CC BY
39
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧНИЙ
УДК 616.716-008
О. С. Барило, Т. М. Каншина, А.В. БЛошицька
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ВПЛИВУ Ф1БРИНУ, ЗБАГАЧЕНОГО ТРОМБОЦИТАМИ (PLATELET RICH FIBRIN, PRF ), НА РЕГЕНЕРАЦ1Ю ТКАНИН ПАРОДОНТА В ЕКСПЕРИМЕНТ1
ВЫницький нацiональний медичний унiверситет iM. М. I. Пирогова
Вступ
Багато сучасних дослщжень присвячен1 ви-вченню можливосл використання фактор1в росту i клгтинноТ диферен^аци. Фактори росту - це пол^ пептиди, здатнi стимулювати штинну диференцн ацiю, рiст, пролiферацiю [1]. До фактов росту, якi в^грають певну роль у процесi регенераци тканин, можна вiднести плазму, збагачену тромбоцитами (Platelet Rich Plasma, PRP), i фiбрин, збага-чений тромбоцитами (Platelet Rich Fibrin, PRF). Bi-домо, що саме тромбоцити, крiм ТхньоТ основно''' ролi (участь у гемостазi), е природним джерелом фактов росту. Також науковi дослiдження вказу-ють на важливу роль тромбоцитiв i фiбрину в ре-паративних процесах. Тромбоцити - це фрагменти крупних штин кюткового мозку (мегакарiоцитiв), вони не мають ядра i в циркулюючiй кровi вигля-дають як овальнi двояковипукл диски. При елект-роннiй мiкроскопil в цитоплазмi тромбоцитiв вияв-лен альфа-гранули (виглядають як зерна у свп"-ловий мiкроскоп) i система трубочок, зв'язаних iз поверхнею штини. Альфа-гранули за природою е секреторними i мiстять ферменти, а також полте-птиди, названi факторами росту. При ушкодженн стiнки кровоносно''' судини тромбоцити прилипають до внутршньо''' поверхн стiнки, кiлькiсть тромбоци-тiв збтьшуеться - цей процес називаеться агрега-цiею тромбоцитiв, вiн супроводжуеться утворен-ням нерозчинного бiлка фiбрину з його попередни-ка (фiбриногену). Унаслщок адгезй' тромбоцитiв вiдбуваеться реакцiя вивтьнення альфа-гранул через систему трубочок, звьязаних iз поверхнею клiтини. Речовини, як видiляються з альфа-гранул, сприяють аглютинаци нових тромбоцитiв, ретракцй' кров'яного згустку. Тромбоцити в згустку дегенерують, у згусток проникають фiбробласти i капiляри, сам згусток замiщуеться сполучною тканиною. Це називаеться оргаыза^ею тромбу. Ме-ханiзм утворення й оргаызаци тромбу важливий для розумЫня регенераци тканин пародонта.
Дослiдниками розроблен протоколи отримання
фiбрину, збагаченого тромбоцитами, шляхом центрифугування венозно''' кровi пацiента. Це дае можливiсть доставки тромбоцтчв i фiбрину до мь сця ушкодження. Такi клiтиннi технологи вже широко використовуються в рiзних галузях медицини: в х1рургп для лiкування хронiчних виразок, у пне-кологи для стимулювання загоювання ерозш сли-зово', в урологй' для вщновлення слизово''' при циститах. Але експериментальн дослiдження щодо використання PRF для стимуляцй' регенерацй' тканин на рiвнi доказово'' медицини вщсуты [2].
Мета дослiдження - в експеримент на щурах дослщити вплив фiбрину, збагаченого тромбоцитами (Platelet Rich Fibrin, PRF), на регенерацю тканин пародонта.
