CC BY
80
ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДИАГНОСТИКИ, ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЕЗА Ан.А. Евглевский, Д.А. Евглевский, А.М. Коваленко, В.А. Дёмин
Аннотация. Представлены результаты усовершенствования синтетических питательных сред для выращивания и выделения микобактерий туберкулеза, способа получения и апробации туберкулезного анатоксина, нативного безальбумозного туберкулина и эффективность модифицированных антибиотиков в отношении лекарственно-устойчивым микобактериям туберкулеза при лечении лабораторных животных, больных туберкулезом.
Ключевые слова: туберкулезный анатоксин, вакцина, иммунитет, антибиотики.
Прогресс биотехнологии подразумевает разработку высокоиммуногенных вакцин для предотвращения инфекционных заболеваний. Страны с самым большим спросом на вакцины имеют наименьшие способности оплаты за них или за их производство. Трудности, которые появляются сейчас, не должны помешать изучению возможности иммунизации против особо опасных зоонозов и зооатропонозов. Экономическая поддержка для расширенного исследования, развития и реализации программ иммунизации должна идти из множества источников: правительственных, биологической промышленности, неправительственных фондов и сельскохозяйственных предприятий. Требования к вакцинам будут изменяться в зависимости от распространенности заболевания по различным регионам мира. Благодаря развитию современной биотехнологии, есть надежда, что на наиболее значимые возбудители инфекций будут в конечном счете разработаны эффективные вакцины. Только микобактериальная инфекция (Mycobacterium tuberculosis, M.bovis) продолжает игнорировать попытки создания для предотвращения инфекции новых им-муногенных вакцин (существует единственная вакцина БЦЖ, обладающая незначительными протективными свойствами). Нами разработаны вакцинный противотуберкулезный анатоксин и препарат ПКП-3, обладающие высокими иммуногенными свойствами.
Большинство инфраструктуры и капитала для разработки новой вакцины находится в развитых странах. Хотя первая финансовая поддержка базисных исследований обычно идет от правительственных учреждений и от негосударственных фондов, главное финансирование для последующего проведения исследования продукции и также развития клинических испытаний чаще всего исходит от частных организаций. В результате приоритеты чаще всего отдаются вакцинам, которые предотвращают болезни, наиболее распространенные в развитых странах, где существует финансовый рынок. Пример - быстрое развитие вакцины против заболевания Lyme borreliosis в США. И наоборот, много заболеваний, приводящих к глобальной заболеваемости, чаще всего возникают в развивающихся странах с развивающейся экономикой, низкой производственной базой и скудными рынками для сбыта продуктов. Хотя такие организации, как WHO, EPI, международное эпизоотическое бюро (OEI), Программа Развития Организации Объединенных Наций, Мировой Банк, Фонд Рокфеллера и Rotary International могут вкладывать капитал в определенные программы, типа глобального уничтожения полиомиелита, их ресурсы ограничены, а потребности в вакцинации огромны.
С тех пор, когда Р. Кох открыл возбудителя туберкулеза, ученые все время пытаются изыскать совершенные специфические иммуноактивные препараты для диагностики, терапии и профилактики болезни.
Р. Кох установил, что продукты распада туберкулезных микобактерий очень ядовиты для пораженного
туберкулезом организма. В опытах на морских свинках, а позднее непосредственно на себе Р. Кох описал токсическое действие полученного им туберкулина. Выраженная токсичность препарата явилась одной из причин его неудачного применения для лечения туберкулеза людей. Тем не менее туберкулинотерапия не была отвергнута и до сего времени достаточно широко применяется в медицине. Это обусловлено специфическим иммуностимулирующим действием туберкулина.
Следующим значительным открытием в области фтизиатрии было получение Кальметом и Гереном (1923) вакцины БЦЖ путем длительной аттенуации вирулентного штамма микобактерий туберкулеза бычьего вида. Тем не менее, несмотря на многолетнее применение вакцины БЦЖ в системе мер борьбы с туберкулезом людей, до последнего времени нет четких данных о ее защитном эффекте. По данным ВОЗ (1995) ее эффективность колеблется от 2 до 83%. В ветеринарной медицине ее широкое применение невозможно ввиду аллергизации организма животных к туберкулину.
Обобщая, следует констатировать факт, что вопрос разработки эффективных средств иммунотерапии и иммунопрофилактики туберкулеза в настоящее время остается открытым.
