этим красителем, неоднозначны (см. табл. 2-5). Так, в старой пыльце ели, пихты и сосны обыкновенной флуоресценция отсутствовала, тогда как в старой пыльце других видов уровень флуоресценции все еще оставался довольно высоким. Корреляция между жизнеспособностью свежесобранной пыльцы, определенной путем проращивания и методом окрашивания кальцеином АМ низкая или средняя.
Гибель клеток происходит в результате двух основных взаимосвязанных процессов: апоптоза и некроза. Апоптоз — это активная, генетически регулируемая стадия дезинтеграции клетки. Чаще всего апоптоз предшествует некрозу, приводящему к разрушению клеточных мембран и органелл клетки. Для количественного опреде-
ления апоптотических и некротических пыльцевых зерен в старой пыльце использовали входящие в набор красителей Apoptotic, Necrotic and Healthy Cells (Biotium) аннексин V и EthD-III. Человеческий антикоагулянт аннексин V представляет собой кальций — зависимый фосфо-липид — связывающий белок массой 35 кДа, окрашивающий апоптотические клетки в зеленый цвет (рис. 1, в).
Гомодимер этидия III (EthD-III) представляет собой высоко положительно заряженный зонд нуклеиновой кислоты, который непроницаем для живых клеток и ранних апоптотических клеток, но окрашивает некротические клетки и поздние апоптотические клетки красной флуоресценцией (см. рис. 1, а). Выполненное на примере старой (нежизнеспособной) пыльцы можжевельника исследование показало приемлемые результаты при изучении апоптозов и некрозов пыльцевых зерен.
При выявлении в пыльце активности деги-дрогеназ (общей или специфичной) с использованием в качестве красителя MTT цитоплазма и ядра потенциально жизнеспособных пыльцевых зерен окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Нежизнеспособная пыльца остается неокрашенной (рис. 2).
Полученные результаты довольно близки к фактической жизнеспособности пыльцы (табл. 6).
Рис. 1. Апоптоз (в) и некроз (а) старой пыльцы можжевельника (окрашивание аннексином V и EthD-III): б — проходящий белый свет; а, в — флуоресценция (а — светофильтр 460...550 нм, в — светофильтр 330...400 нм)
Fig. 1. Apoptosis (в) and necrosis (а) of old juniper pollen (staining with annexin V and EthD-III): б — transmitted white light; а, в — fluorescence (а — light filter 460...550 nm, в — light filter 330...400 nm)
Рис. 2. Результаты тестирования пыльцы на алкогольдегидрогеназу: а — ель (свежая); б — ель (после 30 лет хранения); в — можжевельник (свежая); г — можжевельник (после 26 лет хранения); д — сосна обыкновенная (свежая); е — сосна обыкновенная (после 26 лет хранения) Fig. 2. Results of pollen testing for alcohol dehydrogenase: а — fir (fresh); б — fir (after 30 years of storage); в — juniper (fresh); г — juniper (after 26 years of storage); д — Scots pine (fresh); е — common pine (after 26 years of storage)
Таблица 6
Результаты тестирования пыльцы на ферменты Results of pollen enzyme testing
Вид хвойных растений Продолжительность хранения пыльцы, лет Жизнеспособность фактическая, % Тест на доброкачественность, %
ADH GDH MTT
Picea abies x P. obovata 0 62,5 ± 9,8 77,5 ± 11,1 49,7 ± 9,4 75,7 ± 10,4
Pinus sylvestris 0 92,1 ± 2,2 87,4 ± 6,1 75,3 ± 7,7 95,5 ± 1,8
Juniperus communis 0 66,8 ± 7,7 59,9 ± 8,0 65,6 ± 8,6 59,6 ± 8,4
Picea abies x P. obovata 30 0 0 0 0
Picea obovata 33 0 0 0 0
Abies sibirica 33 0 0 0 0
Pinus sylvestris 26 0 0 0 0
Pinus banksiana 32 0 0 0 0
Pinus mugo 26 0 0 8,7 ± 4,4 0
Pinus х funebris 26 0 0 14,4 ± 6,5 0
Pinus sibirica 26 0 0 0 0
Juniperus communis 26 0 4,4 ± 2,1 7,2 ± 4,1 0
Остаточная активность ADH в старой пыльце можжевельника и GDH в старой пыльце сосен горной и погребальной и можжевельника сохранялась и после полной утраты жизнеспособности пыльцы. При выявлении в пыльце активности MDH и SkDH часто наблюдалось интенсивное фоновое окрашивание пыльцевых зерен, поэтому эти ферменты были исключены из дальнейшего анализа.
