CC BY
25
thalmopathy.
УДК: 615.451.1+576.851.252+615.015.8 Юрчишин О. I., Куцик Р.В.
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ВПЛИВУ СИНЕРГ1ЧНИХ КОМБ1НАЦ1Й ЕРИТРОМ1ЦИНУ I ЕКСТРАКТ1В Л1КАРСЬКИХ РОСЛИН ФЛОРИ ПРИКАРПАТТЯ НА ДИНАМ1КУ РОСТУ КУЛЬТУРИ STAPHYLOCOCCUS AUREUS З 1НДУЦИБЕЛЬНИМ ФЕНОТИПОМ РЕЗИСТЕНТНОСТ1 ДО МАКРОЛ1Д1В
lвано-Франкiвський нацiональний медичний уыверситет
Одним з проритетних шлях'т боротьби з антиботикорезистентнютю е пошук речовин, що здат-hí долати набуту мiкроорганiзмами стшк'ють до антиб'отик'т та потен^ювати Ух дю. З кожним роком зростае iнтерес до терапевтичного потен^алу активних компонентie фiтопрепаратiв в якостi модиф/'катор/'в антибiотикорезистентностi. Особливе практичне значення мае вияснення можливостi подолання резистентностi стаф'токок'т до макрол'д'т, що е препаратами вибору при лкуванн багатьох нфекцй. Мета: вивчити вплив комбiнацiй еритромiцину i екстракт'т лкарських рослин у суббактеростатичних концентра^ях на динамку росту культури S. aureus з '¡ндуцибель-ним механзмом резистентностi до макрол'д'т, а також досл'дити вплив екстракту плод'т вльхи с'ро)' Alnus incana L. на постантиботичний ефект еритромiцину. Матерiали та методи. В якостi тест-культури використано шю'рний iзолят S. aureus з iндуцибельним фенотипом резистентнос-т.i до макрол'д'т, л'ткозам'д'т та стрептограмну В. дентифкацю фенотипу резистентностi до тест-штаму визначали дискодифузшним методом. Для проведення вивчення впливу бiологiчно активних речовин рослинного походження на динамку росту культур стафлокока використано 6 ек-стракт'т л.^рсьшх рослин на 90% водному етанол'г. екстракт плод'т вльхи с'ро)' Alnus incana L., бруньок берези Betula verrucosa L., листк'т мучниц звичайно)' Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., ко-реневищ геранi лугово)' Geranium pratense L., кореневищ родовика лiкарського Sanguisorba officinalis L. та листюв тамари^у галузистого Tamarix ramosissima Ledeb., а також препарат «Альтан». З метою уточнення даних щодо синергiчного потен^алу комбiнацiй рослинних екстракт'т та ерит-ром.^ну, використано метод криво) «<час - бактерицидний ефект» (time kill curves). Вивчення пос-тантиботичного ефекту еритромiцину та вплив на нього екстракту плод'т вльхи с'ро)' Alnus incana L. проведено за методом Craig W.A., Gudmundsson S. Результати. Комб'наци суббактерос-татичних концентра^й еритромiцину з екстрактами плод'т вльхи с'ро)' Alnus incana L. (i препаратом «<Альтан»), кореневищ геранi лугово)' Geranium pratense L., листк'т мучниц звичайно)' Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., бруньок берези бородавчасто) Betula verrucosa L. в/'дносно дослi-джуваного штаму S. aureus проявили синергiчну взаемодю, виразно зменшуючи к'тьк'ють житте-здатних мкробних клтин в культур'!. При цьому синергiчнi комб'тацИ еритромiцину з екстрактами плод 'т вльхи i кореневищ геранi досягнули бактерицидного ефекту. Анал'з криво)' «<час - бактерицидний ефект» продемонстрував ¡'ндиферентнють комб'тацИ еритромiцину з екстрактом листк'т тамари^у галузистого Tamarix ramosissima Ledeb. та кореневищ родовика лкарського Sanguisorba officinalis L. в'дносно досл'джуваного штаму. Постантиботичний ефект еритромiцину в'дносно до-сл'джуваного штаму становить 0,5 год. В присутност'1 екстракту плод'т вльхи с'ро)' Alnus incana L. спостергали збльшення тривалост'1 постантиботичного ефекту еритромiцину до 3,1 год. Ви-сновки. Екстракти плод'т вльхи с'ро)' Alnus incana L., кореневищ геранi лугово)' Geranium pratense L., листя мучниц звичайно)' Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. та бруньок берези бородавчасто)' Betula verrucosa L. посилюють протимiкробну дю макрол'д'т (еритромiцину) в'дносно стаф'токок'т з '¡нду-цибельним фенотипом резистентностi до макрол'д 'т, л'ткозам'д 'т та стрептограмну В.
Ключов1 слова: Staphylococcus aureus, рослины екстракти, еритромщин, антибютикорезистентнють, синерпзм протим1кробноТ дм. Дослiдження виконуеться в рамках комплексно)' науково-дослiдно)' роботи вано-Франюеського нацонального медичного унi-верситету «Вивчення 6!олов!чно)' актиеностi природних i синтетичних гетероциклiчних сполук, що мстять пiридиноеий, iмiдазольний цикли та комплекси з бiометалами» (номер державно)'реестрацп 0103U004919, 2012-2017 рр.)
