Доклиническое изучение безопасности 3-(2-изопропокси-5-метилфенокси)тиетан-1,1-диоксида (часть 1) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.214.32 © Коллектив авторов, 2016

А.Ф. Мифтахова1, И.Л. Никитина1, О.А. Иванова1, Д.Р. Кильсенбаева2 ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ 3-(2-ИЗОПРОПОКСИ-5-МЕТИЛФЕНОКСИ)ТИЕТАН-1Д-ДИОКСИДА (ЧАСТЬ 1)

'ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа 2ГБУЗ «Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова», г. Уфа

В экспериментах на крысах-самцах изучена субхроническая токсичность 3-(2-изопропокси-5-метилфенокси)тиетан-1,1-диоксида (лабораторный шифр Н40). Ранее показано, что Н40 проявляет выраженные антидепрессивные свойства в экспериментах на лабораторных животных и характеризуется низкой LD50. Оценивали следующие показатели: смертность крыс, изменение массы тела, внешнего вида (состояние шерсти, цвет кожи и слизистых, экзофтальм) животных, суточное потребление воды и пищи, биохимические показатели крови, динамику массы тела, весовые коэффициенты внутренних органов и активность центральной нервной системы. Выявлено, что при субхроническом пероральном введении Н40 (в течение 14 дней в дозах 1,4 мг/кг и 43,4 мг/кг) не вызывает гибели животных, не нарушает функцию печени и почек, не изменяет белковый, липидный и углеводный обмен независимо от дозы, а также не влияет на функции центральной нервной системы в дозе 1,4 мг/кг, но оказывает стимулирующее действие в дозе 43,4 мг/кг (тест «открытое поле»).

Ключевые слова: тиетан-1,1-диоксиды; субхроническая токсичность; крысы, антидепрессивный эффект, открытое поле, коэффициент массы внутренних органов.

A.F. Miftakhova, I.L. Nikitina, O.A. Ivanova, D.R. Kilsenbaeva PRECLINICAL SAFETY STUDIES OF 3- (2-ISOPROPOXY-5-METHYL-PHENOXY)

THIETHANES-1,1-DIOXIDE (PART 1)

Subchronic toxicity of 3- (2-isopropoxy-5-methylphenoxy) thiethanes-1,1-dioxide (laboratory code H40) has been studied in experiments on male rats. Before that it had been shown that H40 has antidepressant-like activity and low LD50. The rats' mortality, body weight and appearance changes (hair, skin and mucous membranes color, exophthalmos), water and food daily intake, biochemical indicators of blood, internal organs weights and central nervous system activity were evaluated. It is shown that H40 sub-chronic oral administration (during 14 days in the doses of 1.4 mg /kg and 43.4 mg/kg) does not cause the animal's death, does not disrupt liver and kidney functions, does not change the protein, lipid and carbohydrate metabolism regardless of the dose. H40 does not affect the central nervous system function in the dose of 1.4 mg / kg but has a stimulating effect in the dose of 43.4 mg / kg (open field test).

Key words: thietane 1,1-dioxide; subchronc toxicity; rat, antidepressant-like activity, open field test, internal organs mass coefficient.

На протяжении ряда лет на кафедре фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии ГБОУ ВПО БГМУ (зав. кафедрой проф. Алехин Е.К.) проводятся исследования по изучению нейротропной активности оригинальных производных тиетанзамещен-ных гетероциклических соединений [6]. На лабораторных животных исследовано более 200 субстанций, среди которых найдены перспективные 3-замещенные тиетан-1,1-диоксиды, характеризующиеся выраженными антидепрессивными свойствами - 3-метокситиетан-1,1 -диоксид (лабораторный шифр Н14), 3-(2-изопропокси-5-

метилфенокси) тиетан-1,1-диоксид (лабораторный шифр Н40) и 3-фенилсульфонилтиетан-1,1 -диоксид (лабораторный шифр Н69) и изучен предполагаемый механизм их действия [2] [4]. Одним из обязательных этапов доклинической характеристики перспективных молекул является исследование их токсикологических свойств: острой, субхронической и хронической токсичности [7]. Острая токсичность изучена на неинбред-ных мышах обоего пола [2], показано, что Н14, Н69 и Н40 при внутрибрюшинном введении мышам относятся к IV классу опасно-