Выводы
Использование в качестве контроля старой нежизнеспособной пыльцы позволило исключить ошибочные интерпретации результатов тестирования жизнеспособности пыльцы хвойных видов косвенными методами. Флуоресценция пыльцевых зерен хвойных часто никак не связана с их способностью к формированию пыльцевых трубок. Такие флуорохромы, как акридиновый оранжевый, Hoechst 33342, кальцеин AM малопригодны для тестирования жизнеспособности пыльцы. Наиболее близкие к фактической жизнеспособности результаты были получены при окрашивании пыльцы флуоресцеин диацетатом. При этом окрашивание FDA чаще всего дает несколько завышенные результаты, особенно при окрашивании пыльцы, имеющую низкую фактическую жизнеспособность. Количественное определение апоптотических и некротических пыльцевых зерен в образцах пыльцы возможно с использованием аннексина V и EthD-III, входящих в набор красителей Apoptotic, Necrotic and Healthy Cells (Biotium). Окрашивание пыльцы на такие ферменты, как алкогольдегидрогеназа и глутаматдегидрогеназа показало результаты,
весьма близкие к ее фактической жизнеспособности, определенной путем проращивания in vitro. Наиболее близкие к фактической жизнеспособности результаты были получены при выявлении общей активности дегидрогеназ путем окрашивания пыльцы тетразолием MTT. Методы, основанные на выявлении общей и специфичной ферментативной активности можно признать вполне надежным для экспресс-диагностики качества пыльцы.
Работа выполнена в рамках государственного задания Федеральному исследовательскому центру комплексного изучения Арктики Уральского отделения Российской академии наук (№ гос. регистрации — 122011400384-2).
Список литературы
[1] Tanaka K., Naganuma S. The pollen germination and pollen tube development in Pinus densiflora Sieb. et Zucc. IX. Population effects // Sci. Repts. Hicosaci Univ., 1974, v. 21, no. 2, pp. 71-79.
[2] Шардаков В.С. Реакция на пероксидазу как показатель жизнеспособности пыльцы растений // Доклады АН СССР, 1040. Т. 26. Вып. 3. С. 273-276.
[3] King J.R. The peroxidase reaction as an indicator of pollen viability // Stain. Technol., 1960, v. 35, no. 4, pp. 225-227.
[4] Диакону П. О методе определения жизнеспособности пыльцы при помощи 2,3,5-трифенилтетразолхлорида // Цитология и генетика, 1968. Т. 2. № 5. С. 476-477.
[5] Rodriguez-Riano T., Dafni A. A new procedure to asses pollen viability // Sex Plant Reprod, 2000, v. 12, pp. 241244.
[6] Мауринь А.М., Кауров И.А. Сравнение методов определения жизнеспособности пыльцы древесных пород // Ботанический журнал, 1956. Т. 41. № 1. С. 81-84.
[7] Кауров И.А. Качество пыльцы и семян интродуциро-ванных дальневосточных древесных пород // Ботанический журнал, 1959. Т. 44. № 8. С. 1162-1170.
[8] Parfitt D.E., Ganeshan S. Comparison of procedures for estimating viability of Prunus pollen // Hort Science, 1989. v. 24 (2), pp. 354-356.
[9] Bolat I., Pirlak L. An investigation on pollen viability, germination and tube growth in some stone fruits // Turkish J. of Agriculture and Forestry, 1999. v. 23, pp. 383-388.
[10] Петров А.П., Погорелов С.В. К методике окрашивания зрелой пыльцы галлоцианином // Ботанический журнал, 1987. Т. 72. № 9. С. 1269-1270.