Вступ
Одним з прюритетних шляхiв боротьби з антибютикорезистентнютю е пошук речовин, що здатн долати набуту мiкроорганiзмами стшкють до антибютиш та потенцшвати Тх дю зокрема нейтралiзу-вати антибiотик-iнактивуючi ферменти [21] та блокувати активне виведення (ефлюкс) антибютика з мн кробноТ кл^ини [13,17]. З кожним роком зростае штерес до терапевтичного потен^алу активних компонент фтопрепара^в в якост модифiкаторiв антибютикорезистентносп та MLS-резистентносп (ма-кролщи, лшкозамщи стрептограмши) [5,6]. Ряд активних компоненпв рослинних екстрактв проявляють еритромщинпотенцшючою активнютю вщносно MLS-резистентних штамiв стафтокош, так 23-метил-6-0-дисметиллаурщетрон (видтений з Achyrocline satureioides (Lam.) DC.), дюсметин (видтений з цитрусових), шдол-3-карбшол (присутнш у екстрактах хрестоцв^их рослин), карвакрол (видтений з
ефiрних олш материнки Origanum vulgare L. i чебрецю Thymus vulgarís L.) [8,15,18,19].
Ацетоновий та хлороформний екстракти листш анiлу Indigofera suffruticosa Mill. проявляв синер-ri3M протимiкробно''' дм з еритромщином вiдносно як резистентних, так i чутливих до макрол^фв штамiв S. aureus, a етанольний екстракт портулаку городнього Portulaca oleracea L. володie властивостями ш-гiбiтора ефлюксно''' помпи MsrA [9, 23].
Рашше нами виконано скринiнгове дослiдження екстрак^в лiкарських рослин флори Укра'ни на здатнють вiдновлювати чутливiсть до макрол^фв стафiлококiв з iндуцибельним i конститутивним ме-ханiзмами резистентностi до макрол^фв [3].
Особливе практичне значення мае вияснення можливост подолання MLS-резистентностi стафто-кокiв з iндуцибельним механiзмом, який детермшуеться посттранскрипцiйною модифiкацiею рибосо-мально' 23s-рРНК за рахунок дм ферменту метилтрансферази, що е продуктом гешв родини erm та зумовлюе високий рiвень резистентностi до макролiдiв [22]. За нашими даними, ним володiе 4% шмр-них iзолятiв S. aureus i 56% штамiв S. epidermidis. ^м того, ще 16% iзолятiв S. aureus i 5% штамiв S. epidermidis володiють повною резистентнiстю до макролiдiв i лшкозам^фв, в основi яко' лежить голов-ним чином також рибосомальний мехаызм [2]. З цих мiркувань вибраний нами напрямок дослщжень е актуальним, осктьки макролiди належать до препара^в вибору для лiкування пiодермiй [20].
Мета дослщження
Вивчити вплив комбшацш еритромiцину i екстрактiв лiкарських рослин у суббактерюстатичних кон-центрацiях на динамку росту культури S. aureus з шдуцибельним мехаызмом MLS-резистентностi, а також дослщити вплив екстракту плодiв вiльхи ароТ Alnus incana L. на постантибютичний ефект еритромщину.
Матерiали та методи дослiдження
В якост тест-культури використано шкiрний iзолят S. aureus з iндуцибельним фенотипом MLS-резистентностi (резистентний до еритромщину з iндукцiею на клiндамiцин) (МБсК (мiнiмальна бактерн остатична концентрацiя) - 1000 мкг/мл, МБцК (м^мальна бактерицидна концентра^я) - 2000 мкг/мл), який щентифковано за комплексом культуральних та бiохiмiчних властивостей з використанням тест-системи «STAPHYtest 16» (Lachema, Чехiя).
lдентифiкацiю фенотипу MLS-резистентнi у тест-штаму визначали дискодифузiйним методом на середовищi Мюллера-Хiнтона вiдповiдно до рекомендацiй NCCLS (Нацюнальний комiтет кпшко-лабораторних стандарт США, 2008) на основi результат тестування вiдносно шести антибiотикiв: еритромщину (ЕРИ, 15 мкг/диск), кларитромщину (КТМ, 15 мкг/диск), рокситромщину (РКМ, 30 мкг/диск), страмщину (SR, 30 мкг/диск), лшкомщину (ЛН, 15 мкг/диск) та клшдамщину (CLI, 2 мкг/диск). Для диферен^ацп конститутивного та iндуцибельного тишв MLS-резистентностi використовували дводисковий (еритромiцин - клшдамщин) та модифiкований тридисковий (еритромщин - клiндамiцин -джозамiцин) методи [16]. МПК (м^мальну пригнiчуючу концентрацш) еритромiцину та рослинних екс-трак^в для дослiджуваних штамiв стафiлококiв вивчали мiкрометодом двократних серiйних розведень в бульйон через 24 години шкубацп.
