CC BY
56
УДК 579:546.56:581.1:633.1
Короткова А.М., Лебедев С.В., Русакова Е.А.
Оренбургский государственный университет E-mail: [email protected]
ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ НАНОЧАСТИЦ N1° И NIO В РАСТЕНИЯХ ВИДА TRITICUM VULGARE
Изучено влияние сферических наночастиц никеля Ni° размером 70±0,3 нм и оксида никеля NiO 94±0,3 нм в трех разведениях - 0,025, 0,05 и 0,1 М на корневую часть 4-х дневных проростков пшеницы Triticum vulgare. После 48 часовой инкубации растений с наночастицами регистрировалось дозозависимое увеличение фрагментации ДНК. Электрофоретическое разделение ДНК показало изменение подвижности с позиции уменьшения суммы содержания фрагментов формы I (более 1000 н.п.) и переход основной массы ДНК во фрагменты из легкоподвижных нуклеотидов (форма II - менее 1000 н.п.). Так, при воздействии НЧ Ni° и NiO в концентрациях 0,025-0,1 М происходило увеличение фрагментов формы II на 53-59% и на 55-59,8% с одновременным снижением формы I на 16,6-20,9% и 15,6-22%, относительно контроля соответственно. Рассчитанный по результатам электрофореграммы коэффициент повреждения ДНК в случае с 0,025, 0,05 и 0,1 М наночастиц никеля составлял 1,052±0,009, 1,126±0,04з и 1,2±0,03, а с наночастицами оксида никеля -0,982±0,02,1,053±0,013 и 1,192±0,21 (на фоне контроля 0,398±0,05), соответственно. Линейный профиль электрофореграмм ДНК свидетельствовал, что наночастицы в малых концентрациях (0,025 и 0,05 М) вызывают системную деградацию ДНК до дискретных фрагментов из легкоподвижных нуклеотидов с переходом основной массы ДНК в область менее 1000 н.п., а концентрация 0,1 М вызывает появление апоптозной «лесенки», представленной группой расщепленных пиков, расположенных по убыванию площади, в которых количество ДНК кратно 180 н.п.
Ключевые слова: Triticum vulgare - наночастицы никеля - активные формы кислорода - окислительный стресс - деградация ДНК.
Современный интерес к применению на-нотехнологий определил необходимость моделирования экологического прессинга данного вида металлов на организм. Это связано с тем, что растворение наноматериалов приводит к загрязнению окружающей среды: при попадании в воздух и воду диспергированные наночастицы (НЧ) могут образовывать устойчивые во времени аэрозоли и агрегаты, которые с помощью различных механизмов могут попадать в почву и другие компоненты экологической системы. Малый размер обуславливает способность НЧ проникать через биологические барьеры и ускользать из под контроля регуляторной системы живых организмов [1]. Исследования действия ионов металлов на клетки начали проводиться уже давно, а вот токсичностью на-ночастиц металлов на растения - как удобных тест-объектов - стали заниматься лишь в последние 10 лет. В большинстве научных работ в основном рассматривается влияние наиболее распространенных промышленно производимых наноматериалов на основе металлов и их оксидов на показатели всхожести и параметры роста растений [2], [3], и практически отсутствуют отдельные исследования, посвященные проблеме цитотоксических эффектов наноформ металлов переменной валентности. Именно
НЧ металлов переходных валентностей способны непосредственно взаимодействовать с окислительно-восстановительными орга-неллами и стимулировать выработку АФК в клетках, что показано во многих работах [4]. Представленный научный задел подтверждает целесообразность глубокого изучения экологической безопасности и выяснения формирования цитогенетических эффектов именно подобного рода НЧ металлов.