[11] Vizintin L., Bohanec B. In vitro manipulation of cucumber (Cucumis sativus L.) pollen and microspores: isolation procedures, viability tests, germination, maturation // Acta Biologica Cracoviensia. Ser. Botanica, 2004, v. 46, pp. 177-183.
[12] Erdogan U. Determination of pollen quality and quantity in mulberry (Morus alba L.) // Pak. J. Bot., 2015, v. 47 (1), pp. 275-278.
[13] Mendez N.P.,. Porquis H.C, Sinamban E.B., Acma F.M. Comparative pollen viability and pollen tube growth of two endemic philippine Etlingera (Zingiberaceae, Alpinioide-ae) // Philippine J. of Systematic Biology, 2017, v. 11 (2), pp. 1-9.
[14] Тренин В.В. Цитоэмбриология лиственницы. Л.: Наука, 1986. 88 с.
[15] Козубов Г.М. Люминесцентный метод изучения пыльцы растений // Ботанический журнал, 1967. Т. 52. № 8. С. 1156-1157.
[16] Нокс Р.Б. Биология пыльцы. М.: Агропромиздат, 1985. 83 с.
[17] Tosun F., Koyuncu F. Investigations of suitable pollinator for 0900 Ziraat sweet cherry cv.: pollen performance tests, germination tests, germination procedures, in vitro and in vivo pollinations // Hort. Sci. (Prague), 2007, v. 34 (2), pp. 47-53.
[18] Foster G.S., Bridgwater F. Viability tests to evaluate pollen reliability in loblolly pine controlled pollinations // For. Sci., 1979, v. 25, no. 2, pp. 270-274.
[19] Гончаренко Г.Г., Падутов В.Е., Потенко В.В. Руководство по исследованию хвойных видов методом элек-трофоретического анализа изоферментов. Гомель: Изд-во Белорусского научно-исследовательского института лесного хозяйства, 1989. 128 с.
[20] Norton J.D. Testing of plum pollen viability with tetra-zolium salts // Proc. Amer. Soc. Hort. Sci., 1966, v. 89, pp. 132-134.
[21] Seday U., Uzun A., Yilmaz C., Eti S. Production and quality of pollen in terms of fruit set on some self-pollinated pomegranate cultivars // Bulgarian Journal of Agricultural Science, 2013, v. 19 (3), pp. 513-517.
[22] Jyothi K.J., Sunil C.N. Floral phenology and breeding system ofAponogeton appendiculatus V. Bruggen (Aponoget-onaceae) // The International J. of Plant Reproductive
Biology, 2018, v. 10 (2), pp. 161-165. DOI 10.14787/ijprb.2018 10.2
[23] Bayazit S., Çaliçkan O., Imrak B. Comparison of pollen production and quality characteristics of cultivated and wild almond species // Chilean J. of Agricultural Research, 2011, v. 71 (4), pp. 536-541.
[24] Atlagic J., Terzic S., Marjanovic-Jeromela A. Staining and fluorescent microscopy methods for pollen viability determination in sunflower and other plant species // Ind. Crops Products, 2012, v. 35, pp. 88-91.
DOI: 10.1016/j.indcrop.2011.06.012
[25] Calic D., Devrnja N., Milojevic J. Pollen morphology and variability of Tulipa hungarica Borb. // African J. of Biotechnology, 2012, v. 11 (3), pp. 616-620.
[26] Dutta, S.K., Srivastava M., Chaudhary R. Low temperature storage of mango (Mangifera indica L.) pollen // Sci-entia Horlticulturae, 2013, v. 161, pp. 193-197.
[27] Kundu M., Dubey A., Srivastav M. Effect of gamma ray irradiation and cryopreservation on pollen stainability, in vitro germination, and fruit set in Citrus // Turk J. Biol., 2014, v. 38, pp. 1-9.
[28] Impe D., Reitz J., Kopnick C. Assessment of pollen viability for wheat // Front. Plant Sci., 2020, v. 10, p. 1588. DOI: 10.3389/fpls.2019.01588
[29] Helpson-Harrison J., Helpson-Harrison Y. Evaluation of pollen viability by enzymatically induced fluorescence; intracellular hydrolysis of fluorescien diacetaten // Stain Technol., 1970, v. 45, pp. 115-120.