сти, а при внутрижелудочном - к категории умеренно опасных веществ, за исключением Н40, которое при внутрибрюшинном введении мышам-самцам отнесено к V классу опасности (практически нетоксичных соединений). Все исследуемые 3-замещенные тие-тан-1,1-диоксиды (Н14, Н69 и Н40) не вызывают кумуляции [2], однако их хроническая и субхроническая токсичность не изучены. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение субхронической токсичности Н40 при внутрижелудочном введении крысам.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на неин-бредных крысах-самцах массой 280 - 300 г, полученных из питомника филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепа-рат» (г. Уфа). Животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной диете при свободном доступе к воде и пище. Эксперименты проведены с соблюдением нормативов, изложенных в СП 2.2.1.3218-14 от 29 августа 2014 г. N 51 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник

(вивариев)», «Руководство по содержанию и разведению лабораторных животных в питомниках и экспериментально-биологических клиниках (вивариях)» [5] и «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (часть 1)» [7].

Для оценки субхронической токсичности крысам 1 раз в сутки в течение 14 дней перорально с помощью зонда вводили Н40 (Н40 синтезирован на кафедре фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии БГМУ под руководством д.фарм.н. Клен Е.Э. (Уфа, Россия)) (0,4 мл на 200 г веса) в дозах 1,4 мг/кг и 43,4 мг/кг. Выбор исследуемых доз был основан на следующем: доза 1,4 мг/кг - доза, вызывающая четкий антидепрессивный эффект в эксперименте; доза 43,4 мг/кг - 1/15 ЬБ50 (обе дозы получены с помощью таблиц пересчета доз для лабораторных животных (с мыши на крысу) с учетом поверхности их тела [10]). В каждой группе использовали по 10 крыс. Соединение непосредственно перед введением суспендировали с 1% крахмальной взвесью. Контрольным животным (п=10) вводили эквиобъемные дозы 1% крахмальной взвеси.

Общетоксическое действие в эксперименте оценивали по интегральным показателям: смертность крыс, изменение массы тела, внешнего вида (состояние шерсти, цвет кожи и слизистых, экзофтальм) животных, суточное потребление воды и пищи, биохимические показатели плазмы крови, данные гистологических исследований внутренних органов и активность центральной нервной системы. Клинический осмотр каждого животного проводили в течение первых трёх часов после введения и далее один раз в сутки. Животных осматривали непосредственно при нахождении в клетках и в руках экспериментатора. В табл. 1 указаны признаки, которые оценивались при осмотре животных.

Таблица 1

Признаки, оцениваемые при осмотре животных

Вид осмотра Признаки

Осмотр в клетке Поза Поведение Тремор Аномальные движения

Осмотр в руках Состояние шерсти Аномалии дыхания Цвет кожи и слизистых Экзофтальм Мышечный тонус

Массу тела каждого животного определяли перед первым введением соединения и далее каждую неделю до конца эксперимента. Ежедневно визуально оценивали отклонения в потреблении пищи и воды по количеству

съеденного корма и выпитой из поилки воды. Перед началом введения Н40 и спустя 24 часа после последнего введения животных помещали в индивидуальные клетки для количественной регистрации потребления корма и воды. Количество съеденного корма и выпитой воды определяли как разность значений веса корма в кормушке и веса поилки в начале регистрации и спустя 24 часа нахождения животных в индивидуальных клетках.

На 14-й день введения Н40 оценивали индивидуальное поведение животных в тесте «открытое поле» [1]. Тест проводился через 60 мин после внутрижелудочного введения Н40 в дозах 1,4 мг/кг и 43,4 мг/кг. Поведение животного записывали на цифровую видеокамеру в течение 4 мин и затем анализировали с помощью программы BrainTest [8].

Индивидуальное поведение животных рассматривали как комплекс поведенческих актов и поз: «перемещение», «обнюхивание», «вертикальная стойка, «груминг», «движение на месте», «норка», «стойка с упором», «стойка», «сидит» и «дефекация». Дополнительно в качестве интегральных критериев оценивали: «ориентировочно-исследовательскую активность» - сумму паттернов - «обнюхивание», «перемещение», «норка» и «эмоциональную тревожность» - сумму паттернов - «движение на месте», «стойка с упором», «вертикальная стойка».