MaTepia^ i методи дослщження
Експериментальне дослiдження виконували на базi вiварiю Biнницького нацiонального медичного уыверситету iм. М. I. Пирогова. Дослщи проводили з дотриманням основних положень Хельсинсько'' декларацй' про гуманне ставлення до тварин (1964-2000 рр.), пюля отримання дозволу комiтету з бюетики згiдно з «Положенням про використання тварин в бюмедичних дослщах». Проведена серiя дослiдiв на 14 щурах обох статей вком 12-24 мюя-цiв i вагою 170- 210 г. Тварини були подтеы на 2 групи: 1 група - контрольна (5 тварин ) i 2 група -дослщна (9 тварин). Для моделювання рани пародонта тваринам пщ загальним знеболюванням видаляли лiвий нижнм рiзець за допомогою щип-цiв, зiгнутих по ребру малого розмiру. Щiчками щип^в охоплювали шийку зуба, просували '''х максимально вниз, фiксували зуб i вивихували його вестибулярно. При цьому рiзець зазвичай ламався на рiвнi згину кореня зуба. Великим кулястим бором рану трохи поглиблювали, згладжували госщ кра'' лунки. Таким способом отримували рану слизово''' оболонки, перiодонта, цементу, альвеолярной кiстки i тканин зуба. У тварин контрольно'' групи рана загоювалася самостшно. Для отримання ф^ бринового згустку з латерально''' хвостово'' вени
тварини забирали 1 мл кров^ для цього щура по-мщали в камеру Когана, хвют тварини нагрiвали в посудин з теплою водою (40°С -45°С), пiсля дез-Ыфекцп проводили венепункцш за допомогою го-лки-метелика, зьеднаноТ катетером iз вакуумною пробiркою (рис. 1А). Отриману кров центрифугу-вали 12 хвилин зi швидкiстю 3000 обер^в за хви-лину. Кров у пробiрцi розподiляли на три шари: верхнiй - плазма з дефщитом тромбоцитiв, серед-
нiй - фiбриновий згусток, збагачений тромбоцитами, нижнм шар - згусток червоних кровЬяних тн лець. Фiбриновий згусток виймали з пробiрки пн цетом, скальпелем вязали червонi кровLянi ттьця i перемiщали в рану (рис. 1Б). Тваринам дослщноТ групи в рану помщали фiбриновий згусток, отриманий у ^еТ ж тварини, фксували п-подiбним швом iз полiамiдноТ нитки.
Рис.1. А - 3a6ip кров/' з латеральноГ хвостовоГ вени щура; Б - транспортування фiбрину, збагаченого тромбоцитами (PRF), у рану
Результат експерименту оцЫювали на 3, 7 i 14 доби. Щурiв виводили з експерименту шляхом дислокаци шийних хреб^в пщ загальним знебо-люванням. Видаляли фрагмент нижньоТ щелепи. Для оцiнки морфологiчних змЫ готували декаль-цинованi блоки, як мiстили зуб, перiодонт, прилег-лу альвеолярну кютку; робили зрiзи в мезюдиста-льному напрямку. З метою декальцинаци матерiал обробляли в розчиы, до складу якого входили хлоралпдрат, 960 етиловий спирт, концентрована азотна кислота i дистильована вода. Виготовляли зрiзи препарату фiбринового згустку i фарбували на фiбрин: оранжевий-червоний-голубий за Зер-бiно Д.Д., Лукасевич Л.Л. (модифкований метод МагйиБ-8са|М-В1ие) [3] .
Зрiзи гiстологiчних препаратiв виконували в ме-зiодистальному напрямку (5-7 мкм), фарбували ге-матоксилiн-еозином i ткрофуцином за Ван Гiзоном.
М1кроскоп1ю i фотографування г1столог1чних препарат1в проводили за допомогою св^лового Mi-кроскопа «OlympusBX41» при збiльшеннi в 40, 100, 200, 400 i 1000 разiв.
Результати дослiдження та 1х обговорення
На початку дослщження ми провели пстолопч-ну оцiнку фiбринового згустку (Platelet Rich Fibrin, PRF). При мiкроскопil зрiзiв фiбринових згусткiв виявлен клiтини без ядра - тромбоцити (ix ще на-зивають кров'яними пластинками), розмщен мiж нитками бтка фiбрину (рис. 2А). При фарбуванн препаратiв за Зербiно Д.Д., Лукасевич Л.Л. нитки фiбрину виявляються на рiзниx стадiяx дозрiвання (колiр змЫюеться вiд оранжевого до голубого), що вщповщае стадiям ретракцп кров'яного згустку (рис. 2Б).
