CC BY
204
© 2001, СПб РО РА АКИ_______________________________________________________________________
ДНК КАК ИММУНОСТИМУЛЯТОР (обзор литературы)
Серебряная Н. Б., Новик А. А.
Кафедра гематологии и клинической иммунологии,
Воєнно-медицинская академия, Санкт-Петербург
Резюме. Специфические последовательности нуклеотидов распознаются иммунокомпетентными клетками и могут оказывать как стимулирующее, так и угнетающее действие на иммунную систему. Расшифровка иммуно-стимуляторной роли CpG-мотивов в бактериальной ДНК определила создание синтетических олигодезоксинук-леотидов, обладающих контролируемыми иммуномодулирующими свойствами, что открыло путь к созданию нового класса иммуностимуляторов. Клиническое использование препаратов на основе иммуностимулирующих олигодезоксинуклеотидов может начаться уже в ближайшие годы. Иммуномодулирующие свойства высокополимерных молекул ДНК, полученных из молок осетровых и лососевых рыб, не связаны, по-видимому, с наличием CpG-динуклеотидов. Имеющийся экспериментальный и клинический материал свидетельствует о наличии иммуностимулирующего потенциала этих молекул и эффективности их использования (как изолированного, так и сочетанного с другими иммуномодуляторами) для коррекции иммунопатологических состояний. Дальнейшее углубленное изучение иммунотропных эффектов высокополимерных молекул ДНК определяется необходимостью выявления активного начала и механизмов действия этих препаратов.
Ключевые слова: ДНК, иммуномодуляция, иммуностимулятор, CpG-динуклеотиды, деринат.
Serebrianaya N.B., Novik А.А.
DNA AS IMMUNOSTIMULATOR
Abstract. The specific sequences of nucleotides are recognized by immunocompetent cells and can act as stimulator or suppressor agents of the immunocompetent cells. The definition of the immunostimulating role of CpG-motives in bacterial DNA caused the creation of synthetic oligodesoxynucleotides with immunomodulating characteristics. This opened the way to the creation of a new class of immunostimulators. In foreseeable future these new immunostimulating oligodesoxynucleotides will be of clinical use. The immunomodulating properties of high-polymerised DNA molecules, obtained from the milts of sturgeon and salmon fishes, obviously are not related to the presence of CpG-dinucleotides. The experimental and clinical data give evidence of the immunostimulating potential of these molecules and the possibilities of their clinical relevance (alone and together with other immunomodulators) in immunopathological states. Further detailed research in immunomodulating effects of high-polymerised DNA molecules is necessary to reveal the mechanism of their action. (Med.Immunol., 2001, vol.3, N1, pp 27- 34)
С момента открытия основной функции ДНК новых кислот (аденин, гуанин), были определены
как универсального генетического кода к ней при- как структурная основа низкомолекулярных био-
ковано пристальное внимание исследователей. логически активных кофсрментов и кофакторов,
Нуклеиновые кислоты, обеспечивая передачу гене- дефицит которых лимитирует активность биологи-
тической информации и синтез белка, во многом ческих процессов в клетках всех типов, а повыше-
определяют пролиферацию и дифференцировку ние концентрации нуклеотидов в организме ведет
клеток. Эксперименты показали, что в пролифери- к увеличению метаболического пула без выражен-
рующих тканях количество ДНК и РНК возраста- ного возрастания потребления кислорода,
ет, а в тканях, подвергающихся дегенеративным В 70-е годы препараты ДНК широко изучались как
изменениям и деструкции, - снижается [1, 7, 9]. радиопротекторы, обеспечивающие интенсификацию
Азотистые соединения, входящие в состав нуклеи- восстановительных процессов в облученных организ-
____________________________;_______________ мах. Было показано, что экзогенная ДНК способна
Адрес для переписки: проникать в клетку и активировать репарационные
Серебряная Наталья Борисовна процессы. При этом препараты ДНК проявляли мие-
Кафедра гематологии и клинической иммунологии, лостимулирующий [11,16], регенераторный [9,12,14]
Военно-медицинская академия. и иммуномодулирующий эффекты [3, 5].