Через 48 часов после последнего введения исследуемого вещества животных умерщвляли под эфирным наркозом, после чего забирали пробы крови (помещали в пробирки, содержащие 100 мкл гепарина натрия (5000 ЕД/мл)) и забирали внутренние органы для проведения гистологических исследований. Пробы крови центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин, плазму крови использовали для выполнения биохимических анализов с помощью автоматического биохимического анализатора AU680 (Beckman Coultera, США). Вес органов (мозг, селезенка, сердце, печень, легкие, надпочечники, почки, яички) измеряли на электронных лабораторных весах (Масса-К ВК-150.1, Россия); парные органы взвешивали вместе; рассчитывали весовые коэффициенты внутренних органов (отношение массы органа к массе тела животного, выраженное в процентах).

Полученные результаты обрабатывали с использованием пакета программ Statistica 10.0 (StatSoft, USA). Алгоритм статистического анализа включал этап определения нормальности распределения (с использованием показателей асимметрии, эксцесса, критерия

Колмогорова-Смирнова) и расчет базовых статистических показателей, характеризующих вариационные ряды: рассчитывали медиану (Ме) и межквартильный интервал (IQR). Сравнение полученных результатов проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса, достоверность различий оценивали по критерию Манна-Уитни, разницу принимали как статистически значимую при р<0,05 [3].

Результаты и обсуждение

На протяжении всего исследования ни в одной экспериментальной группе отклонений в состоянии здоровья животных обнаружено не было. У всех крыс была чистая, ухоженная шкурка, видимые слизистые и кожные покровы имели физиологическую окраску, экзофтальма отмечено не было.

Прирост массы тела в исследуемых группах достоверно не отличался от такового в контроле: прибавка массы тела составила в

контрольной группе 16,5 г [11,1-26,2]; в исследуемых группах при введении дозы Н40 1,4 мг/кг - 17,0 г [12,3-25,0], 43,4 мг/кг - 14,0 г [10,0-24,8].

Значения весовых коэффициентов внутренних органов и массы тела экспериментальных животных спустя 24 часа после последнего введения соединения отображены в табл. 2. Небольшая, но статистически значимая разница выявлена в группе, получавшей малую дозу Н40 (1,4 мг/кг) - у животных наблюдался рост весового коэффициента легких на 12,8% по сравнению с группой контроля. Однако данный показатель не превышает показатель нормы, характерный для данного вида животных [9]. Остальные значения весового коэффициента внутренних органов были сравнимы с таковыми контрольных животных (р>0,05).

Таблица 2

Влияние субхронического введения Н40 в дозах 1,4 мг/кг и 43,4 мг/кг на показатели массы тела и весовых коэффициентов внутренних органов крыс-самцов

Показатель Группы

контроль Н40 1,4 мг/кг Н40 43,4 мг/кг

Масса крысы, г 267,5 (231-279) п=8 271 (218-295)п=10 247(234-300) п=9

Весовой коэ( )фициент, %:

сердца 0,44 (0,35-0,46) п=8 0,44 (0,36-0,51) п=9 0,39 (0,34-0,57) п=10

легких 0,61 (0,57-0,70) п=7 0,68* (0,64-0,81) п=8 0,81 (0,57-0,97) п=10

печени 2,96 (2,83-3,34) п=8 3,52 (2,89-3,68) п=9 3,23 (2,60-3,55) п=10

селезенки 0,33 (0,30-0,40) п=8 0,30 (0,28-0,37) п=8 0,31 (0,29-0,33) п=9

почек 0,36 (0,30-0,51) п=8 0,37 (0,28-0,43) п=9 0,34 (0,28-0,46) п=8

надпочечников 0,01 (0,01-0,01) п=7 0,01 (0,01-0,01) п=9 0,01 (0,01-0,01) п=10

семенников 0,60 (0,58-0,73) п=8 0,62 (0,48-0,68) п=9 0,58 (0,55-0,74) п=10

мозга 0,49 (0,47-0,55) п=8 0,52 (0,47-0,7) п=9 0,54 (0,49-0,81) п=10

Примечание. В таблице приведены: медиана (Ме), межквартильный интервал (^Я), п - количество животных (выпадающие значения были исключены). ^Достоверное различие по сравнению с контролем (р<0,05) для критерия Манна-Уитни.

Для определения характера воздействия соединения Н40 на центральную нервную систему изучено его влияние на индивидуальное поведение животных в условиях эмоционального стресса в тесте «открытое поле».