Рис. 2. А - фiбриновий згусток: нитки фiбрину, 1-тромбоцити; забарвлення - гематоксилн-еозин, зб. - х400; Б - фiбриновий згусток на рiзних стадiях дозрвання (колiр змiнюeться вiд жовтого до червоного та голубого). Метод фарбування на фiбрин - оранжевий-червоний-голубий за Зербно Д.Д., Лукасевич Л.Л. (модифiкований метод Martius-Scarlet-Blue). Зб. - х4о0
Охарактеризуемо результати мiкроскопiчного дослщження препара^в тканин пародонта щу-рiв. На 3-й день лкування навколо PRF у краях рани була пом^но виражена лейкоцитарна шфн
льтра^я (рис. 3А), тодi як лейкоцитарна шфть-тра^я в ран контрольно' групи щурiв була мен-ше вираженою (рис. 3Б).
Рис.3. А - зуб, лейкоцитарна iнфiльтрацiя по краях рани (1), фiбриновий згусток (2), забарвлення гематоксилiн-еозином, зб. х 100; Б - зуб (1), багатошаровий плескатий епiтелiй (2), забарвлення гематоксилiн-еозином, зб. х 100
На 7-й день вщ початку експерименту в препаратах дослщних щурiв нами виявлен макрофаги (рис. 4А). Тхж розмiри були рiзними (вщ маленьких кл^ин до великих неправильно' фо-рми). Поряд iз макрофагами в препаратах, заба-
рвлених за Ван Пзоном, з'являлися волокна ко-лагену (рис. 4Б).
У контрольна груш макрофаги по краях рани були поодинокими, кл^инна шфшьтраця не ви-ражена (рис. 4В).
Б
Рис.4. А - макрофаги (1), ф1бриновий згусток (2), забарвлення гематоксил1н-еозином, зб.х 200; макрофаги з детритом згустку (1), ф1бриновий згусток (2), забарвлення за Ван Пзоном, зб.х 200; В- край рани контрольноТ тварини, забарвлення за Ван Пзоном, зб.х 200
- М.: Издательский дом «Азбука», 2015. -
Висновок
Отриман нами результати дослщження вщ- 2. повщають даним л^ератури про етапнсть змши кл^ин-учасникв запального процесу: спочатку у вогнищi запалення з'являються нейтрофтьш гранулоцити (Гх ще називають мiкрофагами), по- 3 тм до них приеднуються макрофаги i, нарешт, 3. фiбробласти [4]. Основна функця макрофагiв -поглинання та резорбця чужорiдних структур. Разом iз тим макрофаги переводять запальну 4. реакцю на фiбробластичну стадiю, активуючи пролiферацiю фiбробластiв, якi синтезують по- 5. закл^инний матрикс, зокрема колаген [5] .
Отже, гютолотш дослiдження свщчать про те, що використання PRF у лкуванш ран паро-донта сприяе швидкому пригнiченню гнiйного запалення, що прискорюе процеси репаративно'' регенераци.
Лп-ература
1. Джиано Риччи. Диагностика и лечение заболеваний пародонта / Джиано Риччи, Марио Аймет-
Резюме
Останнм часом у стоматологи та шших галузях медицини широко використовуеться фiбрин, збага-чений тромбоцитами (Platelet Rich Fibrin, PRF).
Вщомо, що тромбоцитарн фактори росту здатн позитивно впливати на репаративний процес. Та серед лiкарiв тривае дискуся про ефективнiсть використання PRF у лкуванш. У статтi наведенi результати експериментального дослщження про вплив PRF на регенерацю тканин пародонта.
Кпючовi слова: тромбоцит, фактори росту, регенераця, експеримент.
ти.
С.539-551.
Walid Ahmed Abdullah. Evaluation of bone regenerative capacity in rats claverial bone defect using platelet rich fibrin with and without beta tri calcium phosphate bone graft material / SaudiDent J.-2016, Jul.-Vol. 28(3).- Р. 109-117. Методики морфологчних дослщжень : монография /[Багрш М.М., Дiброва В.А., Попадинець О.П., Прищук М.1.] ; за ред. М.М.Багрiя, В.АДброви.-Biнниця : Нова Книга, 2016.-157 с. Хем А. Гистология / Хем А., Кормак Д.; пер. с англ.- М.: Мир, 1983. - Т.2. - С.117-125. Радьога Я. В. Поеднання штинних технолога та мшПнвазивноТ хiрургiг в лiкуваннi хрошчноТ вираз-ки шлунку (експериментально-клiнiчне досль дження) : автореф. дис. на здобуття наук. ступе-ня канд. мед. наук : спец. 14.01.03 <^рурМя» / Радьога Ярослав Володимирович.- ВЫниця, 2015. - С. 27-32, 58-61.