Р. Кох первым заложил основы получения и применения препаратов для диагностики и терапии туберкулеза. С тех пор на открытии Коха базируются все проводимые исследования по проблеме туберкулеза. Тем не менее, вплоть до последнего времени, возможность получения туберкулезного анатоксина для активной терапии и профилактики туберкулеза не изучалась. Причиной этому долгое время служило необоснованное положение о «нестерильном» иммунитете при туберкулезе.
В настоящее время семейство микобактерий состоит из МТ человеческого, бычьего и птичьего видов, атипичных и сапрофитных микроорганизмов. Мико-бактерии туберкулеза практически поражают любую ткань, орган, но преимущественно легкие и лимфатические узлы, а по наличию плотной липидопротеиново-сковой (бронированной) оболочки микобактерии являются наиболее защищенными от лекарственных и внешних воздействий. Это дает им возможность существовать во внутриклеточном состоянии.
В 1982 г. туберкулез объявлен проблемой всемирной опасности и бедствием XXI века, а 24 марта Всемирным днем борьбы с туберкулезом.
Эта дата связана с тем, что 24 марта 1982 г., в Берлине в обществе физиологов Р. Кох сделал доклад «Этиология туберкулеза» об открытии им возбудителя туберкулеза. Завершая доклад, он сказал: «Теперь мы можем бороться с этим бичом человечества». Несмотря на успехи борьбы с туберкулезом, в настоящее время ежегодно умирают более 3 миллионов человек.
Открытие противотуберкулезных препаратов (ПТП) ознаменовало новую эру в истории борьбы с туберкулезом, позволило значительно повысить эффективность лечения этого заболевания. Первые сигналы о неблагополучии появились в конце 60-х годов прошлого века, когда в американских журналах были опубликованы сведения о лекарственной устойчивости мико-бактерий туберкулеза (МБТ). Тогда эта устойчивость не превышала 3,5% и не вызывала большой тревоги. Лишь через 15-20 лет во многих регионах мира стали регистрироваться рост заболеваемости, а более 25% выделенных штаммов МБТ оказались устойчивыми к одному или несколько ПТП.
Последнее десятилетие стало началом третьей волны эпидемии туберкулеза, характеризующейся широким распространением полирезистентных штаммов его возбудителя.
По характеру лекарственной резистентности МБТ могут быть:
- монорезистентные - устойчивые к одному ПТП;
- полирезистентные - к двум и более препаратам;
- множественно лекарственно-резистентные, устойчивые как минимум к сочетанию изониазида и рифами-ницина;
- поливалентно лекарственно-резистентные - ко всем известным основным и резервным ПТП.
Лекарственная устойчивость достигла 50,1% у впервые выявленных и 81,2% - при рецидивах и 90,2% при хронических формах туберкулеза.
В нашем регионе наибольшая частота устойчивости МТ установлена к римпицину (40%), стрептомицину, изониазиду, канамицину.
Общим направлением в получении аллергоидов и анатоксинов является возможность использования формалина, В-пропилактона, глутарового альдегида и т.д. для снижения или полной инактивации аллергенных и токсических свойств аллергенов и токсинов и получения иммунологически активных препаратов с высоким десенсибилизирующим действием.
Одним из вариантов получения антиаллергического аллергоида и соответствующего анатоксина является соединение формальдегида с аминогруппами лизина, тирозина и гистидина в туберкулопротеине.
В последующем по типу получения анатоксина проведена модификация путем детоксикации и полимеризации антибиотиков.
Изучено, что для выращивания микобактерий туберкулеза с целью изготовления туберкулезного аллергена-туберкулина используются синтетические питательные среды вместо мясопектоноглицеринового бульона. С 1967 г. практически в промышленном масштабе используется синтетическая питательная среда Курской биофабрики, разработанная Евглевским Ан.А. в объеме 300-500 тысяч литров в год для выращивания разных видов микобактерий туберкулеза с накоплением бактериальной массы 110-120 гр с 1 литра среды. Это предельно высокое накопление биомассы. В среднем в 1 мг бак-массы содержится 37-40 миллионов микробных клеток.
В последующем были усовершенствованы новые варианты питательной среды с внесением в ее состав 23 г/л янтарной кислоты, фосфорнокислого однозаме-щенного натрия и 2-3 г/л глицина вместо дорогостоящего и дефицитного аспарагина. Это позволило получить нативный безальбумозный туберкулин без концентрации 40% трихлоруксусной кислоты и «очистки» сернокислым аммонием и диализом. При консультативной помощи и участием в апробации Евглевского Ан. А. препарат внедрен в Эстонии, после международного контроля, проведенного в Норвегии, а затем в Казахстане и Узбекистане.