Обнаружено, что соединение Н40 в дозе 1,4 мг/кг статистически значимо не изменяло количество поведенческих элементов «обнюхивание», «перемещение», «норка» и, следовательно, не влияло на ориентировочно- исследовательскую активность крыс; эмоциональная тревожность также сохранялась на уровне контроля. В дозе 43,4 мг/кг исследуемое соединение достоверно увеличивало количество паттернов «стойка с упором», «обнюхивание», «перемещение», «движение на месте» и снижало количество паттерна «сидит». Также статистически значимо увеличивался расчетный показатель «эмоциональная тревожность», что может свидетельствовать о возбуждающем действии исследуемого соединения на цен-

тральную нервную систему в дозе 43,4 мг/кг (рис. 1).

ш контроль —«—Н40 1,4 мг/кг Н40 43 4 мг/кг

Рис. 1. Влияние субхронического введения Н40 в дозах 1,4 мг/кг и 43,4 мг/кг на поведение крыс-самцов в тесте «открытое поле» Примечания: *- различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой для и-критерия Манна-Уитни; **- различия статистически значимы по сравнению с группой, получавшей Н40 в дозе 1,4 мг/кг для и-критерия Манна-Уитни.

Через 24 после последнего введения Н40 не выявлено отклонений в суточном по-

Примечание. На графике отображены медианы и межквартиль-ные интервалы; по оси ординат - количество пищи и воды в г.

Результаты биохимического анализа крови крыс показали, что соединение Н40 не оказывало негативного действия на изученные показатели, достоверных отличий между исследуемыми группами и контрольной группой не обнаружено (табл. 3).

На протяжении всего эксперимента не было зафиксировано непредвиденной гибели животных ни в одной из опытных групп. Все крысы в конце исследования были подвергнуты эвтаназии.

Таблица 3

Влияние субхронического введения Н40 на биохимические показатели крови крыс_

Показатель Группа Me [IQR] n Критерий Краскела-Уоллиса (Н)

Общий белок, г/л Контроль 65,6 [63,0-74,6] n=8 H (2, N= 25) =0,37 p =0,83

Н40 1,4 мг/кг 66,0 [60,5-71,0] n=8

Н40 43,4 мг/кг 66,0 [64,0-71,0] n=9

Мочевина, ммоль/л Контроль 4,35 [4,05-5,0] n=8 H (2, N= 25) =1,06 p =0,58

Н40 1,4мг/кг 4,7 [3,5-5,7] n=8

Н40 43,4мг/кг 5,1 [4,0-6,3] n=9

Креатинин, мкмоль/л контроль 48,9 [44,0-58,5] n=8 H (2, N= 25) =1,30 p =0,52

Н40 1,4мг/кг 48,1 [47,1-56,0] n=8

Н40 43,4мг/кг 52,0 [50,2-54,0] n=9

Глюкоза, ммоль/л Контроль 6,9 [4,9-8,3] n=8 H (2, N= 25) =0,14 p =0,92

Н40 1,4мг/кг 7,2 [6,7-7,8] n=8

Н40 43,4мг/кг 6,6 [5,8-7,6] n=9

Холестерин, ммоль/л Контроль 1,3 [1,2-1,4] n=8 H (2, N= 25) =0,78 p =0,67

Н40 1,4мг/кг 1,3 [1,2-1,7] n=8

Н40 43,4мг/кг 1,2 [1,1-1,5] n=9

Билирубин общий, мкмоль/л Контроль 2,6 [2,3-3,0] n=8 H (2, N= 27) =3,90 p =0,14

Н40 1,4мг/кг 3,2 [2,5-3,5] n=10

Н40 43,4мг/кг 2,5 [2,2-2,8] n=9

Аланинаминотрансфера-за (АЛТ), Ед/л Контроль 63,0 [49,9-76,5] n=8 H (2, N= 26) =0,27 p =0,86

Н40 1,4мг/кг 56,0 [43,9-75,5] n=9

Н40 43,4мг/кг 51,0 [40,0-70,0] n=9

Аспартатаминотрансфе-раза (АСТ), Ед/л Контроль 160,1 [134,9-181,5] n=8 H (2, N= 26) =1,42 p =0,48

Н40 1,4мг/кг 166,2 [151,9-245,0] n=9

Н40 43,4мг/кг 165 [134,0-167,0] n=9

Альфа амилаза, Ед/л Контроль 1297,0[1267,0-1658,0] n=7 H (2, N= 24) =0,75 p =0,68

