CC BY
14
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МЕДИЦИНА
© Важнича О.М. УДК 615
ДО ПИТАННЯ ПРО ДЕЯК1 М0ЛЕКУЛЯРН0-Б10Л0Г1ЧН1 МЕХАН13МИ Д11 2-ЕТИЛ-6-МЕТИЛ-3-0КСИП1РИДИНУ СУКЦИНАТУ
Важнича О.М.
ВДНЗУ «УкраТнська медична стоматологiчна академiя», м. Полтава
Цель исследования - изучить в опытах in vitro влияние 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцината (мексидола) на асимметрию мембран и белки цитоскелета эритроцитов (Эр). 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат прибавляли к тест-системам до концентрации 0,39 мМ. Дизайн эксперимента включал инкубацию Эр в 154 мМ и 77 мМзабуференныхрастворах натрия хлорида с препаратом или без него (контроль) при 37oC в течение 2 часов с последующим электрофорезом белов цитоскелета и цитофлюориметрией. Показано, что в гипотонической среде препарат уменьшает число Эр с нарушенной фосфолипидной асимметрией мембраны по сравнению с контролем. В этих условиях он модифицирует спектрин-актиновый комплекс и вертикальные связи мембрана-цитоскелет, опосредованные анкирином.
Ключевые слова: 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат, мексидол, эритроцит, цитоскелет, асимметрия мембраны.
Робота е фрагментом планово!' 1нЩ1ативноТ НДР «Пошук засоб1в та бюлопчно активних речовин з числа похщних 2-оксошдолу та 3-оксип1ридину для фармакокорекцп адаптивних процеав при порушеннях гомеостазу р1зноТ етюлогп» (№ державно' реестрацп 0111U004879).
Вщомо, що кл1тинна мембрана еритроцит1в е висо-ко динам1чною i модулюеться компонентами цитоске-лету, як1 утворюють пщ мембраною с1тку ф1ламент1в, безпосередньо зв'язаних з ТТ внутр1шньою поверхнею [8]. Кооперац1я мембрани й цитоскелету еритроцит1в зумовлюе Тх форму, еластичн1сть та резистентнють до ушкоджуючих фактор1в [14, 16], тому вона Ытенсивно вивчаеться за умов експериментальноТ та клУчноТ патолог1Т [5, 6, 15]. Теоретичне i практичне значення мають дослщження, що стосуються впливу фармако-лопчних засоб1в на внутр1шню будову еритроцит1в [4, 9]. Оск1льки встановлено, що оксидативний стрес вщь грае значну роль у модифкацп мембрано-цитоскелетного комплексу [11, 12], цтком зрозумто необх1дн1сть вивчення впливу антиоксидант1в на ц1 процеси. До числа таких препарат1в належить 2-етил-6-метил-3-оксип1ридину сукцинат, або мексидол [3].
Дан1 л1тератури й результати попередн1х досль джень показали, що мексидол пщвищуе стмкють ери-троцит1в до гемол1зу, шщшованого механ1чними та осмотичними факторами [3]. Описано, що препарат модиф1куе форму еритроцит1в за умов 1зо- та ппоос-молярност1 [1]. Однак питання про його вплив на аси-метрю мембран та б1лки цитоскелету еритроцит1в ра-н1ше не досл1джувалось.
Мета роботи - вивчити в дослщах in vitro вплив 2-етил-6-метил-3-окситридину сукцинату на асиметрiю мембран та бтки цитоскелету еритроцитiв.