[30] Noland T., Mohammed G. Fluorescein diacetate as a viability stain for tree roots and seeds // New Forests, 1997, v. 14, pp. 221-232.
[31] Сурсо М.В. Оценка доброкачественности пыльцы хвойных видов методом окрашивания пыльцевых зерен флуоресцеин диацетатом // J. of Agriculture and Environment, 2022. № 5 (25). С. 1-6.
[32] Chrzanowski T.H., Crotty R.D., Hubbard J.G., Welch R.P. Applicability of the fluorescein diacetate method of detecting active bacteria in Freshwater // Microb Ecol., 1984,
v. 10, pp. 179-185.
[33] Zink D., Sadoni N., Stelzer E. Visualizing chromatin and chromosomes in living cells // Methods, 2003, v. 29 (1), pp. 42-50. https://doi.org/10.1016/S1046-2023(02)00289-X
[34] Wang X.M., Terasaki P.I., Jr. Rankin C.W., Chia D., Zhong H.P., Hardy S. A new microcellular cytotoxicity test based on calcein AM release / X.M. Wang // Hum Immunol., 1993, v. 37 (4), pp. 264-270.
DOI: 10.1016/0198-8859(93)90510-8
[35] Suuronen E.J., McLaughlin C.R., Stys P.K., Nakamura M., Munger R., Griffith M. Functional innervation in tissue engineered models for In vitro study and testing purposes // Toxicological Sciences, 2004, v. 82 (2), pp. 525-533. DOI: 10.1093/toxsci/kfh270
Сведения об авторе
Сурсо Михаил Вольдемарович — д-р с.-х. наук, гл. науч. сотр., ФГБУН «Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики им. академика Н.П. Лаверова Уральского отделения РАН», [email protected]
Поступила в редакцию 10.04.2023. Одобрено после рецензирования 22.05.2023.
Принята к публикации 20.12.2023.
EXPRESS DIAGNOSTICS METHODS RELIABILITY OF CONIFEROUS SPECIES POLLEN QUALITY
M.V. Surso
Federal Center for Integrated Arctic Research of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 20, Nikolsky av., 163020, Arkhangelsk, Russia
The results of determining the viability of coniferous plant species pollen by indirect methods are presented. The proposed methodological approaches made it possible to exclude possible erroneous estimates when interpreting the results of pollen viability testing. It has been found that fluorescent methods most often overestimate the actual viability of pollen determined by direct methods. Most of the fluorochromes used in the experiments are of little use for assessing the viability of pollen. A visual assessment of the general and specific enzymatic activity of pollen showed results close to its actual viability. Methods based on the detection of enzymatic activity can be recommended for rapid diagnosis of pollen quality of coniferous plants. Keywords: pollen, viability, conifers, fluorescence, enzymes
Suggested citation: Surso M.V. Dostovernost'metodov ekspress-diagnostiki kachestvapyl 'tsy khvoynykh rasteniy [Express diagnostics methods reliability of coniferous species pollen quality]. Lesnoy vestnik / Forestry Bulletin, 2024, vol. 28, no. 1, pp. 56-67. DOI: 10.18698/2542-1468-2024-1-56-67
References
[1] Tanaka K., Naganuma S. The pollen germination and pollen tube development in Pinus densiflora Sieb. et Zucc. IX. Population effects. Sci. Repts. Hicosaci Univ., 1974, v. 21, no. 2, pp. 71-79.
[2] Shardakov V.S. Reaktsiya na peroksidazu kak pokazatel' zhiznesposobnosti pyl tsy rasteniy [Reaction to peroxidase as an indicator of the viability of plant pollen]. Doklady AN SSSR [Reports of the USSR Academy of Sciences], 1940, t. 26, v. 3, pp. 273-276.
[3] King J.R. The peroxidase reaction as an indicator of pollen viability. Stain. Technol., 1960, v. 35, no. 4, pp. 225-227.