Для проведення дослiдження використано 6 екстрактiв лiкарських рослин на 90% водному етанолi (табл 1), а також препарат «Альтан» (Борщагiвський ХФЗ, м. Ки'в, Укра'на), що мютить комплекс ела-готанiнiв iз плодiв вiльхи клейко' Alnus glutinosa (L.) Gaertn. та втьхи ароТ Alnus incana (L.) Moench. Вивчення впливу рослинних екстрактiв на динамiку росту культур стафтокока проводили на рщкому поживному середовищi (в перiодичних культурах). 1з добово' культури тест-штаму за оптичним стандартом мутност готували суспензш, якою засiвали м'ясо-пептонний бульйон (МПБ) (кшцева концент-рацiя мiкроорганiзмiв 105 кУо/мл). Засiяний бульйон розливали в бактерюлопчы пробiрки по 5 мл. У дослщы пробiрки вносили по 250 мкл дослщжуваних екстрак^в та еритромiцину у сумiшi ета-нол/DMSO (диметилсульфоксид) (1:1) в кшцевих концентрацiях j МПК (мiнiмальна пригшчуюча конце-нтрацiя) (для еритромiцину 250 мкг/мл, для рослинних екстрак^в - див. табл. 1). В контроль^ пробiрки вносили аналогiчнi кiлькостi етанолу i DMSO. Другим контролем служили пробiрки з j МПК екстракту або еритромщину. Пробiрки з мiкробними культурами iнкубували при температурi 37°С впродовж 36 годин при постшному помiшуваннi на шейкерi. Перед шкубацш, а також на 4-й, 8-й, 12-й, 24-й та 36-й годинах культивування проводили забiр алквот в об'емi 200 мкл. Для пщрахунку числа живих мiкроб-них кл^ин робили ряд послiдовних десятикратних розведень кожно' алiквоти з наступним виавом на м'ясо-пептонний агар (МПА) та пщрахунком колонiй, що виросли. Чашки шкубували при температурi 37°С впродовж 24 год. Повторний пщрахунок колонш проводили пiсля додатково' шкубацп впродовж 24 год. при юмнатнш температурь На основi одержаних даних будували кривi динамiки росту дослн джуваних культур [10,14,15].
Таблиця 1
Значення МПК еритромцину та рослинних eKcmpaKmie eidHOCHO тест-штаму S. aureus з iндуцибельним фенотипом MLS-резистентностi
МПК
Дослщжуваш препарати
Розведення рослинних | мкг/мл
екстракт |
EpiiTpoM^MH 1000
EKCTpaKT n^OfliB BmbXM Alnus incana L. 1:80 162,5*
EKCTpaKT 6pyHbOK 6epe3M Betula verrucosa L. 1/160 281,25
EKCTpaKT ™ctkíb MyMHi^i 3BHMaHHOi Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. 1/40 575*
EKCTpaKT KopeHeBH^ repaHi ^yroBoi Geranium pratense L. 1/40 650*
EKCTpaKT KopeHeBH^ poflOBHKa ^iKapcbKoro Sanguisorba officinalis L. 1/40 600*
EKCTpaKT ™ctk¡b TaMapiiKcy ra^y3HCToro Tamarix ramosissima Ledeb. 1/10 1700*
Прим1тка: * - в перерахунку на твердий залишок екстрагованих речовин.
Для штерпретаци' кривих росту вираховували зменшення або збтьшення lg КУО/мл (колоше утво-рююча одиниця) вщносно початкового рiвня мiкробного навантаження. При зменшенш кiлькостi коло-нiй, що виросли при аналiзi алiквот (по вщношенню до початкового рiвня мiкробного навантаження) до 3 lg КУО/мл констатували бактерюстатичний ефект. При зменшенш кшькосп колонiй, що виросли при аналiзi алiквоти (по вiдношенню до початкового рiвня мiкробного навантаження) бтьш нiж на 3 lg
КУО/мл - бактерицидний ефект;
Ефективнiсть комбшацш екстракту та еритромiцину (синергiчний потен^ал) оцiнювали як зменшення або збтьшення кшькосп живих мiкробних кттин (Д1д КУО/мл) пiд впливом комбшаци' в порiв-няннi з впливом кожного препарату окремо. Результати оцшювали за формулою:
Д1д КУО/мл= lg КУО/мл (Екстракт + ERY) - lg КУО/мл (ERY)
Якщо кшькють життездатних мiкробних клiтин зменшувалася на > 2 lg КУО/мл (Д1д КУО/мл < -2), взаемодiю вважали синерпчною. При збiльшеннi кiлькостi життездатних мiкробних клiтин на > 2 lg КУО/мл (Д^ КУО/мл > 2) вважали, що препарати проявляли антагошзм. При значеннях -2 < Дlg КУО/мл < 2 робили висновок про шдиферентнють взаемоди' [1].
Вивчення постантибютичного ефекту (ПАЕ) еритромщину та впливу на нього суббактерюстатичних концентрацiй екстракту плодiв вiльхи аро'Г Alnus incana L. проводили на рщкому поживному середо-вищi (в перюдичних культурах). 1з 12-ти годинно'Г культури тест-штамiв за оптичним стандартом мут-ностi готували суспензiю, якою засiвали МПБ (кiнцева концентрацiя мiкроорганiзмiв становила 106 КУО/мл). Засiяний бульйон розливали в бактерюлопчш пробiрки по 1 мл. У дослщш пробiрки вносили по 100 мкл дослщжуваного екстракту у сумiшi етанол / DMSO (1:1) в кiнцевих концентра^ях 1/4, 1/8 та 1/32 МПК та еритромщин (в кiнцевiй концентраци' 1МПК). Контрольними служили пробiрки ттьки з ери-тромiцином та мiкробною культурою. Експозицiю з антибiотиком здшснювали в iнкубаторi MIR-162 (SANYO Electric Biomédical Co. Ltd., Japan) при температурi 37°С впродовж 1 год. при постшному пе-ремiшуваннi на шейкерк З метою припинення дм антибiотика зразки розводили 1:1000 стерильним бу-льйоном, пiсля чого здшснювали Тх культивування при температурi 37°С впродовж 10 год. при постшному перемшуванш на шейкерi. Забiр алiквот в об'емi 200 мкл проводили вщразу пiсля припинення експозицп мiкроорганiзмiв з дослiджуваними препаратами (перед початком шкубацп культур), а також через кожну годину культивування. Для пщрахунку числа живих мiкробних кл^ин робили ряд послщо-вних десятикратних розведень кожно'1 алiквоти з наступним виавом на МПА та пщрахунком колонiй, що виросли. Чашки шкубували при температурi 37°С впродовж 24 год [4,7,12].
