ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций яблонной плодожорки и хлопковой совки по микросателлитным локусам Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 575.595:577.633

ДНК-ПОЛИМОРФИЗМ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПОПУЛЯЦИЙ ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ И ХЛОПКОВОЙ СОВКИ ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ

Киль Владимир Ильич к.с.-х.н

ВНИИ биологической защиты растений Россельхозакадемии, Краснодар, Россия

По двум микросателлитным локусам (HaSSR1, HaSSR3) проведен ПЦР анализ Краснодарской популяции хлопковой совки. Проведен также молекулярно-генетический анализ (SSR-PCR) различных географических популяций яблонной плодожорки по трем микросателлитным локусам Ср1.63; Ср2.39 и Ср2.157. На основании частот встречаемости ДНК-маркеров описана молекулярногенетическая структура и оценено генетическое разнообразие популяций вредителей

Ключевые слова: ХЛОПКОВАЯ СОВКА, ЯБЛОННАЯ ПЛОДОЖОРКА, ПОЛИМОРФИЗМ, ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, МИКРОСАТЕЛЛИТЫ, ПОПУЛЯЦИЯ, НАСЕКОМЫЕ, ДНК, ПЦР

UDC 575.595:577.633

DNA POLYMORPHISM AND GENETIC DIVERSITY OF CODLING MOTH AND BOLLWORM POPULATIONS BY MICROSATELLITE LOCI

Kiel Vladimir Ilyich Cand. Agr. Sci.

All-Russian Research Institute of Biological Plant Protection of RAAS, Krasnodar, Russia

Using two microsatellite loci (HaSSR1, HaSSR3), the PCR analysis of the bollworm Krasnodar population was conducted. Molecular-genetic analysis (SSR-PCR) of different geographic codling moth populations by three microsatellite loci Ср1.63; Ср2.39 u Ср2.157 was conducted also. Based on the assessment of the frequencies of occurrence of DNA markers, the molecular-genetic structure was described and genetic diversity in the pest populations was estimated

Keywords: BOLLWORM, CODLING MOTH, POLYMORPHISM, GENETIC DIVERSITY, MICROSATELLITE LOCI, POPULATION, INSECTS, DNA, PCR

Изучение генетики популяций сельскохозяйственно-значимых

вредных насекомых имеет большое значение в понимании миграционных процессов и потока генов при мониторинге вредителей [1,2]. Для успешного контроля численности таких вредителей сельскохозяйственных растений, как хлопковая совка Helicoverpa armigera Мп. (Lepidoptera:Noctшdae) и яблонная плодожорка, Cydia pomonella ^.) (Lepidoptera: Tortricidae), необходимо всестороннее изучение изменчивости генетической структуры популяций этих видов насекомых, в том числе и на молекулярном уровне. Оценка изменчивости молекулярно-генетической структуры популяций насекомых будет способствовать также более полному пониманию микроэволюционных процессов, связанных с адаптивностью насекомых к инсектицидам и другим стрессовым факторам внешней среды.

Несмотря на экономическую значимость данных видов вредителей, очень мало сегодня известно о генетической структуре популяций яблонной плодожорки и хлопковой совки, что является важным аспектом по созданию стратегии контроля их численности. Проведение молекулярно-генетического анализа популяций C. pomonella с использованием кодоминантных маркеров, таких как микросателлиты (SSR, simple sequence repeat) стало возможным благодаря исследованиям последних лет [3,4]. Так, сконструированные французскими учеными для яблонной плодожорки SSR-праймеры [4], позволили проанализировать молекулярно-генетическую структуру популяций C. pomonella по микросателлитным локусам во Франции [5] и Чили [6].

ПЦР анализ популяций хлопковой совки, H. armígera, по микросателлитным локусам стал возможен, благодаря созданию и идентификации специфических для этого вида SSR-маркеров [7-10]. С использованием данных маркеров SSR-анализ хлопковой совки, Helicoverpa armigera, проводили исследователи из Индии [11]. В работе индийских авторов была исследована генетическая структура различных популяций H. armigera. Авторы обнаружили строгую генетическую дифференциацию популяций насекомых, собранных с различных видов растений.

В задачу наших исследований входила оценка молекулярногенетического полиморфизма и генетического разнообразия краснодарской популяций хлопковой совки и ряда географических популяций яблонной плодожорки по SSR-маркерам.

