CC BY
73
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №4/2016 ISSN 2410-700Х_
УДК 615.453.3
Иванова Наталья Сергеевна
аспирант кафедры «Технология машиностроения» Псковский Государственный Университет
г. Псков
E-mail:[email protected] Пак Татьяна Судиновна
кандидат хим. наук, доцент Псковский Государственный Университет
г. Псков
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОРБЕНТА.
Аннотация
В настоящей статье представлены результаты доклинического токсикологического исследования разработанного гемосорбента. Изучение токсичности проводили в острых и хронических экспериментах на мышах и крысах. Результаты исследований показали, что испытуемый сорбент является нетоксичным для организма препаратом.
При изучении гемосовместимых свойств испытуемого сорбента основное внимание было направлено на выяснение состояния клеток крови, степени их сохранности после прохождения через адсорбционную колонку. Исследования показали, что сорбент обладает высокими гемосовместимыми свойствами. В этом отношении он выгодно отличается от углеродистых сорбентов, что предопределяет перспективность использования его в клинической практике.
Ключевые слова
Гемосорбент; токсичность; гемосовместимость; гематологические показатели, медико-биологические свойства, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты, гемоглобин, цветной показатель, гематокрит,
протромбиновый индекс, тромботест.
Исходя из требований предклинической стадии испытаний сорбента были оценены его медико-биологические свойства по критериям: токсичность и гемосовместимость.
Изучение токсичности гемосорбента проводили в острых и хронических экспериментах на мышах и крысах.
а) острая токсичность.
Острую токсичность определяли на белых крысах обоего пола массой тела 150-200 г путем внутрибрюшинного введения 50%-ной водной суспензии сорбента. Суспензию вводили однократно в дозах 250 мг (10 животных), 1000 мг (10 животных) и 5000 мг (10 животных) на кг массы тела. Контролем служили результаты таких же однократных введений в брюшную полость 2 мл физиологического раствора (30 животных). Животных забивали на 10-е сутки после однократного введения суспензии сорбента. В качестве критериев оценки учитывали изменения массы тела и поведения животных, картины периферической крови, гистологические изменения головного мозга, печени, сердца, селезенки, почек, тонкого и толстого кишечника. Кусочки этих органов фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Из них готовили парафиновые срезы и окрашивали их гематоксилин - эозином [1,с.53].
Результаты показали, что однократные введения суспензии сорбента в дозах соответственно 250, 1000 и 5000 мг на кг массы тела животных не вызывали гибели животных и не сопровождались какими-либо общими тяжелыми изменениями. Наблюдавшиеся в первые сутки умеренные нарушения поведения животных скорее всего были связаны с травматичностью проделанного вмешательства. В целом, можно считать гемосорбент практически нетоксичным препаратом.
б) хроническая токсичность.
Хроническую токсичность определяли на белых крысах обоего пола массой тела 150-200 г путем внутрибрюшинного введения 50%-ной водной суспензии сорбента. Суспензию вводили 5-ти кратно с
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №4/2016 ISSN 2410-700Х_
интервалом 6 суток в дозе 5000 мг/кг (40 животных) [2,с.63]. Контролем служили результаты таких же 5-кратных введений в брюшную полость 2 мл физиологического раствора (30 животных). Животных забивали через 2, 4, 6 месяцев после месячного цикла введений указанной дозы суспензии. В качестве критериев оценки учитывали изменения массы тела и поведения животных, картины периферической крови, гистологические изменения головного мозга, печени, сердца, селезенки, почек, тонкого и толстого кишечника. Кусочки этих органов фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Из них готовили парафиновые срезы и окрашивали их гематоксилин - эозином.
Результаты изучения хронической токсичности после 5-кратного внутрибрюшинного введения в течение месяца 50% суспензии сорбента из расчета 5000 мг/кг массы тела животных были аналогичны таковым контрольной группы животных, которые подвергались подобным введениям физиологического раствора. Первоначальные нарушения общего состояния животных, обусловленные травматичностью вмешательства, вскоре исчезали. Наблюдения в динамике до 6 месяцев выявили тенденцию к увеличению массы тела. Картина периферической крови как в опытной, так и в контрольной группе животных отклонений от нормы не имела.
При гистологических исследованиях внутренних органов животных обращали на себя внимание только лишь умеренные циркуляторные и нередко дистрофические изменения в почках, печени, тонком и толстом кишечнике. В селезенке эти изменения были более постоянными и сопровождались гиперплазией лимфоидных фолликулов с преобладанием лимфацитарной инфильтрации.
В основном эти изменения обнаруживались в ранние сроки после 5-кратных сеансов внутрибрюшинного введения суспензии сорбента. В поздние сроки (4-6 мес.) после внутрибрюшинных введений данной суспензии они исчезали. В исследованиях биоптатов головного мозга изменений не было обнаружено.