ПАЕ вираховували за наступною формулою: ПАЕ = Т - С,
де: Т - час необхщний для наростання числа мiкробних кттин в дослiднiй культурi на 1 lg КУО/мл порiвняно з початковим рiвнем (0 годин);
С - час необхщний для наростання числа мiкробних кл^ин в контрольнш культурi на 1 lg КУО / мл порiвняно з початковим рiвнем (0 годин).
Для статистично'Г обробки результатiв використовували одно- i двофакторний дисперсiйний аналiз (ANOVA), комп'ютерну програму Microsoft Office Excel 2011.
Результати та обговорення
У попереднш робот [3] скриншговим методом spot-бiоаутографiï нами було продемонстровано, що водно-етанольш екстракти цшого ряду лiкарських рослин флори Укра'ши володiють здатнiстю пщви-щувати чутливють до макролiдiв шкiрних штамiв стафтокош з iндуцибельним i конститутивним меха-нiзмами MLS-резистентностi. На основi одержаних результат окремi активнi екстракти були в^браш для подальших дослiджень. При цьому нами вперше було описано здатнють рослинних екстрактiв знижувати резистентнють до еритромiцину штамiв S. aureus i S. epidermidis з шдуцибельною та пов-ною MLS-резистентнiстю, в основi яких лежить рибосомальний мехашзм. Модифiкацiя рибосомально'1 мiшенi зумовлюе високий рiвень резистентностi стафiлококiв до макрол^в [16].
Методом «титрувально'Г панелЬ ^heckerboard titration) було пiдтверджено синергiчну взаемодш з
еритромiцином екстрактв плодiв вiльхи ciро1 Alnus incana L., кореневищ гераш лугово!' Geranium pratense L. (для 100% штамiв з шдуцибельною та повною MLS-резистентнютю; cереднe значення FICI 0,028 - 0,057; p<0,001). В приcyтноcтi 1/4 MБcK ЕРИ cпоcтерiгалоcя 32-64-кратне зниження протимк-робних концентрацiй екстракту плодiв вiльхи ci ро1 та 64-256-кратне зниження MБcK екcтрактy кореневищ гераш лугово!. Екcтракти бруньок берези бородавчасто! Betula verrucosa L. передне значення FICI 0,473±0,20), листов мyчницi звичайно! Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. передне значення FICI 0,143±0,18) та тамарикcy галyзиcтого Tamarix ramosissima Ledeb. передне значення FICI 0,189±0,29) показали cинергiчнy взаeмодiю з еритромщином вiдноcно 71,4-85,7% штамiв. Екcтракт кореневищ родовика лкар^кого Sanguisorba officinalis L. продемонстрував вiдcyтнicть взаeмодiï з ЕРИ вщноздо 42,8% штамiв. Вщноздо 28,6% штамiв зареecтровано адитивний i вщноздо ще 28,6% - ^нерпчний ефект (cереднe значення FICI 0,812±0,52).
З метою уточнення даних щодо инертного потенцiалy комбiнацiй роcлинних екстрактв, антибю-тикопотенцiюючi влаcтивоcтi яких були пiдтвердженi y попереднiх доcлiдженнях, та еритромщину нами викориcтано метод криво!' <^c - бактерицидний ефект» (time kill curves). Даний метод е бтьш об'ективним, тому що вщображае кiлькicнi показники взаeмодiï активних компонент та, на вiдмiнy вщ iнших методiв, дозволяе оцiнити бактерицидну антимiкробнy дiю комбiнацiй роcлинних екстрактв та антибiотика [1]. Оцiнка бактерицидно! дм е найбiльш важливою з точки зору кореляцiï антимiкробного ефекту. Про ефективнють комбiнацiй екcтрактy та еритромщину ^инерпчний потенцiал) cyдили на пн дcтавi зменшення або збтьшення кiлькоcтi живих мiкробних клiтин пщ впливом комбiнацiï в порiвняннi з впливом кожного препарату окремо.
Аналiз кривих росту контрольних культур показав, що характер росту тест-штаму в приcyтноcтi j MnK еритромiцинy е аналопчним роcтy культури без антибютика. Екстракти плодiв вiльхи ci ро1 Alnus incana L., кореневищ гераш лугово!' Geranium pratense L. та листя мучниц звичайно! Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. в концентра^ях j MnK значно подовжили тривалють латентно! (до 8-12 год.) i ло-гарифмiчно!' (до 24 год.) фаз росту мiкробноï культури (риc.1 А-С).
Kомбiнацiï cyббактерiоcтатичних концентрацiй еритромiцинy з екстрактами плодiв вiльхи аро! Alnus incana L. (i препаратом «Альтан»), кореневищ гераш лугово! Geranium pratense L., листов мучниц звичайно! Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., бруньок берези бородавчасто! Betula verrucosa L. вщно-^о доcлiджyваного штаму S. aureus проявили ^нерпчну взаeмодiю, виразно зменшуючи кiлькicть
життездатних мiкробних клiтин в кyльтyрi (Дlg KyO/мл << -2) (p<0,01). При цьому cинергiчнi комбшаци еритромiцинy з екcтрактами плодiв втьхи i кореневищ геранi дозволили доcягнyти виразного бактерицидного ефекту (риа 1А-В): через 24-36 год. шкубацп в культурах було виявлено лише поодинок життeздатнi бактерiальнi клiтини (на рiвнi 1 lg KyO/мл) (p<0,001). Kомбiнацiя cyббактерiоcтатичних концентрацiй еритромiцинy з екстрактом лиcткiв мyчницi забезпечила стшкий бактерiоcтатичний ефект (риc. 1С) впродовж у^ого перiодy cпоcтереження за мiкробними культурами (36 год.) (p<0,01). Поеднання еритромщину з екстрактом бруньок берези ютотно зменшили чиcло життездатних мiкроб-них клiтин в кyльтyрi (до 2-3 lg KyO/мл) впродовж перших 12 год. шкубацп. Через 24-36 год. рют культури вiдновивcя, але за cвоeю iнтенcивнicтю вш значно вiдcтавав вiд роcтy контрольних культур (qlg
KyO/мл = -5) (p<0,01).