Методика. Объектом исследований явились выборки из краснодарской популяции хлопковой совки и различных географических популяций яблонной плодожорки из Украины (две выборки: гг.Киев и

Мелитополь) и России (четыре выборки: гг. Краснодар, Ейск, Ставрополь и Санкт-Петербург). Выделение ДНК из насекомых проводили СТАВ-методом по протоколам описанным нами ранее [12].

SSR-PCR проводили в конечном объеме 12,5 мкл, содержащем 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2 , 50 цМ каждого dNTP, 0,4цМ каждого из праймеров, 0,5 U Га^ДНК полимеразы (Диалат ЛТД, Москва) и 10-50 ng ДНК, на термоциклере iCycler (BioRad) с предварительной денатурацией (940С 2 мин) в режиме: денатурация - 940С 30с, отжиг праймера - 580С 40с, элонгация - 720С 40с (35 циклов), конечный синтез -720С 3 мин.

В SSR-PCR хлопковой совки использовали две пары микросателлитных праймеров HaSSR1 (мотив повтора

(TTGC)2GAT(TGY)4GAT(TGY)35), HaSSR3 (мотив повтора (TCA)6) [11]. В ПЦР анализе яблонной плодожорки использовали три пары микросателлитных праймеров Ср1.63 (мотив повтора (GA)19), Ср2.39 (мотив повтора (ТС)4АС(ТС)11) и Ср2.157 (мотив повтора (GA)10) [4]. Наиболее высокое соотношение нулевых аллелей (более 50%) было отмечено для локуса Ср2.157, поэтому он был исключен из дальнейшего анализа.

Продукты SSR-PCR разделяли в 8% полиакриламидном геле (ПААГ), длиной 20 см, толщиной 1 мм, при напряжении 300 В. Визуализацию ампликонов, после предварительного окрашивания бромистым этидием, проводили в УФ на трансиллюминаторе ECX-20.M (Vilber Lourmat). Генетическое разнообразие по Шеннону оценивали в популяциях яблонной плодожорки согласно [13], в популяции хлопковой совки - по Nei и Shennon, из пакета компьютерных программ POPGENE 32, version 1.31 (Francis C.Yeh).

Результаты.

Результаты ПЦР анализа ДНК хлопковой совки по двум микросателлитным локусам приведены на рисунке 1 и в таблице 1.

M

HaSSRl

И

м

as

П.н

395

318

216

195

164

i?

HaSSR2

М

П *-

395

318

* I

- • . . и - **

- tí «и wé

%ф а м ы м

216

195

164

Рисунок 1 - SSR-фенотипы хлопковой совки. Электрофореграмма ампликонов H. armígera в 8% ПААГ (ПЦР анализ по двум микросателлитным локусам HaSSR1 и HaSSR3). М-маркеры молекулярных масс, пар нуклеотидов (п.н.).

Таблица 1 - ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяции H. armígera по двум микросателлитным локусам

Локус Показатель

Р Sr A Ar N Ht h I

HaSSR1 100 230-480 12 2,9 0,05 0,75 0,19 ±0,16 0,32 0,20±

HaSSR3 100 100-220 9 2,7 0,05 0,75 0,23 ±0,17 0,37 ±0,21

Sr - размеры ДН К-фрагментов, п.н. (пар нуклеотидов)

А - число аллелей

Аг - обогащенность аллелями (allelic richness) - средняя частота аллелей на особь

N - доля нулевых гомозигот

Ш - доля гетерозагот

Ь - генетическое разнообразие по №і (± стандартное отклонение)

I - индекс Шеннона (± стандартное отклонение)

Р- уровень полиморфизма,%

Размеры детектируемых ДНК-фрагментов варьировали от 230 до 480 пар нуклеотидов (п.н.) для Ыа88Я1 и от 100 до 220 п.н. - для Ыа88Я3. Оба локуса были высоко полиморфны (уровень полиморфизма 100%). Число детектируемых аллелей (вне зависимости от интенсивности ДНК-фрагментов) на локус составило 12 и 9 для Ыа88Я1 и Ыа88Я3, соответственно. Доля гетерозигот для обоих локусов была равна 0,75.