Методология проведенных исследований заключалась в использовании обработанных 0,025, 0,05 и 0,1 М наночастицами Ni° (размер 70±0,3 нм, Z-потенциал 25±0,5 мВ) и NiO (размер 94±0,3 нм, Z-потенциал 29±0,5 мВ) семян Triticum vulgare, пророщенных в климатической камере без освещения и температуре 22±1 °С в течение 2 суток. После 48 часовой инкубации корневую часть растений длиной 1-1,5 см использовали для анализа межнуклеосомной деградации ДНК [5]. Для исследования предварительно выделяли фракцию тотальной ДНК согласно протоколу набора реагентов «ДНК-Экстран-3» («Синтол», Россия), концентрацию полученных растворов определяли спектрофотометрически по соотношению поглощения 260/280 нм. Опытным путем нами определено, что больший выход
«Проблемы экологии Южного Урала»
ДНК и щадящий режим измельчения сырья, без дополнительного повреждения молекул до фрагментов менее 500 н.п., перекрывающих визуализацию фрагментации под влиянием наночастиц, достигается не растиранием в ступке с жидким азотом, а встряхиванием в течение 60 сек при частоте 25 Гц на гомогенизаторе «TissueLyser LT». Разделение и анализ ДНК фрагментов проводили методом горизонтального электрофореза в 1%-ной универсальной агарозе типа I в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве стандарта молекулярной массы фрагментов ДНК использовали 1 мкл 10 Kb ДНК маркера, состоящий из смеси 13 фрагментов плазмид длиной от 250 до 10000 н.п. В качестве электролита использовали трис-боратный буфер (pH 7,2). Электрофорез проводили при напряжённости 5 В/см геля и силе тока 200 мА, задаваемыми источником питания SE-1 («Helicon», Россия), в течение 1 часа. ДНК регистрировали по люминесценции в ультрафиолетовом свете с помощью трансиллюминатора и системы видеодокументации гелей Gel Imager-2. Полученные цифровые изображения обрабатывали с помощью программы «ImageJ». Коэффициент ДНК-повреждающего эффекта НЧ рассчитывали по соотношению совокупности фрагментов менее 1000 пар оснований (форма П) к фрагментам более 1000 пар оснований (форма I). Лабораторные опыты проводили в 3-х кратной биологической повторности.
Электрофоретическое разделение ДНК, выделенной из корней проростков пшеницы пос-
ле обработки 0,025-0,1 М никельсодержащими наночастицами, показало изменение подвижности с позиции уменьшения суммы содержания наименее мигрирующих в агарозном геле и наиболее близко расположенных к старту фрагментов конформации I (более 1000 н.п.), составляющих наибольшее количество в составе контрольных образцов, и переход основной массы ДНК во фрагменты из легкоподвижных нуклеотидов (форма II - менее 1000 н.п.).
В количественном соотношении эффект наночастиц с позиции изменения топологии и повреждения ДНК имел дозозависимый характер, и усиливался с увеличением содержания металлов в среде. Так, при воздействии НЧ №° и №0 в концентрациях 0,025-0,1 М происходило увеличение фрагментов менее 1000 н.п. (форма II) на 53-59% (Р<0,01) и на 5559,8% (Р=0,05) с одновременным снижением формы I на 16,6-20,9% и 15,6-22%, относительно контроля соответственно (Р<0,05). Отметим, что с внесением небольших концентраций наночастиц (0,025 и 0,05 М) не было видно значительных изменений, за исключением слабого свечения фрагментов массой более 1000 н.п. и, по структуре приближающегося к варианту с водой (рис. 1А).
Рассчитанный по результатам электро-фореграммы коэффициент повреждения ДНК в случае с 0,025, 0,05 и 0,1 М наночастиц никеля составлял 1,052±0,009, 1,126±0,043 и 1,2±0,03, а с наночастицами оксида никеля -0,982±0,02, 1,053±0,013 и 1,192±0,21 (на фоне контроля 0,398±0,05), соответственно (Р<0,05).