A)
Eî Í àSî ëû ERY
ÁéñáSáéá ERY+ÂêriààSêô
l0 20 30
xáñ (aî ä.)
40
B)
l0 20 30 40 xáñ (aîâ.)
С)
<ш M
l4 l2 l0 8 6 4 2 0
D)
l0 20 30 40
xáñ (aî ä.)
l0 20 30 40 xáñ (aî ä.)
0
0
0
0
Рис. 1. Kpuei росту культури S. aureus з iндуцибельним фенотипом MLS-pe3ucmeHmHocmi в npucymHocmi cy66aKmepiocmamu-4Hux концентрацй (j МПК) еритромцину, рослинниx екстра^в, та ïx синергiчниx комбтацш: А) екстракт плодiв вiльxи аро'( Alnus incana L.; В) екстракт кореневищ геранi луговоТ Geranium pratense L.; С) екстракт листов мучниц звичайно)' Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.; D) екстракт бруньок берези бородавчастоТ Betula verrucosa L.
Два рослинн екстракти, як були вибран нами для подальших дослщжень як перспективы на осно-вi даних якюного скриншгового тестування, покладених на них надш не виправдали. Eкстракт листов тамари^у галузистого Tamarix ramosissima Ledeb., хоч i проявив виразну синерпчну взаемодш з ери-тромщином вщносно даного штаму S. aureus при дослщжены методом «титрувально'1 панелЬ (зна-чення FICI комбiнацiï 0,012), у xодi спостереження за ростом перюдичноГ культури показав значно пр-шi результати, нiж очiкувалося. Аналiз криво1 «час - бактерицидний ефект» продемонстрував шдиферентнють дано1 комбiнацiï вщносно дослщжуваного штаму (-2 < Д^ КУО/мл < 2) (рис. 2А). Не пщтвер-дилося припущення про протимiкробну ефективнiсть комбiнацiï еритромiцину з екстрактом кореневищ родовика лкарського Sanguisorba officinalis L. (рис. 2В). Ця комбша^я при дослiдженнi методом «тит-рувальноï панелЬ показала сумарний (адитивний) ефект (значення FICI вiдносно даного тест-штаму 0,5).
Рис.2. Кривi росту культури S. aureus з iндуцuбельнuм фенотипом MLS-резистентност'1 в присутност'1 iндuферентнuх ком-бтац/й еритромцину з екстрактом листов тамарикоу галузистого Tamarix ramosissima Ledeb. (А) i екстракту кореневищ
родовика лкарського Sanguisorba officinalis L. (В).
Важливим показником, який характеризуе фармакокшетичш аотекти протимiкробноï дм препаратв, а також з вилкою чутливютю дозволяе оцшити зднерпзм Тх комбiнацiй, е постантибютичний ефект (ПАЕ). ПАЕ -це явище тривалого пригшчення роcтy бактерш пicля короткого впливу на них антимiкро-бного препарату. Хоча точн механiзми, що викликають пАе, невщом^ було запропоновано ряд гiпотез для його поя^ення: перcиcтенцiя препарату в ^йтах його дм y мiкробнiй клiтинi, повiльне вщновлен-ня бактерiальноï клiтини вiд нелетального ушкодження, чаc затримки cинтезy нових бiлкiв та/або фе-рментiв. lcтотний вплив на ПАЕ може зд^нювати активний ефлю^ препарату з клiтини, який вщбу-ваeтьcя за рахунок мембранних тран^ортних cиcтем. Наявнicть або вiдcyтнicть ПАЕ мае велике кпшь чне значення при дозуванн антимiкробних препаратiв. Якщо ПАЕ антибютика дуже короткий, то його концентра^я в cироватцi кровi та тканинах швидко впаде нижче MnK, i почнетьcя iнтенcивний рют збудника [11].
Нами вивчено вплив екстракту плодiв вiльхи ciро1 Alnus incana L. на постантибютичний ефект (ПАЕ) еритромщину. Вщомо, що ПАЕ еритромщину y стафтокош, чутливих до макрол^в, cтановить в cередньомy 4-6 годин [11]. Результати проведеного нами до^дження показують, що ПАЕ еритром^ цину вiдноcно штаму S. aureus з шдуцибельним фенотипом MLS-резиcтентноcтi cтановить 0,5 год (риc. 3В). В приcyтноcтi екcтрактy плодiв втьхи ciро1 Alnus incana L. ^остер^ли збiльшення тривало-cтi ПАЕ еритромщину: при 1/4 MnK екстракту - до 2,8 год., при 1/8 MnK - до 3,1 год. та при 1/32 MnK - до 2,7 год. Це може мати важливе кл^чне значення з точки зору подовження протимiкробноï дм антибю-тика в органiзмi пicля падiння його концентрацiï нижче порогу MnK (риа 3А).
В)
о -I-1-1-<—I—--
0 12 3 4
Час (год.)
Рис. 3. Постантиб1отичний ефект еритром1цину та його комб1нац1й з екстрактом вльхи cipöiу суббактер1остатичних концентрац1ях в!дносно S. aureus з ¡ндуцибельним фенотипом MLS-резистентностi (А). Розрахунок ПАЕ для еритромцину
(В).