Необходимо отметить, что при морфологических исследованиях указанных внутренних органов всех животных контрольной группы с введением физиологического раствора обнаруживались аналогичные изменения. Это послужило основанием считать, что вышеуказанные первоначальные циркуляторно -дистрофические изменения внутренних органов подопытных животных не являлись специфической реакцией на многократное внутрибрюшинное введение суспензии испытуемого сорбента, а скорее всего представляли последствия многократной хронической травмы брюшной полости. Результаты исследований показали, что испытуемый сорбент является нетоксичным для организма препаратом.
в) гемосовместимость.
Известно, что каким бы высоким сродством к патологическим метаболитам и ядам не обладал сорбент, в качестве гемосорбента он может быть использован лишь при условии хорошей совместимости с кровью. Общей формулировки понятия совместимости чужеродной поверхности с кровью до сих пор не существует. Применительно к гемосорбентам практически важным является изучение поведения сорбента по отношению к клеткам крови. Первое требование к сорбенту в этом случае - отсутствие выраженного отрицательного влияния на компоненты крови.
В соответствии с этим при изучении гемосовместимых свойств испытуемого сорбента основное внимание было направлено на выяснение состояния клеток крови, степени их сохранности после прохождения через адсорбционную колонку.
Гемосовместимые свойства сорбента изучали на беспородных собаках с воспроизведенной моделью обтурационой желтухи по С.А. Шалимову [3,с. 41]. Последнюю осуществляли путем лигирования пузырного протока и терминального отдела холедоха в 2 местах и пересечения его между лигатурами. Экстракорпоральную гемосорбцию у этих животных проводили с помощью аппарата УАГ-01 на 10-е сутки после операции вено-венозным способом со скоростью 30-40 мл/мин в течение 25-35 мин.
Это позволяло пропустить через систему 1-1,5 объема циркулирующей крови животных (дан внутривенный калипсоловый наркоз).
При проведении гемосорбции был использован специально разработанный для этой цели массообменник (рац. предложение № 133, ТашИУВ, 1992г.), который лишен недостатков обычного массообменника (тромбоз колонки, недостаточность контакта гемосорбента с кровью с образованием немых
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №4/2016 ISSN 2410-700Х_
зон и др.), имеющий коническую форму, обеспечивающую наибольший контакт перфузируемой крови с гемосорбентом, увеличение сорбционной поверхности, а также уменьшение тромбообразования в колонке за счет несмачиваемости фторопласта.
В отличие от цилиндрических колонок в предлагаемом массообменнике не происходит завихрения перфузируемой крови с образованием воздушных прослоек, что исключает применение специальной воздушной ловушки.
Перед применением гемосорбции массообменник с гемосорбентом (30-40 г) и систему трубок промывали 400 мл физиологического раствора с гепарином (5000 ед.). У 10 подопытных собак гемосорбцию проводили на испытуемом сорбенте, у 10 - на СКН-4М (контроль). Пробы крови для исследования гемосовместимости брали на входе в гемоперфузионную колонку и на выходе из нее. Исходя из требований, предъявляемых к гемосовместимости испытуемых сорбентов, учитывалась степень потери форменных элементов крови и нарушение ее свертывающей системы, а также степень тромбообразования. В пробах крови определяли концентрацию гемоглобина, эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и подсчитывали лейкоцитарную формулу. Определяли кроме того гематокрит и показатели коагулограммы крови.
Прежде чем говорить о результатах исследований крови в связи с прохождением ее через колонку с указанными сорбентами, необходимо указать, что «исходная» картина крови у животных представляла ряд отклонений от нормы. Так, имел место высокий лейкоцитоз и нейтрофилез с наличием регенераторно-дегенеративного сдвига влево. Повышенные гематокрит и эритроцитоз указывали на сгущение крови. По всей вероятности, эти изменения были обусловлены перенесенной операцией, наличием печеночной недостаточности и интоксикации. Они служили истинным исходным фоном для суждения о том, какие изменения возникают в связи с 30-минутным прохождением 1,5 объема циркулирующей крови через колонку с сорбентом (табл.1).
Таблица 1
Динамика гематологических показателей в процессе гемосорбции на сорбенте СКН-4М (n=20)
Показатель Этапы исследования
До гемосорбции После гемосорбции
Эритроциты (57*1012г/л) 7,2±0,60 5,5±0,40хх
Тромбоциты (48-258*109г/л) 258,0±17,70 207,0±18,20хх
Лейкоциты (8-10*109г/л) 10,2±0,80 8,8±0,60
Гемоглобин (58-79 г/л) 78,1±6,70 59,0±4,70х
Цветной показатель (0,8-1,0) 1,0±0,07 0,8±0,09х
Гематокрит (30-36%) 38,1±3,30 27,2±2,60х
Протромбиновый индекс (80-100) 96,0±9,30 87,0±8,10
Время рекальцификации плазмы (70-96) 90,0±8,20 81,0±7,50
Тромботест (^-УП) VII ст. VI ст.х
Фибриноген А (2,4-3,6) 3,2±0,40 2,4±0,20х
Фибриноген Б (отсутствует) 4,1±0,30 3,4±0,20х
Примечание. Достоверность при сравнении до и после гемосорбции : х-Р<0,05; хх-Р<0,01.