Стаття надшшпа 04.05.2017 р.
Резюме
В последнее время в стоматологии и других отраслях медицины широко используется фибрин, обогащенный тромбоцитами (Platelet Rich Fibrin, PRF). Известно, что тромбоцитарные факторы роста положительно влияют на репаративный процесс. Среди врачей вопрос об эффективности PRF в лечении остается дискутабельным. В статье представлены результаты экспериментального исследования влияния PRF на регенерацию тканей пародонта.
Ключевые слова: тромбоцит, факторы роста, регенерация, эксперимент.
UDC616.716-008
RESEARCH OF EFFECT OF PLATELET RICH FIBRIN, PRF ON PARADONTOSIS TISSUES REGENERATION DURING THE EXPERIMENT
O. S. Barylo, T. M. Kanishyna, A. V. Biloshytska
National Pirogov Memorial Medical University, Vinnytsya
Summary
The usage of Platelet Rich Fibrin, PRF means the possibility to apply growth factors in medicine.
Growth factors are polypeptides which can stimulate cytodifferentiation, growth, proliferation, and participate in the process of tissue regeneration. Thrombocytes are the natural sources of growth factors. Platelet Rich Plasma PRP, Platelet Rich Fibrin, PRF is used in different branches of medicine. However, there isn't sufficient number of experimental studies related to the usage of PRF to stimulate regeneration of tissue.
Purpose
To examine the effect of Platelet Rich Fibrin, PRF on the regeneration of paradontal tissues in the experiments with rats.
Materials and research methods
The set of experiments with 14 rats of both sexes at the age of 12 to 24 months, weigh 170 to 210 g. The animals have been divided into the control group with 5 rats and the experimental group with 9 rats.
In the control group the imitated wound of paradontosis has healed on itself, in the experimental group PRF was used. PRF was received by extraction of venous blood of those animals. Blood sampling was conducted on the venous caudal vein. Blood in vitro was distributed into three segments: the upper segment was plasma with insufficient number of platelets, the middle one was rich with platelets fibrin cake, the lower one was cake of red blood cells. The fibrin was removed from the tube with forceps; red blood cells were cut by a scalpel and placed into the wound.
The result of the experiment was evaluated on the 3rd, 7th, 14th days. The morphological research was conducted for PRF efficiency rate. Histological preparations made of PRF and fragments of the lower jawbone, were examined under microscope and photos of them were made.
Results
The analysis done under microscope of rat's paradontosis tissues has revealed that there is difference between the control and experimental groups. On the 3rd day of treatment around the place of PRF there could be seen the leukocytic infiltration on the wound edges while the leukocytic infiltration of the wound in the control group was less significant. On the 7th day of the experiment the macrophages in the preparations of the rats has appeared, size differed (from small to big cells of irregular form). In addition, in the preparations coloured according to Van-Gizon there appeared collagen tissues. In the control group the macrophages in the wound edges were single, cellular infiltration was not significant. The number of macrophages in the preparations of experimental group of animals was significantly more than in the control group.
Conclusion
Gradual change of cells-participants is typical for inflammatory process: at first, neutrophilic granulocytes appear in the inflammatory tissue (which also called microphages), then macrophages appear and in the end fibroblasts arise. The main function of macrophages is absorption and resorption of foreign structures. In addition, macrophages transport the inflammatory reaction into fibroblastic stage activating fibroblast proliferation, which generate local matrix, in particular, collagen. Therefore, histological examinations give evidence that the usage of PRF during the course of paradontal treatment leads to fast inhibition of purulent inflammation that promotes the reparative regeneration process.
The experiment has been carried out with the small number of animals. Therefore, it was not possible to obtain reliable results. For the further study of this issue the increased number of animals should be engaged into the research.
Key words: thrombocyte, growth factors, regeneration, experiment.