Цкаво, що збтьшення тривалосп ПАЕ еритромщину пщ впливом даного екстракту ютотно не залежало вщ його концентрацГТ та однаково проявлялося в ycix трьох тестованих розведеннях. Рашше нами було помiчено, що у штамiв S. aureus з високим рiвнем MLS-резистентносп спостерГгаеться не-значне (2-8 кратне) зниження МПК еритромщину в присутност 0,5 мкМ/мл арсенату натрiю - вщомого iнгiбiтора АтФ-залежних мембранних помп, до яких належить ефлюксна помпа макролГфв MsrA. Отже такi штами S. aureus володшть подвiйним механiзмом резистентност до макролiдiв. На фонi функцю-нування високоефективного ензиматичного рибосомального мехашзму резистентностi мембранна ефлюксна помпа уже не мае ютотного клiнiчного значення (осктьки надзвичайно високих значень МПК абсолютно нереально досягнути в умовах оргашзму). Але в нашому дослщженш можна вислови-ти припущення, що активы компоненти екстракту плодiв втьхи ароТ Alnus incana L. через блокування ефлюксноТ помпи можуть сповтьнювати активне виведення антибiотика з бактерГальноТ клiтини. Це може бути одним iз пояснень виявленого збiльшення тривалосп ПАЕ еритромiцину вiдносно дослн джуваного штаму S. aureus з шдуцибельним фенотипом MLS-резистентностi.
Крiм того, факт вираженого зниження резистентносп до макролгфв iндуцибельного типу з одночас-ним ютотним подовженням ПАЕ пiд впливом екстракту плодiв вiльхи сiроТ Alnus incana L. може вказу-вати на здатнють його компонент викликати стiйке i незворотне блокування активносп аденiн-N -метилтрансферази (вщповщальноТ за посттранскрипцiйну модифiкацiю рибосомальноТ 23S^PHK) або пригнiчувати експресiю хромосомних геыв родини erm (А-С).
Висновки:
1. Екстракти плодiв вiльхи ароТ Alnus incana L., кореневищ геран луговоТ Geranium pratense L., лис-тя мучницi звичайноТ Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. та бруньок берези бородавчастоТ Betula verrucosa L. посилюють протимiкробну дiю макролiдiв (еритромiцину) вщносно стафiлококiв з шдуци-бельним фенотипом MLS-резистентностi.
2. Одержанi данi експериментально обфунтовують принципову можливiсть поеднання макролГфв з рослинними екстрактами у кшшчнш практицi з метою покращення результат лiкування стафтококо-вих iнфекцiй.
3. Подовження ПАЕ еритромщину пщ впливом БАР екстракту плодiв вiльхи ароТ Alnus incana L. мае важливе кл^чне значення з точки зору фармакокшетики протимГкробноТ дiТ антибiотика в оргашз-мi.
Лiтература
1. Дяченко В.Ф. ПорГвняльна характеристика методу «шаховоТ дошки» та методу «час-бактерицидний ефект» в оцшц ефективностi протимк-робноТ дм комбiнацiй антибiотикiв на полiрезистентнi штами синьогншноТ палички. / В.Ф. Дяченко, Ю.А. Ягнюк, Н.1. Городницька [та ш.] // Annals of Mechnikov Institute. - 2012. - Vol. 4. - P. 162-164.
2. Юрчишин О.1. Фенотипи MLS-резистентностi шкГрних ГзолятГв стафiлококiв - збудниюв шодермш / О.1. Юрчишин // Прикарпатський вГсник НТШ «Пульс». - 2014. - № 28. - С. 16-23.
3. Юрчишин О.1. Вивчення протимГкробних i антибiотикопотенцiюючих властивостей спиртових рослинних екстрактiв вщносно шюрних ГзолятГв стафiлококiв - збудниюв пГодермГй з рГзними механГзмами MLS-резистентностГ / О.1. Юрчишин, Л.М. Куровець, Г.В. Руско // Biomedical and Biosocial anthropology. - 2016. - № 26. - С. 52-57.
4. Aeschilimann J.R. Effects of NorA inhibitors on in vitro antimicrobial activities and postantibiotic effects of levofloxacin, ciprofloxacin, and norfloxacin in genetically related strains of Staphylococcus aureus / J.R. Aeschilimann, L.D. Dresser, G.W. Kaatz [et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1999. - Vol.43, №2. - P.335-340.
5. An J. Antimicrobial and synergy of flavonol rhamnoside with antibiotics against clinical isolates of methicillin-resistant S.aureus (MRSA) / J. An, G.Y. Zuo, X.Y. Hao [et al.] // Phytomedicine. - 2011. - Vol.18, №11. - P.990-993.
6. Bueno J. Antimicrobial adjuvants drug discovery, the challenge of avoid the resistance and recover the susceptibility of multidrug-resistant strains / J. Bueno // J. Microb. Biochem. Technol. - 2016. - Vol.8, №3. - P.169-176.
7. Braga L.S. Synergic interaction between pomogranate extract and antibiotics against Staphylococcus aureus / L.S. Braga, A.A.M. Leite, K.G.S. Xavier [et al.] // Can. J. Microbiol. - 2005. - Vol.51, №1. - P.541-549.
8. Chan B.C.L. Synergic effects of diosmetin with erythromycin against ABC transporter over-expressed methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) RN4220/pUL5054 and inhibition of MRSA pyruvate kinase / B.C.L. Chan, M. Ip, H. Gong [et al.] // Phytomedicine. - 2013. - Vol.20, №7. -P.611-614.