Из таблицы 2 видно, что эритроцитограмма проб крови, взятых после гемосорбции на СКН-4М, располагается ниже исходной. Это выражалось снижением числа эритроцитов от 7,2 ± 0,6 или в мкл до 5,5 ± 0,4, гемоглобина - от 78,1 ± 6,7 мг% до 59 ± 4,7, что, естественно, сопровождалось снижением гематокритного показателя от 38,1±3,3 до 27,2±2,6. В то же время величина отношения гемоглобин-гематокрит после гемосорбции почти не менялась, что, вероятно, объяснялось проявлением феномена «реверсии гемолиза», другими словами, в шихте колонки свободный гемоглобин поглощался самими эритроцитами.
В пробах крови, взятых после гемосорбции с СКН-4М, определялось сравнительно меньшее число лейкоцитов (от 10,2 тыс. до 8,8 тыс. в мкл), тромбоцитов (от 258 тыс до 207 тыс. в мкл). Вместе с тем, если до гемосорбции показатели свертывающей системы крови показывали довольно значительный уровень коагулирующих свойств крови, то после гемосорбции они проявляли тенденцию к нормализации.
_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «СИМВОЛ НАУКИ» №4/2016 ISSN 2410-700Х_
Принципиально сходные гематологические сдвиги имели место в опытах с применением для гемосорбции испытуемого гемосорбента (табл.2). Однако, в этом случае сорбция эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов и тромбоцитов была незначительной. Так, снижение числа перечисленных форменных элементов крови после гемосорбции по сравнению с исходными значениями статистически не различалось (Р<0,05), то есть в большинстве случаев их количество оставалось неизменным. Гемолиз отсутствовал, тромбоза колонки и выпадения нитей фибрина на ограничительных сетках не наблюдалось. Вместе с тем, как видно из результатов, представленных в таблице 2, исследованные показатели коагулирующих свойств крови после перфузии изменялись незначительно.
Таблица 2
Динамика гематологических показателей в процессе гемосорбции на испытуемом сорбенте (n=20)
Показатель Этапы исследования
До гемосорбции После гемосорбции
Эритроциты (57*1012г/л) 7,3 ± 0,80 7,10 ± 0,60х
Тромбоциты (48-258*109г/л) 255,10 ± 22,90 231,00 ± 21,90™
Лейкоциты (8-10*109г/л) 10,00 ± 0,90 9,50 ±0,70
Гемоглобин (58-79 г/л) 68,10 ± 5,40 66,10 ± 6,30
Цветной показатель (0,8-1,0) 1,00 ± 0,11 0,90 ± 0,08х
Гематокрит (30-36%) 38,20 ± 3,50 30,30 ± 1,70хх
Протромбиновый индекс (80-100) 97,40 ± 8,10 95,10 ± 7,90
Время рекальцификации плазмы (70-96) 88,10 ± 9,40 85,10 ± 7,10х
Тромботест (1У-УП) VII ст. V ст.хх
Фибриноген А (2,4-3,6) 3,15 ± 0,40 3,12 ± 0,30
Фибриноген Б (отсутствует) 4,12 ± 0,40 3,80 ± 0,30х
Примечание. Достоверность при сравнении до и после гемосорбции:
Х- Р<0,05; ХХ- Р<0,01.
Результаты исследования изменения форменных элементов крови в ходе гемосорбции на углеродистом сорбенте СКН-4М и испытуемом сорбенте показали, что градиент концентрации эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и содержания гемоглобина крови в первом случае варьировал от 14 до 25%, а во втором случае - от 3 до 10%. На этом основании можно считать, что испытуемый образец сорбента не вызывает существенной травмы форменных элементов крови.
Наряду с этим, обращало на себя внимание то, что в ходе опытов с СКН-4М для предотвращения запекания крови в колонке приходилось гепаринизировать животных из расчета 250-300 ед/кг, помимо этого сорбент предварительно промывали гепаринизированным раствором, а также подключали к перфузионной системе физиологический раствор с гепарином из расчета 1000 ед/100 мл. В то же время в опытах с испытуемым сорбентом гепарин использовался в 3 раза меньше. В большинстве случаев предварительное промывание сорбента гепаринизированным раствором оказалось достаточным для профилактики тромбообразования в колонке.
Таким образом, из результатов проведенных исследований можно сделать вывод, что исследованный образец сорбента обладает высокими гемосовместимыми свойствами. В этом отношении он выгодно отличается от углеродистых сорбентов. Это предопределило перспективность использования его в клинической практике.
Список использованной литературы:
1. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под редакцией Миронова А.Н., Букатен Н.Д. и др.-М.: ЗАО «Гриф и К», 2012.
2. Исследование хронической токсичности(1,3,6,9 или 12 месяцев), кумулятивное действие на половозрелых особях в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под редакцией Миронова А.Н., Букатен Н.Д. и др.-М.: ЗАО «Гриф и К»,2012.
3. Картеев Н.Т.,Каченцева Я.А. Эффективность гемосорбентов и процессов перфузии: института сорбции проблем эндоэкологии.: Киев,1992.
© Иванова Н.С., Пак Т.С.,2016