Матерiали i методи досл1дження Експерименти проведенi з використанням кровi 12 iнтактних бтих щурiв-самцiв л1н1Т Вiстар масою 180200 г, як1 утримувались за стандартних умов вiварiю ВДНЗУ «УкраТнська медична стоматологiчна акаде-мiя». Кров одержували пунга^ею порожнин серця пщ ефiрним наркозом за загальноприйнятою методикою [2] й стаб^зували гепарином. Еритроцити, дв1ч1 в1д-митi стерильним iзотонiчним розчином натрiю хлориду (NaCl), суспендували в iзотонiчному (154 мМ) та ппотоычному (77 мМ) розчинах NaCl, забуферених фосфатним буфером до рН=7,4, у стввщношенш 1:2, що вщповщае гематокриту. Згрупування дослiдiв мало наступний вигляд: 1 - еритроцити, суспендован в iзотонiчному розчиш NaCl; 2 - еритроцити, суспендо-ванi в iзотонiчному розчинi NaCl, з додаванням 2-етил-6-метил-3-оксипiридину сукцинату; 3 - еритроцити, суспендоваш в ппотоычному розчинi NaCl; 4 -еритроцити, суспендоваы в ппотоычному розчинi NaCl, iз додаванням 2-етил-6-метил-3-окситридину сукцинату. У кожнiй груп1 було по 3-4 зразки. 2-етил-6-метил-3-окситридину сукцинат додавали до модель-них систем у такш кiлькостi, щоб його концентра^я в проб1 становила 0,39 мМ i вiдповiдала тш, яка можли-ва в органiзмi при введеннi й рiвномiрному розподо ефективноТ дози 100 мг/кг маси. Уа зразки iнкубували 2 години при +37°С i використовували для визначення молекулярно-бюлопчних параметрiв.
Том 16. N 5-6 2012 р.
Стутнь порушення асиметрп мембрани еритроци-TiB оцiнювали за зв'язуванням анексину V з фосфати-дилсерином на зовншнш поверхнi мембранi мембрани еритроциту методом проточно! цитофлуориметрп на проточному цитометрi FACS Calibur фiрми Becton Dickinson (США) [13]. У ходi роботи використовували набiр Annexin V-FITC detection KIT I фiрми BD у вщпо-вiдностi з Annexin V-FITC staining protocol. Для мУмь зацп помилки в пробi аналiзували 500000 подiй. Ре-зультати вимiрювань оцiнювали за допомогою про-грамного забезпечення фiрми BD - CELLQuest Pro.
Тест-системи, що мютять еритроцити в iзо- та ппо-тонiчному середовищi з додаванням 2-етил-6-метил-3-оксипiридину сукцинату або без нього, також використовували для дослщження бтюв цитоскелету чер-вонокрiвцiв. З ^ею метою клiтини пiддавали гемолiзу, вiдмивали строму вiд гемоглобiну i одержували «бiлi тiнi» [10]. Електрофорез бiлкiв проводили в плоских вертикальних полiакриламiдних гелях [10]. Зразки вносили по 20 мкл у ю^рки стартового гелю i роздь ляли при силi струму 25 мА протягом 12-15 годин, пь сля чого одержат гелi фiксували 2 години в 10% роз-чин трихлороцтово! кислоти. Бiлки фарбували Coomassie R-250 при юмнатнш температур! протягом 30 хвилин. ОцЫку вщносного вмюту бтгав проводили
2SQ
г®
1Е0
ioa
ig
за допомогою денситометру та програми для персонального комп'ютера. Iдентифiкацiю бiлкiв здшснюва-ли з використанням набору стандартних маркерних бтгав фiрми Fluka. Статистичну обробку даних здмс-нювали за допомогою комп'ютерннх програм Stat Graphics.
Дослщження асиметри мембран i бiлкiв цитоскелету еритроци^в проведенi на базi вiддiлу крюцито-логп та кiлькiсноí морфологи 1нституту проблем крю-бiологií та крюмедицини НАН Укра!ни, м. Харкiв (зав. вщдту - проф Л.О. Бабмчук) за консультативно! та методично! допомоги проф. Л.О. Бабшчук та к.б.н. П.М. Зубова.
Результата та ix обговорення
Електрофоретичне дослщження показало, що н куба^я еритроцитiв у ппотошчному розчинi NaCl по-значаеться на Ытенсивносп смуг електрофореграм та висот вiдповiдних пiкiв денситограм у порiвняннi з такими для еритроци^в, iнкубованих в iзотонiчному роз-чин NaCl (рис. 1), що свщчить, про порушення взае-модп мiж бiлками мембрано-цитоскелетного комплексу i узгоджуеться з даними лiтератури стосовно ролi ппоосмолярност1 в процесах еритроптозу [11].
до
ж
150
IVO
50
< 6
5
И)
Щ 100 150 200 290 300
io к» 1 SP зч 290 да
"П II I I "I I
Рис. 1. Електрофореграми та денситограми бтюв цитоскелету еритроцит1в при ¡нкубац/Г в ¡зототчному розчин NaCl без препарату (1) та з 2-етил-6-метил-3-оксип1ридину сукцинатом (2); у г1потон1чному розчин NaCl без препарату (3) та з 2-
етил-6-метил-3-оксип1ридину сукцинатом (4).