[4] Diakonu P. O metode opredeleniya zhiznesposobnostipyl'tsypripomoshchi 2,3,5-trifeniltetrazolkhlorida [On the method of determining the viability of pollen using 2,3,5-triphenyltetrazole chloride]. Tsitologiya i genetika [Cytology and Genetics]. 1968, v. 2, no. 5, pp. 476-477.
[5] Rodriguez-Riano T., Dafni A. A new procedure to asses pollen viability. Sex Plant Reprod, 2000, v. 12, pp. 241-244.
[6] Maurin' A.M., Kaurov I.A. Sravnenie metodov opredeleniya zhiznesposobnosti pyl'tsy drevesnykh porod [Comparison of methods for determining the viability of tree pollen]. Botanicheskiy zhurnal [Botanical J.], 1956, v. 41, no. 1, pp. 81-84.
[7] Kaurov I.A. Kachestvo pyl 'tsy i semyan introdutsirovannykh dal'nevostochnykh drevesnykh porod [Quality of pollen and seeds of introduced Far Eastern tree species]. Botanicheskiy zhurnal [Botanical Journal], 1959, t. 44, no. 8, pp. 1162-1170.
[8] Parfitt D.E., Ganeshan S. Comparison of procedures for estimating viability of Prunus pollen. Hort Science, 1989, v. 24 (2), pp. 354-356.
[9] Bolat I., Pirlak L. An investigation on pollen viability, germination and tube growth in some stone fruits. Turkish J. of Agriculture and Forestry, 1999, v. 23, pp. 383-388.
[10] Petrov A.P., Pogorelov S.V. K metodike okrashivaniya zreloy pyl'tsy gallotsianinom [On the technique of staining mature pollen with gallocyanin]. Botanicheskiy zhurnal [Botanical J.], 1987, t. 72, no. 9, pp. 1269-1270.
[11] Vizintin L., Bohanec B. In vitro manipulation of cucumber (Cucumis sativus L.) pollen and microspores: isolation procedures, viability tests, germination, maturation. Acta Biologica Cracoviensia. Ser. Botanica, 2004, v. 46, pp. 177-183.
[12] Erdogan U. Determination of pollen quality and quantity in mulberry (Morus alba L.). Pak. J. Bot., 2015, v. 47 (1), pp. 275-278.
[13] Mendez N.P., Porquis H.C, Sinamban E.B., Acma F.M. Comparative pollen viability and pollen tube growth of two endemic philippine Etlingera (Zingiberaceae, Alpinioideae). Philippine J. of Systematic Biology, 2017, v. 11 (2), pp. 1-9.
[14] Trenin V.V. Tsitoembriologiya listvennitsy [Cytoembryology of larch]. Leningrad: Nauka, 1986, 88 p.
[15] Kozubov G.M. Lyuminestsentnyy metod izucheniya pyl'tsy rasteniy [Luminescent method for studying plant pollen]. Botanicheskiy zhurnal [Botanical Journal], 1967, t. 52, no. 8, pp. 1156-1157.
[16] Noks R.B. Biologiyapyl'tsy [Biology of pollen]. Moscow: Agropromizdat, 1985, 83 p.
[17] Tosun F., Koyuncu F. Investigations of suitable pollinator for 0900 Ziraat sweet cherry cv.: pollen performance tests, germination tests, germination procedures, in vitro and in vivo pollinations. Hort. Sci. (Prague), 2007, v. 34 (2), pp. 47-53.
[18] Foster G.S., Bridgwater F. Viability tests to evaluate pollen reliability in loblolly pine controlled pollinations. For. Sci., 1979, v. 25, no. 2, pp. 270-274.
[19] Goncharenko G.G., Padutov V.E., Potenko V.V. Rukovodstvopo issledovaniyu khvoynykh vidov metodom elektroforeticheskogo analiza izofermentov [Guide to the study of coniferous species by electrophoretic analysis of isoenzymes]. Gomel: Belarusian Research Institute of Forestry, 1989, 128 p.
[20] Norton J.D. Testing of plum pollen viability with tetrazolium salts. Proc. Amer. Soc. Hort. Sci., 1966, v. 89, pp. 132-134.
[21] Seday U., Uzun A., Yilmaz C., Eti S. Production and quality of pollen in terms of fruit set on some self-pollinated pomegranate cultivars. Bulgarian J. of Agricultural Science, 2013, v. 19 (3), pp. 513-517.