В наших исследованиях безальбумозный туберкулин проявил диагностическую ценность при внутри-кожной, глазной пробах и при внутривенном введении 3-4 мл препарата, а затем с успехом был использован при изготовлении туберкулезного анатоксина путем детоксикации и полимеризации 0,3-0,5% раствором формальдегида, отдельно и в сочетании с этонием и другими бисчетвертичными аммониевыми соединениями.
Следует указать, что синтетическая питательная среда с 2,5% агаром при обработке патматериала-кусочков легких, печени, лимфоузлов 3% раствором лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, а через 20-30 минут 3% раствором янтарной кислоты с последующей нейтрализации суспензии 5-10% аммиаком обеспечивалось подавление роста посторонней
микрофлоры и выделение чистой культуры микобактерий. Предложенный способ исключал обработку суспензии серной кислотой и центрифугирование.
При получении туберкулезного анатоксина первоначально использовали эндотоксин культуральной жидкости Mycobacterium bovis с начальной аллергенной активностью в 50-100 и 200 тысяч туберкулиновых единиц (Т.Е.), инак-тивированных формалином. Опытным путем была определена концентрация формалина, требуемая для инактивации аллергенных свойств конечного продукта. В опытах для инактивации аллергенных, а, следовательно, и токсичных свойств эндотоксина микобактерий туберкулеза требовалось добавление 0,5% раствора формалина из расчета 0,20,3 мл на каждые 50000 ТЕ.
Изучение иммуногенных свойств туберкулезного анатоксина вначале проводили на морских свинках и кроликах.
При контрольных испытаниях на лабораторных животных было установлено, что протективный эффект иммунизации зависит от антигенной активности туберкулезного анатоксина и кратности введения препарата.
Иммунизация туберкулезным анатоксином, с активностью в 200 000 Т.Е./мл 43 морских свинок и 27 кроликов полностью предохраняла их от заражения 0,10,2 мг вирулентной культурой М. bovis. Не наблюдалось развития туберкулезного процесса и при повторном заражении спустя три месяца у девяти морских свинок и шести кроликов при наблюдении в течение следующих трех месяцев.
Таким образом, установлено, что концентрированный вариант туберкулезного анатоксина надежно предохраняет организм лабораторных животных даже при заражении их вирулентной культурой М. bovis в дозе, в среднем десятикратно превышающей дозу, по которой определяют вирулентность микобактерий.
Результаты экспериментальных испытаний туберкулезного анатоксина, полученные на лабораторных животных, послужили основанием для изучения имму-ногенных свойств данного препарата непосредственно на кроликах и крупном рогатом скоте.
При этом установлено, что после 5-6 кратной вакцинации у кроликов произошло образование в сыворотке крови аллергеннейтрализующих и преципити-рующих антител в титре 1:4 - 1:8.
Полевые испытания иммуногенной эффективности туберкулезного анатоксина были проведены в период с 1989 года в одном хозяйстве Курской области, восьми хозяйствах Ростовской области, в ряде хозяйств Украины с охватом более 7 тысяч голов крупного рогатого скота. Следует отметить, что в ряде стад иммунизация животных туберкулезным анатоксином способствовала активизации иммуноаллергического состояния. Это проявлялось в вираже туберкулиновой чувствительности у инфицированных возбудителем туберкулеза животных. В то же время, что на наш взгляд очень важно, как с эпизоотологической, так и с эпидемиологической точек зрения, при увеличении в первые 2-3 месяца после прививки количества реагирующих на туберкулин животных, мы ни в одном случае не наблюдали у них обострения туберкулезного процесса. Наоборот, состояние инфицированности сменялось полной элиминацией микобактерий, что подтверждалось отсутствием ПЧЗТ на туберкулин у ранее реагировавших животных, за исключением особей, имевших деструктивные поражения задолго до их иммунизации туберкулезным анатоксином.
Учитывая, что 0,3-0,5% растворы формальдегида не обеспечивают полноту детоксикации и дезаллергизации туберкулезных эндотоксино-аллергенов при исследовании на сенсибилизируемых морских свинках суспензией и автоклавированных микобактерии туберкулеза
были проведены исследования по изысканию более эффективных детоксикаторов и дезаллергизаторов.