9. Chan B.C.L. Combating against methicillin-resistant Staphylococcus aureus - two fatty acids from Purslane (Portulaca oleracea L.) exhibit synergistic effects with erythromycin / B.C.L. Chan, X.Q. Han, S.L. Lui etc. // J. Pharm. Pharmacol. - 2015. - Vol.67, №1. - P.107-116.
10. Lawal T.O. Combination studies of Eucalyptus torelliana F. Muell. leaf extracts and clarithromycin on Helicobacter pylori /T.O. Lawal, B.A. Adeniyi, J.O. Moody, G.B. Mahady // Phytotherapy Research. - 2012. - V.26(9). - P. 1393-1398.
11. Craig W.M. The postantibiotic effect / W.A. Craig // Clinical Microbiology. - 1991. - Vol.13, №16. - P.120-125.
12. D'Arrigo M. Synergism and postantibiotic effect of tobramycin and Malaleuca alternifolia (tea tre) oil against Staphylococcus aureus and Escherichia coli / M. D'Arrigo, G. Ginestra, G. Mandalari [et al.] // Phytomedicine. - 2010. - Vol.17. - P.317-322.
13. Fankam A.G. Antibacterial activities of selected Cameroonian spices and their synergistic effects with antibiotics against multidrug-resistant pheno-types / A.G. Fankam, V. Kuete, I.K. Voukeng [et al.] // BMC Complement. Altern. Med. - 2011. - №11, №104. - P.1-11.
14. Goswami S. Anti-Helicobacter pylori potential of artemisin and its derivatives / S. Goswami, R.S. Bhakuni, A. Chinniah [et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2012. - Vol. 56, № 9 - P. 4594-4607.
15. Joray M.B. Antimicrobial activity of the pland-derived compounds 23-methyl-6-O-desmethylauricepyrone and (Z,Z)-5-(trideca-4,7-dienyl)resorcinol and their synergy with antibiotics against methicillin-susceptible and resistant Staphyloccocus aureus / M.B. Joray, M.L. Gonzales, S.M. Palacios [et al.] // J. Agric. Food Chem. - 2011. - Vol.59, №21 - P.11534-11542.
16. Lewis J.S. Inducible clindamycin resistance in staphylococci: should clinical and microbiologists be concerned? / J.S. Lewis, J.H. Jorgensen // Antimicrobial resistance invited article. - 2005. - V.40(2). - P.280-285.
17. Lorenzi V. Geraniol restores antibiotic activities against multidrug-resistant isolates from gram-negative species / V. Lorenzi, A. Muselli, A. Francois [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. - Vol.53, №5. - P.2209-2211.
18. Magi G. Antimicrobial activity of essential oils and carvacrol, and synergy of carvacrol and erythromycin, against clinical, erythromycin-resistant group A Streptococci / G. Magi, E. Marini, B. Facinelli // Front. Microbiol. - 2015. - Vol.6. - P. 165-169.
19. Monte J. Antimicrobial activity of selected phytochemicals against Escherichia coli and Staphylococcus aureus and their biofilms / J. Monte, A.C. Abreu, A. Borges [et al.] // Pathogens. - 2014. - Vol.3, №2. - P.473-498.
20. Mulazimoglu L. Macrolides / L. Mulazimoglu, P.M. Tulkens, F. Bambeke [et al.] // Antimicrobial therapy and vaccines. - 2004. - Vol. 2, №2. - P. 243278.
21. Orhan I.E. Inhibitory effects of various essential oils and individual components against extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) produced by Klebsiella pneumoniae and their chemical compositions / I.E. Orhan, B. Ozcelik, Y. Kan [et al.] // J. Food Sci. - 2011. - Vol.76, №8. - P.538-546.
22. Prunier A.L. Clinical isolates of S. aureus with ribosomal mutations conferring resistance to macrolides / A.L. Prunier, B. Malbruny, D. Tande [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol.46, №9. - P.3054-3056.
23. Santos A. Organic extracts from Indigofera suffruticosa leaves have antimicrobial and synergic actions with erythromycin against S.aureus / A. Santos, T. Araujo, L. Silva [et al.] // Front. Microbiol. - 2015. - Vol.6. - P. 13-18.
Реферат
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СИНЕРГИЧЕСКИХ КОМБИНАЦИЙ ЭРИТРОМИЦИНА И ЭКСТРАКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ФЛОРЫ ПРИКАРПАТЬЯ НА ДИНАМИКУ РОСТА КУЛЬТУРЫ STAPHYLOCOCCUS AUREUS С ИНДУЦИБЕЛЬНЫМ ФЕНОТИПОМ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К МАКРОЛИДАМ Юрчишин А. И., Куцик Р.В.
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, растительные экстракты, эритромицин, антибиотикорезистентность, синергизм противомикробного действия.