Н40 1,4мг/кг 1390,1 [1209,1-1555,5] n=8

Н40 43,4мг/кг 1411,0 [1296,0-1728,0] n=9

Щелочная фосфатаза, (ЩФ), Ед/л Контроль 235,8 [195,9-312,0] n=8 H (2, N= 25) =2,02 p =0,36

Н40 1,4мг/кг 182,5 [123,8-249,3] n=8

Н40 43,4мг/кг 200,0 [185,9-229,0] n=9

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ), Ед/л Контроль 1389,2 [1202,9-1874,2] n=8 H (2, N= 25) =0,91 p =0,63

Н40 1,4мг/кг 1341,9 [122,5-2225,5] n=8

Н40 43,4мг/кг 1170,0 [987,4-1469,0] n=9

треблении воды и пищи в экспериментальных группах животных по сравнению с контрольной группой (рис. 2).

?0,(Ю

оо.ио so.no 40,00

30.U0 20.U0 J 0,00 0,00 -10,00

потребление корма

потребление воды

■ контроль ■ Н4и 1,4мг/к[ ■ Н40 43,4ЛЛГ/|<Г Рис. 2. Влияние субхронического введения Н40 в дозах 1,4 мг/кг и 43,4 мг/кг на суточное потребление крысами корма и воды.

Примечание. В таблице приведены: медиана (Ме), межквартильный интервал [IQR], п - количество животных (выпадающие значения исключены).

Заключение

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что субхроническое перо-ральное введение 3-(2-изопропокси-5-метилфенокси)тиетан-1,1 -диоксида независимо от дозы не вызывает гибели животных, не

нарушает функции печени и почек, не изменяет белковый, липидный и углеводный обмены; при введении в дозе 1,4 мг/кг не влияет на функции центральной нервной системы, но оказывает на нее стимулирующее действие при дозе 43,4 мг/кг.

Сведения об авторах статьи: Мифтахова Альбина Флюровна - аспирант кафедры фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 2. E-mail: albmifflu@gmail.com.

Никитина Ирина Леонидовна - д.м.н., доцент, профессор кафедры фармакологии N°1 с курсом клинической фармакологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 2. E-mail: irennixleo@gmail.com. Иванова Ольга Александровна - к.м.н., доцент кафедры фармакологии N°1 с курсом клинической фармакологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 2. E-mail: pharma1olga@yandex.ru.

Кильсенбаева Дина Рафаиловна - врач КЛД ГБУЗ РКБ им. Г.Г. Куватова. Адрес: 450005, г. Уфа, ул. Достоевского, 132. E-mail: kil-dina@yandex.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Вальдман, А.В. Фармакологическая регуляция внутривидового поведения / А.В. Вальдман, В.П. Пошивалов. - М.: Медицина, 1984. - 352 с.

2. Габидуллин, Р.А. Поиск новых антидепрессантов в ряду производных 1,2,4-триазола и тиетан-1,1-диоксида: автореф. дис.... канд. мед. наук. - Уфа, 2009. - 24 с.

3. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М.: Практика, 1998. - 459 с.

4. Изучение антидепрессивной активности и профиля безопасности новых производных тиетан-1,1-диоксида / О.А. Иванова [и др.] // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - Т. 26, № 1-1. - С. 127-131.

5. Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений (утв. Министерством сельского хозяйства РФ 1 декабря 2009 г.). РД-АПК 3.10.07.02-09. - М.: Минсельхоз России, 2009. - 28 с.

6. Компьютерный анализ зависимости структура - антидепрессивная активность в ряду производных 1,2,4-триазола и тиетан-1,1-диоксида / И.Л. Никитина [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46, N°4. - С. 17-22.

7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / А.Н. Миронов (ред.) - М.: ФГБУ «НЦЭМСП» МЗ России, 2012. - 944 с.

8. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №»2008610170 / Р.А. Габидуллин [и др.]. - М., 2008.

9. Проблема нормы в токсикологии (современные представления и методические подходы, основные параметры и константы) / И.М. Трахтенберг [и др]. - М.: Медицина, 1991. - 208 с.

10. Laurence D.R. Evaluation of drug activities. Pharmacometrics / D.R. Laurence, A.L. Bacharach. - London and New York: Academic press - 1964. - 900 p.