[22] Jyothi K.J., Sunil C.N. Floral phenology and breeding system of Aponogeton appendiculatus V. Bruggen (Aponogetonaceae). The International J. of Plant Reproductive Biology, 2018, v. 10 (2), pp. 161-165. DOI 10.14787/ijprb.2018 10.2
[23] Bayazit S., Çaliçkan O., Imrak B. Comparison of pollen production and quality characteristics of cultivated and wild almond species. Chilean J. of Agricultural Research, 2011, v. 71 (4), pp. 536-541.
[24] Atlagic J., Terzic S., Marjanovic-Jeromela A. Staining and fluorescent microscopy methods for pollen viability determination in sunflower and other plant species. Ind. Crops Products, 2012, v. 35, pp. 88-91. DOI: 10.1016/j.indcrop.2011.06.012
[25] Calic D., Devrnja N., Milojevic J. Pollen morphology and variability of Tulipa hungarica Borb. African J. of Biotechnology, 2012, v. 11 (3), pp. 616-620.
[26] Dutta, S.K., Srivastava M., Chaudhary R. Low temperature storage of mango (Mangifera indica L.) pollen. Scientia Horlticulturae, 2013, v. 161, pp. 193-197.
[27] Kundu M., Dubey A., Srivastav M. Effect of gamma ray irradiation and cryopreservation on pollen stainability, in vitro germination, and fruit set in Citrus. Turk J. Biol., 2014, v. 38, pp. 1-9.
[28] Impe D., Reitz J., Kopnick C. Assessment of pollen viability for wheat. Front. Plant Sci., 2020, v. 10, p. 1588. DOI: 10.3389/fpls.2019.01588
[29] Helpson-Harrison J., Helpson-Harrison Y. Evaluation of pollen viability by enzymatically induced fluorescence; intracellular hydrolysis of fluorescien diacetaten. Stain Technol., 1970, v. 45, pp. 115-120.
[30] Noland T., Mohammed G. Fluorescein diacetate as a viability stain for tree roots and seeds. New Forests, 1997, v. 14, pp. 221-232.
[31] Surso M.V. Otsenka dobrokachestvennosti pyl'tsy khvoynykh vidov metodom okrashivaniya pyl'tsevykh zeren fluorestsein diatsetatom [Assessment of the good quality of pollen of coniferous species by staining pollen grains with fluorescein diacetate]. J. of Agriculture and Environment [J. of Agriculture and Environment], 2022, no. 5 (25), pp. 1-6.
[32] Chrzanowski T.H., Crotty R.D., Hubbard J.G., Welch R.P. Applicability of the fluorescein diacetate method of detecting active bacteria in Freshwater. Microb Ecol., 1984, v. 10, pp. 179-185.
[33] Zink D., Sadoni N., Stelzer E. Visualizing chromatin and chromosomes in living cells. Methods, 2003, v. 29 (1), pp. 42-50. https://doi.org/10.1016/S1046-2023(02)00289-X
[34] Wang X.M., Terasaki P.I., Jr. Rankin C.W., Chia D., Zhong H.P., Hardy S. A new microcellular cytotoxicity test based on calcein AM release / X.M. Wang. Hum Immunol., 1993, v. 37 (4), pp. 264-270. DOI: 10.1016/0198-8859(93)90510-8
[35] Suuronen E.J., McLaughlin C.R., Stys P.K., Nakamura M., Munger R., Griffith M. Functional innervation in tissue engineered models for In vitro study and testing purposes. Toxicological Sciences, 2004, v. 82 (2), pp. 525-533.
DOI: 10.1093/toxsci/kfh270
The work was performed within the framework of the state assignment to the Federal Research Center
for Integrated Arctic Studies of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (State registration No. —122011400384-2).
Author's information
Surso Mikhail Vol'demarovich — Dr. Sci. (Agriculture), Chief Researcher, Federal Center for Integrated
Arctic Research of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, [email protected]
Received 10.04.2023.
Approved after review 22.05.2023.
Accepted for publication 20.12.2023.