Рисунок 1. А. Содержание ДНК, выделенной из апикальной части корней Triticum vulgare, инкубированных с НЧ Ni° и NiO в концентрациях 0,1, 0,05 и 0,025 М: К - контроль, дистиллированная вода; значения показывают общую площадь свечения конформации ДНК > 1000 н.п. (форма I) и < 1000 н.п. (форма II) в% от контроля. Б. Линейные профили интенсивности полос электрофореграммы ДНК T. vulgare после 48-часовой инкубации с НЧ Ni° и NiO. Достоверность значений Р<0,05
VII Всероссийская научно-практическая конференция
Линейный профиль электрофореграмм ДНК растений, обработанных концентрациями 0,025 и 0,05 М наночастиц, представлял собой плавно спускающуюся кривую, похожую на контрольный вариант, но со слабой деградацией в виде нескольких небольших пиков (данные не представлены). Однако с увеличением концентрации вносимых НЧ до 0,1 М ДНК-повреждающий эффект становится настолько заметным, что возрастает общая интенсивность электрофореграммы, а линейный профиль представляет собой суперпозицию расщепленного на интенсивные разрешенные пики светимости вследствие смены изоэлектрической точки и перехода в терминальную фазу с неспецифической и глубокой деградацией нуклеазами в более легкоподвижные и легкие нуклеотиды размером менее 300 тыс. н.п. Подобная картина является признаком типичного апоптоза, а именно появление характерной «лесенки», представленной группой пиков, расположенных по убыванию площади, в которых количество ДНК кратно 180 н.п. (рис. 1Б). Интрануклеосомное расщепление при апоптозе происходит ступенчато под действием индуцированных различными факторами (например, каспазами), эндонуклеаз, которые
атакуют хроматин в областях относительно протяженных розеточных петель (доменов) с высвобождением 50-300 kb фрагментов [5].
Настоящее исследование показало, что наночастиц как никеля, так и его оксида способствуют развитию генетических повреждений пшеницы. Так, никельсодержащие наночастицы в малых концентрациях вызывают системную деградацию ДНК до дискретных фрагментов менее 1000 н.п. Напротив, наноформы никеля в концентрации 0,1 М, вероятно, запускают механизмы апоптоза [5]. Сравнивая эффекты никеля и оксида никеля между собой стоит отметить, что НЧ никеля, имеющие электронейтральный заряд, вполне возможно, могут легко диффундировать через ядерные поры и вызывать повреждение генетического материала прямым взаимодействием с ДНК [7], блокировать функций аквапоринов и тем самым вызывать гибель клеток. Напротив, геноток-сический эффект НЧ оксида никеля, вероятно, реализуется за счет электростатического взаимодействия положительно заряженных ионов никеля Ni2+, высвобожденных из их матрикса частицы, и фосфатными группами полианиона ДНК, а также выделяемыми HO^ радикалами в цикле Хабера-Вейсса [3].
5.09.2015
Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта РНФ соглашение №14-36-00023 от 15.09.2014 г. и Государственного задания №342 от 01.02.2014 г.
Список литературы:
1. Du W., Sun Y., Ji R., Zhu J., Wu J., Guo H. TiO2 and ZnO nanoparticles negatively affect wheat growth and soil enzyme activities in agricultural soil // J. Environ. Monit. - 2011. - №13. - P. 822-828.
2. Lebedev S.V., Korotkova A.M., Osipova E.A. Influence of Fe° nanoparticles, magnetite Fe3O4 nanoparticles, and iron (II) sulfate (FeSO4) solutions on the content of photosynthetic pigments in Triticum vulgare // Russian Journal of Plant Physiology. - 2014. - V. 61. - №4. - Р. 564-569.
3. Siddiqui M.H., Al-Whaibi M.H., Mohammad F. Nanotechnology and plant sciences: nanoparticles and their impact on plants. New York: Springer, 2015. 305 p.
4. Rico C.M., Morales MI, McCreary R et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings // Environ Sci Technol. - 2013. - №47. - Р. 14110-14118.
5. Ванюшин Б.Ф. Апоптоз у растений // Успехи биологической химии. - 2001. - Т. 41. С. 3-38.
6. Kinsella J.M., Ivanisovie A. Fabrication of powdered metallic and magnetic heterostructured DNA-nanoparticle hybrids // Colloids surf. Biointerfaces. - 2008. - V. 63(2). - P. 296-300.
Сведения об авторах:
Короткова Анастасия Михайловна, аспирант, научный сотрудник Института Биоэлементологии Оренбургского государственного университета, e-mail: [email protected]
Лебедев Святослав Валерьевич, заведующий лабораторией Института Биоэлементологии Оренбургского государственного университета, доктор биологических наук, e-mail: [email protected]
Русакова Елена Анатольевна, младший научный сотрудник Института Биоэлементологии Оренбургского государственного университета, e-mail: [email protected]