Полученные нами данные по генетическому полиморфизму популяции хлопковой совки в целом совпадали с данными полученными ранее на индийских популяциях [11]. Так, в частности, локус Ыа88Я1, выявлял большее количество аллелей, по сравнению с Ыа88Я3.

В то же время полиморфизм индийских популяций H. аrmigera по локусу Ыа88Я3 составлял только 50% (против 100% в наших опытах) и было выявлено только 4 аллеля, против 9 по нашим данным, что, вероятно, связано с генетическими особенностями столь географически отдаленных друг от друга популяций.

Молекулярно-генетическую структуру популяции хлопковой совки описывали по частотам встречаемости 88Я-маркеров (таблица 2).

Таблица 2 - Частоты встречаемости 88Я-маркеров в популяции хлопковой совки

Аллель локуса Ыа88Ю (п.н.) Частота встречаемости Аллель локуса Ыа88Ю (п.н.) Частота встречаемости

480 0,03 220 0,08

460 0,08 200 0,08

440 0,19 195 0,03

420 0,19 185 0,05

410 0,11 175 0,26

395 0,03 170 0,11

355 0,03 120 0,05

320 0,05 105 0,37

300 0,05 100 0,61

265 0,05

245 0,55

230 0,34

Можно заметить, что из 12 аллелей локуса Ыа88Я1 наиболее часто встречались аллели 245 и 230 п.н., а локуса Ыа88Я3 - аллели размером100 и 105 п.н.

Таким образом, Краснодарская популяция хлопковой совки генотипирована по двум микросателлитным локусам, что может явиться основой для дальнейших генетико-популяционных исследований данного вида насекомых.

Результаты ПЦР анализа ДНК яблонной плодожорки по двум микросателлитным локусам представлены на рисунке 2. Размеры детектируемых ДНК-фрагментов варьировали от 100 до 370 пар нуклеотидов (п.н.) для Ср1.63 и от 100 до 480 п.н. - для Ср2.39.

Рисунок 2 - 88Я-фенотипы яблонной плодожорки. Электрофореграмма ампликонов C. pomonella в 8% ПААГ (ПЦР анализ по двум микросателлитным локусам Ср 1.63 и Ср2.39). М- маркеры молекулярных масс, пар нуклеотидов (п.н.).

По всем популяциям в целом, оба локуса были высоко полиморфны (уровень полиморфизма 100%). Среднее количество аллелей на локус составило 2,3 и 3,2 для Ср1.63 и Ср2.39, соответственно. Доля гетерозигот в среднем по всем популяциям для обоих локусов была равна 0,57 (таблица 3).

ПЦР анализ ДНК насекомых из Украины (две выборки: Киев и Мелитополь) и России (четыре выборки: Краснодар, Ейск, Ставрополь и Санкт-Петербург) выявил значительные отличия в молекулярно-генетической структуре популяций C.pomonella. Среди выборок из разных стран наиболее гетерогенны были выборки из Украины: в среднем по локусам индекс Шеннона (Н) =6,4 и 6,3, для Киева и Мелитополя; и наименьшим генетическим разнообразием характеризовались выборки из России (Ейск и

Таблица 3 - Генетический полиморфизм и генетическое разнообразие в различных выборках из географических популяций C.pomonella по двум микросателлитным локусам

Локус Пок азат ель Выборка По всем популяц иям

Краснод ар Ейск Ставропо ль С. Петер бург Киев Мелито поль

Ср.1.63 Sr 110-320 110-310 110-160 100-260 100-370 100-350 100-370

A 20 11 7 15 30 24 43

Ar 2,9 1,7 1,0 1,8 3,0 3,2 2,3

N 0,10 0 0,20 0,15 0,10 0 0,09

Ht 0,80 0,45 0,10 0,60 0,65 0,80 0,57

H 4,5 2,9 1,9 3,3 6,3 5,2 4,0

Ср.2.39 Sr 100-460 190-240 200-250 100-460 100-480 100-480 100-480

A 29 7 16 16 24 25 45

Ar 4,1 0,9 1,1 1,3 4,3 7,3 3,2

N 0,05 0,40 0,70 0,25 0,05 0 0,24

Ht 0,75 0,20 0,20 0,45 0,80 1,00 0,57

H 7,3 1,7 2,8 3,4 6,4 7,5 4,9

Sr - размеры ДН К-фрагментов, п.н. (пар нуклеотидов)

A - число аллелей

Ar - обогащенность аллелями (allelic richness) - средняя частота аллелей на особь

N - доля нулевых гомозигот

Ht - доля гетерозагот

H - генетическое разнообразие по Шеннону (1992)

Ставрополь, Н=2,3 и 2,4, соответственно). Снижение генетического полиморфизма и гетерогенности популяций C.pomonella из России, вероятно, связано с большей пестицидной нагрузкой на фруктовые сады.