Введение. Одним из приоритетных путей борьбы с антибиотикорезистентностью является поиск веществ, которые способны преодолевать приобретенную микроорганизмами устойчивость к антибиотикам и усиливать их действие. С каждым годом растет интерес к терапевтическому потенциалу активных компонентов фитопрепаратов в качестве модификаторов антибиотикорезистентности. Особое практическое значение имеет выяснение возможности преодоления резистентности стафилококков к макролидам, что являются препаратами выбора при лечении многих инфекций. Цель: изучить влияние комбинаций эритромицина и экстрактов лекарственных растений в суббактериостатических концентрациях на динамику роста культуры S. aureus с индуцибельным механизмом резистентности к макролидам, а также исследовать влияние экстракта плодов ольхи серой Alnus incana L. на постантибиотический эффект эритромицина. Материалы и методы. В качестве тест-культуры использовано кожный изолят S. aureus с индуцибельным фенотипом резистентности к макролидам, линкозамидам и стрептограмину В. Идентификация фенотипа резистентности в тест-штамма определяли дискодифу-зийним методом. Для проведения изучения влияния биологически активных веществ растительного происхождения на динамику роста культур стафилококка использовано 6 экстрактов лекарственных растений на 90% водном этаноле: экстракт плодов ольхи серой Alnus incana L., почек березы бородавчатой Betula verrucosa L., листьев толокнянки обыкновенной Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., корневищ герани лучной Geranium pratense L., корневищ кровохлебки лекарственной Sanguisorba officinalis L. и листьев тамари^а ветвистого Tamarix ramosissima Ledeb., а также препарат «Альтан». С целью уточнения данных по синергетическому потенциалу комбинаций растительных экстрактов и
эритромицина использован метод кривой «время - бактерицидный эффект» (time kill curves). Изучение постантибиотического эффекта эритромицина и влияние на него экстракта плодов ольхи серой Alnus incana L. проведено по методу Craig W.A., Gudmundsson S.
Результаты. Комбинации суббактериостатических концентраций эритромицина с экстрактами плодов ольхи серой Alnus incana L. (и препаратом «Альтан»), корневищ герани луговой Geranium pratense L., листьев толокнянки обыкновенной Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., Почек березы бородавчатой Betula verrucosa L. относительно исследуемого штамма S. aureus проявили синергическое взаимодействие, отчетливо уменьшая количество жизнеспособных микробных клеток в культуре. При этом синергичные комбинации эритромицина с экстрактами плодов ольхи и корневищ герани достигли бактерицидного эффекта. Анализ кривой «время - бактерицидный эффект» продемонстрировал индифферентность комбинации эритромицина с экстрактом листьев тамарикса ветвистого Tamarix ramosissima Ledeb. и корневищ кровохлебки лекарственной Sanguisorba officinalis L. Постантибиотический эффект эритромицина относительно исследуемого штамма составляет 0,5 ч. В присутствии экстракта плодов ольхи серой Alnus incana L. наблюдали увеличение продолжительности постантибиотического эффекта эритромицина до 3,1 ч. Выводы. Экстракты плодов ольхи серой Alnus incana L., корневищ герани луговой Geranium pratense L., листья толокнянки обыкновенной Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. и почек березы бородавчатой Betula verrucosa L. усиливают противомикробное действие макролидов (эритромицин) в отношении стафилококков с индуцибельным фенотипом резистентности к макролидам, линкозамидам и стрептограмину В.
Summary
EFFECTS OF SYNERGETIC COMBINATIONS OF ERYTHROMYCIN AND EXTRACTS OF MEDICINAL PLANTS OF PRYKARPATTIA ON THE GROWTH DYNAMICS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS CULTURE WITH INDUCIBLE PHENOTYPE OF RESISTANCE TO MACROLIDES Yurchyshyn O.I., Kutsyk R.V.
Keywords: Staphylococcus aureus, plant extracts, erythromycin, antibiotic resistance, synergistic action.
Introduction. One of the main ways to control antibiotic resistance is to search for substances that are able to overcome it and moreover, to potentiate antibiotics action. Every year there is a growing interest in the therapeutic potential of herbal active compounds as modifiers of antibiotic resistance. It is of great practical importance to find the possibility to overcome staphylococci resistance to macrolides, which are the drugs of choice in the treatment of many infections. Objective: To investigate the effects of combination of erythromycin and medicinal plant extracts in subinhibitory concentrations on the growth dynamics of S. aureus culture with inducible mechanism of resistance to macrolides and influence of Alnus incana L. extract on the post antibiotic effect of erythromycin. Materials and methods. S. aureus skin isolate with inducible phenotype of resistance to macrolides, linzosides and streptogramin B was used as test culture. Identification of its resistant phenotype was performed by disc diffusion method. Medicinal plants ethanol extracts of Alnus incana L. fruits (and "Altanum"), Betula verrucosa L. buds, Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. and Tamarix ramosissima Ledeb. leaves, Geranium pratense L. and Sanguisorba officinalis L. rhizomes were used to investigate the influence of biologically active substances of plant origin on the growth dynamics of staphylococcus cultures. The time kill curves method was used to evaluate synergistic potential of plant extracts and erythromycin combinations. The study of erythromycin postantibiotic effect and influence on it Alnus incana L. fruits extract was carried out by Craig W.A., Gudmundsson S method. Results Combinations of erythromycin with Alnus incana L. fruits (and "Altanum"), Betula verrucosa L. buds, Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. leaves and Geranium pratense L. rhizomes extracts in sub inhibitory concentrations against S. aureus strain showed synergistic interaction, clearly decreasing the number of viable microbial cells in culture. The synergistic combination of erythromycin with Alnus incana L. fruits and Geranium pratense L. rhizomes extracts has reached the marked bactericidal effect. The analysis of the "time - bactericidal effect" curves has demonstrated no effect of the combination of erythromycin with Tamarix ramosissima Ledeb. leaves and Sanguisorba officinalis L. rhizomes extracts against test strain. The postantibiotic effect of erythromycin against tested strain is 0.5 hours. In the presence of Alnus incana L. fruits extract was increased in the duration up to 3.1 hours. Conclusions. Extracts of Alnus incana L. fruits, Betula verrucosa L. buds, Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. leaves and Geranium pratense L. rhizomes increase the antimicrobial action of macrolides (erythromycin) against staphylococci with inducible phenotype of resistance to macrolides, linzosides and streptogramin B.