Внесення в модельн системи 2-етил-6-метил-3-оксипiридину сукцинату створюе вiдмiнностi мiж елек-трофореграмами в дослщних i контрольних зразках, що особливо пом^но за умов ппотошчного середо-вища (див. рис. 1).
Вплив 2-етил-6-метил-3-осип1ридину сукцинату
Результати ктькюного аналiзу денситограм наведено в табл. 1. Вони свщчать, що вмют основних бт-юв цитоскелету еритроцитiв, iнкубованих у iзотонiч-ному розчинi №О! iз додаванням похщного 3-оксипiридину, практично не вiдрiзняeться вiд такого в iзотонiчному середовищi без препарату.
Таблиця 1
идолу) на вмют основних бтюв цитоскелету еритроцит1в в ¡зототчному та гтотонмному середовищ (М±т)
Бтки цитоскелету Вмют б1лк1в цитоскелету залежно вщ модельноТ системи, %
154 мМ розчин ЫаО! 154 мМ розчин ЫаО!+ препарат 77 мМ розчин ЫаО! 77 мМ розчин ЫаО! + препарат
Спектрин-а 11,67±1,7 11,5±1,34 10,52±0,60 12,8±0,53*
Спектрин-р 15,78±1,25 16,03±0,87 18,38±0,57 15,19±0,98*
Анфин 3,98±0,33 3,87±0,56 3,88±0,10 4,24±0,14
Бток смуги 3 15,9±1,3 14,57±0,21 16,22±1,59 15,32±0,3
Бток смуги 4.1 3,6±0,09 3,96±0,28 4,23±0,42 3,90±0,5
Бток смуги 4.2 3,15±0,35 3,20±0,45 3,03±0,49 3,09±0,3
Бток смуги 5 5,91±0,7 5,72±0,67 5,41±0,75 5,29±0,63
Бток смуги 6 1,9±0,21 2,10±0,16 1,87±0,07 1,99±0,11
Бток смуги 7 2,17±0,33 2,24±0,18 2,13±0,16 1,99±0,06
Бток смуги 8 2,83±0,04 2,39±0,27 2,12±0,42 2,30±0,48
Прим1тка:*- р<0,05 у пор1внянн1 з контролем (модельна система без препарату).
Ппотошя середовища викликае тенден^ю до пщ-вищення вмюту спектрину-р (р<0,25) у порiвняннi iз таким у цитоскелет еритроцитiв, iнкубованих в iзото-шчному розчинi ЫаО!, за вiдсутностi Ыших вiрогiдних змiн (див. табл.1). На цьому фон додавання мексидо-лу збтьшуе вмiст спектрину-а на 2,3% (р<0,05), зме-ншуе вмiст спектрину-р на 3,2% (р<0,05) та пщвищуе вмiст анкiрину на 0,4% (р<0,25) за вiдсутностi статис-тично значущих вщмЫностей мiж iншими фракцiями у дослщних та контрольних зразках.
Отже, за умов впливу на еритроцити ппотонп 2-етил-6-метил-3-окситридину сукцинат змЫюе вмiст окремих ключових фракцiй бтгав цитоскелету ерит-роцитiв. З огляду на роль цих бтюв (спектрин, анкь
рин) [8], можна вважати, що виявлен змiни стосуеться спектрин-актинового комплексу та вертикальних зв'язкiв мембрана-цитоскелет, опосередкованих аню-рином.
Графiчнi зображення розподту «подiй» при цито-флюориметричному визначенн зв'язування анексину з V фосфатидилсерином на зовншшй поверхнi мембран мембран еритроцитiв у пробах кожноТ з груп представленi на рис. 2 i демонструють iснування вщ-мiнностей у станi клiтинних мембран як мiж впливом на еритроцити iзотонiТ та гiпотонiТ (рис. 2, проби 1 та 3), так i мiж ним та ефектом похiдного 3-оксипiридину (рис. 2, проби 1 - 2 та 3 - 4).