Работа выполнена при поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края (грант № 09-04-96514).

Благодарности: автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. О.Д. Ниязову (ВНИИБЗР, г. Краснодар), к.б.н. Л. В. Розовой (институт орошаемого садоводства им.М.Ф. Сидоренко, г.Мелитополь), д.б.н. Т.М. Неверовской (Институт защиты растений УАН, г.Киев), д.б.н. И.Я. Гричанову, к.б.н. Е.И. Овсянниковой (ВИЗР, г. Санкт-Петербург) за предоставленный биоматериал.

Список литературы

1. Scott, L.J., Lawrence, N., Lange, C.L., et al. Population dynamics and gene flow of Helicoverpa armígera (Lepidoptera: Noctuidae) on cotton and grain crops in the Murrumbidgee Valley, Australia // J. Econ. Entomol. 2006. Vol.99. P.155-163.

2. Endersby, N.M., Hoffmann, A.A., McKechnie, S.W., Weeks, A.R. Is There genetic structure in populations of Helicoverpa armigera from Australia? // Entomol. Exp. Appl. 2007. Vol.122. P.253-263.

3. Zhou Y., Gu H., Dorn S. Isolation of microsatellite loci in the codling moth, Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) // Molecular Ecology Notes. 2005. Vol.5. P.226-227.

4. Franck P., Guérin F., Loiseau A., Sauphanor B. Isolation and characterization of microsatellite loci in the codling moth Cydia pomonella L. (Lepidoptera, Tortricidae) // Molecular Biology Notes. 2005. Vol.5. N 1. P. 99-102.

5. Franck P., Reyes М., Olivares J., Sauphanor В. Genetic architecture in codling moth populations: comparison between microsatellite and insecticide resistance markers // Mol. Ecology. 2007. Vol.16. P. 3554-3564.

6. Fuentes-Contreras E., Espinoza J.L., Lavandero B., Ramírez C.C. Population Genetic Structure of Codling Moth (Lepidoptera: Tortricidae) from Apple Orchards in Central Chile // Journal of Economic Entomology. 2008. Vol.101. N 1. P.190-198.

7. Ji Y.J, Wu Y.C, Zhang D.X. Novel polymorphic microsatellite markers developed in the cotton bollworm Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) // Insect Science. 2005. V.12. P.331 - 334.

8. Ji Y. J., Zhang D. X., Hewitt G. M., Kang L., Li D. M. Polymorphic microsatellite loci for the cotton bollworm Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and some remarks on their isolation. // Molecular Ecology Notes. 2GG3. Vol. 3. N 1. P. 1G2-1G4.

9. Scott, K.D, Lange, C.L, Scott, L.J, Graham, G.C. Isolation and characterization of microsatellite loci from Helicoverpa armigera. Hübner (Lepidoptera: Noctuidae) // Molecular Ecology Notes. 2GG4. V. 4. P.2G4-2G5.

1G. Tan S, Chen X, Zhang A, Li D. Isolation and characterization of DNA microsatellites from cotton bollworm (Helicoverpa armigera. Hübner) // Molecular Ecology Notes. 2GG1. V.l. P.243-244.

11. Subramanian S., Mohankumar S. Genetic variability of the bollworm, Helicoverpa armigera, occurring on different host plants // Journal of Insect Science, 2GG6. Vol.6. P.26, available online: insectscience.org/6.26.

12. Киль В.И. Методика оценки ДНК полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR) // Методические рекомендации. «ООО Просвещение-Юг». Краснодар. 2GG9. 16 с.

13. Chalmers, K.J., Waugh J.I., Sprent A.J., Simons A.J., Powell W. Detection of genetic variation between and within populations of Gliricidia sepium and G.maculata using RAPD markers // Heredity. 1992. V.69. P.465-472.