Исследованиями установлено, что полноту дезал-лертизации обеспечивает 0,3-0,5% раствор формальдегида с 0,2-0,3% этония или Биопата-Д, а в последующем 0,3-0,4% глутаровым альдегидом с 0,3-0,4% алкилдиметил-бензина аммония или с 0,2-0,3% раствором этония.
Наряду с получением туберкулезного анатоксина из молекулярных, растворимых эндокосино-аллергенов были с успехом проведены опыты по изучению иммуногенных и протективных свойств противотуберкулезного молекуляр-но-субъединичного препарата ПКП-3 на крупном рогатом скоте. Препарат представляет собой набор интро- и экстра-целлюлярных белков из культурального фильтра (Cultural filtrate protein CEP), цельноклеточных единиц ми-кобактерий туберкулеза, помещенных в адъювант.
Аллергическими исследованиями установлено, что через месяц после иммунизации в обеих опытных группах (n=68 и n=28) реагировали все животные, а уже через 45 дней в первой реагировало 51%, второй -100%, контрольной - 55% животных. Через три месяца после иммунизации в первой группе реагировало 29% крупного рогатого скота. Через 3,5 месяца после иммунизации реагировало на туберкулин в первой группе 7% особей, а через 7 мес. = 4%. По всей видимости аллергические реакции возникли через 1,5 3, 3,5 и 7 месяцев в ответ на действие существующего в стаде возбудителя туберкулеза и исчезли в дальнейшем по причине элиминации его из макроорганизма в связи с высокой иммунологической защищенностью привитых животных.
Определяемые биохимические показатели общего белка, циркулирующие иммунных комплексов, серому-коидов, диеновых коньюгатов, малонового диальдегида больных и контрольных животных не отличались существенно от таковых у здоровых животных через три месяца после начала опыта.
Полученные данные дают основание сделать соответствующие выводы:
- выявление аллергической реакции на ППД туберкулин у иммунизированных животных в течение 3-4 месяцев свидетельствует о присутствии антигенной атаки на микроорганизм со стороны возбудителя туберкулеза (больные животные), а дальнейшее исчезновение реакций свидетельствует об элиминации возбудителя и высокой напряженности противотуберкулезного иммунитета;
- двукратное с интервалом 14 дней введение препарата ПКП-З в предлагаемых крупному рогатому скоту
обеспечивает надежную защиту восприимчивых животных спонтанно зараженных возбудителем бычьего вида.
Заключительный этап исследований был направлен на повышение биоцидного и лечебного действия стрептомицина и канамицина в отношении стрептомицино-и канамициноустойчивым МТ бычьего и человеческого видов путем детоксикации и полимеризации вначале 0,1-0,2% формальдегида или 0,1-0,2% глутарового альдегида отдельно и в сочетании с 0,1% этонием или ал-кидиметилбензиламмонием.
Проведенные исследования позволили определить, что детоксикация и полимеризация 1 г стрептомицина и канамицина 0,1% раствором формальдегида или 0,1% раствором глутарового альдегида в объеме 3-5 мл при 40,0±2,0°С, в течение 0,1% раствором этония и алкил-диметилбензиламмония повышает бактерицидные свойства на 40-50% в отношении стрептомицино- и канамициноустойчивым микобактериям туберкулеза человеческого и бычьего видов.
Подкожное ежедневное введение модифицированного формольной детоксикацией и полимеризацией или 0,1% раствором глутарового альдегида с 0,1% раствором этония и алкилдиметилбензиламмония стрептомицина и канаменицина (100 мг) в течение 22 суток купируют гнойнокавернозные поражения в печени, селезенке и легких у морских свинок, после заражения 0,11,0 мг микобактерий туберкулеза человеческого вида вместо нормативных 0,01-0,001 мг в течение 90 суток (срок наблюдения).
Полученные результаты свидетельствуют о достоверном повышении эффективности диагностических и лечебно-профилактических средств при туберкулезе животных и человека.
Информация об авторах
Евглевский Анатолий Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».
Евглевский Дмитрий Анатольевич, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник Курского НИИ АПП Россель-хозакадемии, тел. (4712) 53-77-05.
Коваленко Анатолий Михайлович, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА».
Дёмин Владимир Александрович, кандидат ветеринарных наук, заместитель начальника управления ветеринарии.