Рис. 2. Зв'язування анексину з V фосфатидилсерином на зовн/шн/й поверхн мембран/' мембран еритроцит1в (розподл «под1й», цитофлюориметр1я) при ¡нкубац/Г в ¡зототчному розчин ЫэСI без препарату (1) та з 2-етил-6-метил-3-оксип1ридину сукцинатом (2); у г1потон1чному розчин ЫэС1 без препарату (3) та з 2-етил-6-метил-3-оксип1ридину сукцинатом (4).
Показано, що пюля Ыкубацп еритроцитв у i30T0Hi-чному середовищi частка клiтин, як експресують фо-сфатидилсерин на зовшшшй поверхнi мембрани, ста-новить 0,043±0,003%. В аналогiчнiй модельнiй системi i3 додаванням 2-етил-6-метил-3-оксипiридинy сукци-нату цей показник дорiвнюe 0,050±0,001%, тобто мае тенденцю (p<0,1) до збiльшення у порiвняннi з контролем.
Пiсля Ыкубацп еритроцитiв у гiпотонiчномy сере-довищi вмiст клiтин i3 порушеною асиметрiею мембран становить 0,057±0,003%. Це в 1,3 разу бтьше в порiвняннi з iзотонiчним середовищем (p<0,05) i, во-чевидь, може вважатись наслщком ушкоджуючоТ дií низькоТ концентрацп NaCl. За умов гiпотонií iз додаванням похiдного 3-оксипiридинy даний показник становить 0,047±0,002%, що в 1,2 разу менше, нж у кон-тролi (p<0,05).
Таким чином, за умов ппотонп Ыкубацмного сере-довища 2-етил-6-метил-3-оксипiридинy сукцинат сприяе зменшенню кiлькостi еритроцитiв з порушеною асиметрiею мембран, а за умов iзотонií - демонструе протилежну тенденцЮ, що потребуе подальшого дослщження.
Виявленi ефекти 2-етил-6-метил-3-оксипiридинy стосовно асиметрп мембрани та мембрано-цитоске-летного комплексу можуть бути поеднанi в единий механзм, якщо взяти до уваги, що зв'язування спект-рину з фосфатидилхолЫом забезпечуе механiчнy стабiльнiсть мембрани [7]. Вочевидь, модифкуючи спектрин-актиновий комплекс та вертикалью зв'язки мембрана-цитоскелет, опосередкован анкiрином, до-слiджене похiдне 3-окситридину сприяе «утриманню» фосфатидилсерину на внутршшй поверхнi мембрани еритроциту i в такий спосб пiдвищyе резистентнiсть червонокрiвцiв до гiпоосмолярностi, механiчних та те-рмiчних факторiв, що було описано ранше [1, 3]. Екс-периментальна перевiрка цiеí робочоТ гiпотези стано-витиме напрямок наших подальших дослщжень.
Висновки
1. Внесення 2-етил-6-метил-3-оксипiридинy сукци-нату (мексидолу) в гiпотонiчне середовище до концентрацп 0,39 мМ призводить до модифкаци взаемодiй мiж бiлками мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитiв, що стосуеться спектрин-актинового комплексу та вертикальних зв'язкв мембрана-цитоскелет, опосередкованих анкрином.
2. 2-етил-6-метил-3-оксипiридинy сукцинат (0,39 мМ) за умов гiпотонií Ыкубацмного середовища сприяе зменшенню експресп фосфатидилсерину на зовнь шнiй поверхн мембран еритроцитiв.
Лiтература
1. Вплив синтетичного антиоксиданта мексидолу на форму еритроцитв у дослщах in vitro / Л.О. Бабшчук, О.М.
Важнича, О.В. Савельева та [н.] // Св^ медицини i бю-логп. - 2010. - №.1 - С. 6-9.
2. Дошычы дослщження лкарських засобiв: [метод. ре-комендацп / наук. ред. Стефанов О.В.]. - К.: Авiцена, 2001. - 527 с.
3. Дюмаев К.М. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологии ЦНС / К.М. Дюмаев, Т.А. Воронина, Л.Д. Смирнов. - М.: Изд. Ин-та биомедицинской химии РАМН, 1995. - 272 с.
4. Землянских, Н.Г. Изменения в мембранно-цитоскелетном комплексе эритроцитов, индуцированные диметилсульфоксидом, полиэтиленгликолем и низкой температурой / Н.Г. Землянских, О.Н. Денисова. - // Биофизика. - 2009. - Т.54, №4. - С.693-703.
5. Сибiрна Н.О. Порушення спектра проте'жв мембран еритроцитв при цукровому дiабетi 1-го типу / Н.О. Си-бiрна, Т.В. Буслик // Укра'нський бiохiмiчний журнал -2009. - Т. 81, №6. - С. 94-103.
6. An X. Disorders of red cell membrane / X An, N. Mohandas // British Journal of Hematology. - 2008. - Vol. 141, № 3. - P. 367-375.
7. Bennett V. Organizing the fluid membrane bilayer: diseases linked to spectrin and ankyrin / V. Bennett, J. Healy // Trends in Molecular Medicine. - 2008. - Vol. 14, №1. - P. 28-36.
8. Burton N.M. Modeling the structure of the red cell membrane / N.M. Burton, L.J. Bruce // Biochemistry and Cell Biology. - 2011 - Vol. 89, № 2. - P. 200-215.
9. Dos Santos J.L Recent insights on the medicinal chemistry of sickle cell disease / JL Dos Santos, C.M. Chin // Current Medical Chemistry. - 2011. - Vol. 18, № 15. - P.2339-2358.
10. Fairbanks G. Electrolytic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane / G. Fairbanks, T.L. Steсk, D.F. Wallach // Journal of Biochemistry. - 1971. - Vol. 10. - P.2606-2617.
11. Föller M. Erythrocyte programmed cell death / M. Föller, S.M. Huber, F. Lang // International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life. - 2008. - Vol. 60, № 10. - P. 661-668.
12. Kriebardis A.G. Progressive oxidation of cytoskeletal proteins and accumulation of denatured hemoglobin in stored red cells / A.G. Kriebardis, M.H. Antonelou, K.E. Stamoulis [et al.] // Journal of Cell Molecular Medicine. - 2007. - Vol. 11, № 11. - P.48-55.
13. Kuypers F.A. Detection of altered membrane phospholipid asymmetry in subpopulations of human red blood cells using fluorescently labeled annexin V / F.A. Kuypers, R.A. Lewis, M. Hua // Blood. - 1996. - Vol. 87, № 3. - P.1179-1187.
14. Mohandas N. Red cell membrane: past, present, and future / N. Mohandas, P.G. Gallagher //Blood. - 2008. - Vol. 112, № 10. - P. 3939-3948.
15. Phenylhydrazine as a partial model for beta-thalassaemia red blood cell hemodynamic properties / Y. Ramot, A. Koshkaryev, A. Goldfarb [et al.] // British Journal of Haematology. - 2008. - Vol.140, № 6. - P. 692-700.
16. The cooperative role of membrane skeleton and bilayer in the mechanical behaviour of red blood cells / S. Svetina, D. Kuzman, R.E. Waugh [et al.] // Journal of Bioelectro-chemistry. - 2004. - Vol. 62. - P. 107-113.
Summary
ON SOME MOLECULAR-BIOLOGICAL MECHANISMS OF 2-ETHYL-6-METHYL-3-OXYPYRIDINE SUCCINATE ACTION
O.M. Vazhnycha
Key words: 2-ethyl-6-methyl-3-oxypyridine succinate, mexidol, red blood cell, cytoskeleton, membrane asymmetry.
The purpose of the research is to study the influence of 2-ethyl-6-methyl-3-oxypyridine succinate (mexidol) on red blood cells (RBC) membrane asymmetry and cytoskeleton proteins in the "in vitro" experiments. 2-ethyl-6-methyl-3-
oxypyridine succinate was added to test-systems in the concentration of 0,39 mM. A design of experiment included the incubation of RBC in 154 mM and 77 mM solutions of sodium chloride with medication or without it (control) at 37oC for 2 hours with following electrophoresis of cytoskeleton proteins and cytofluorimetry. It is shown that in hypotonic medium, the preparation decreases the count of RBC with altered membrane phospholipid asymmetry as compared to control. Under these conditions it modifies spectrin-actin complex and vertical membrane-cytoskeleton bonds intermediated by ankyrin.
Higher State Educational Establishment of Ukraine "Ukrainian Medical Stomatological Academy", Poltava
Mamepiaë Hadiumoe do pedaKU,ii 07.06.2012p.