194175, Санкт-Петербург, Боткинская ул., 20; Первые сообщения об иммуностимулирующем и
Тел.: (812)178-57-00; e-mail: [email protected]. лимфопролиферативном действии ДНК [49] не сразу
привлекли внимание иммунологов, поскольку эти эффекты традиционно связывали с неспецифическим действием нуклеиновых кислот. Ещё в конце 19 века повышение противомикробной резистентности организма после введения нуклеиновых кислот объясняли повышением активности нуклеаз, обеспечивающих бактериолиз [37 ]. Поэтому тот факт, что некоторые иммуностимулирующие эффекты достигались только при использовании бактериальной ДНК, но не ДНК позвоночных [66], был воспринят как неожиданность, поскольку свидетельствовал об отсутствии универсальности в действии молекул ДНК различного происхождения.
Исследования факторов, определяющих иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК, показали, что иммунокомпетентные клетки млекопитающих отличают ДНК бактерий или других прокариотов от ДНК эукариотов при связывании немети-лированных динуклеотидов СрС в контексте специфических оснований [40]. В большинстве бактериальных геномов динуклеотиды СрС определяются с частотой, равной теоретически ожидаемой (1 к 16), где они присутствуют в неметилированной форме. При этом в геномах позвоночных СрС динуклеотиды представлены с частотой, составляющей 1/4 от теоретически ожидаемой рандомной частоты и являются метилированными [20].
Однако метилирование СрС динуклеотидов, как оказалось, - не единственная причина различий иммуностимулирующих свойств ДНК бактерий и позвоночных. Так, молекулы ДНК позвоночных, которые были полностью деметилированы (из-за “нокаута” гена ДНК-метилтрансферазы), не приобретали иммуностимулирующих свойств [58]. По-видимому, кроме метилирования, стимуляторные эффекты СрС динуклеотидов определяет и какой-то другой фактор.
Позднее было показано, что ДНК позвоночных все же содержит небольшое количество потенциальных иммуносгимуляторных СрС мотивов, и, по-видимому, различия в их действии связаны преимущественно с присутствием в геноме позвоночных иммунонейтрализующих последовательностей. При использовании синтетических олигодезоксинуклеотидов выявили, что СрС-динуклеотиды, которым предшествует цитозин и/или за которыми следовал гуанин, являются иммунонейтрализующими [43]. На основании этих и других исследований было определено, что свойства ДНК как иммуномодулятора определяются последовательностью нуклеотидов [51].
Иммуностимулирующие эффекты Срб мотивов бактериальной ДНК
Единственным типом клеток, для которых хорошо установлены прямые ответы на СрС-динуклеотиды, являются антигенпрезентирующие клетки (макрофаги, дендритные клетки и В-лимфоциты) (рис.1). Ведущая роль макрофагов в клиренсе ДНК в организ-
ме и мощная индукция цитокинов антигенпрезенти-рующими клетками определяет их центральную роль в ответе организма на чужеродную ДНК [57]. После стимуляции антигенпрезентирующих клеток бактериальной ДНК, содержащей СрС-динуклеотиды (далее - СрС ДНК), клетки начинают секретировать ци-токины, активирующие преимущественно ТЫ-лимфоциты — 1Ь-12,1Ь-18, и 1Е№, а также экспрессировать костимуляторные молекулы, что ведет к активации антигенпрезентирующей функции (рис.1) [39,48, 57]. Однако активация процессинга и презентации антигена характерна только для дендритных клеток, так как СрС ДНК уменьшает экспрессию молекул МНС II класса на макрофагах, что приводит к угнетению процессинга и презентации антигенов макрофагами [23]. То есть, имеются важные различия в последствиях стимуляции макрофагов и дендритных клеток СрС-динуклеотидами. При воздействии СрС ДНК в макрофагах увеличиваются уровни внутриклеточных реактивных радикалов кислорода [69] и в клетках, праймированых 1РЫу, дополнительно может
11.-6
Рис. 1. Влияния СрС-ДНК на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток.
1. Взаимодействие СрС-ДНК с В-лимфоцитами приводит к их активации, усиливает экспрессию мембранного 1дМ и стимулирует секрецию 11-6 и Т№а.
2. Взаимодействие СрС-ДНК с дендритными клетками приводит к секреции цитокинов, активирует процессинг и презентацию антигена, увеличивая экспрессию молекул МНС II, а также повышает экспрессию молекул, костимулирующих Т-лимфоциты (С080 и С086).
3. При прямой активации макрофагов СрС-ДНК активируется их кислород-зависимая и кислород-независимая микробицидность, усиливается секреция цитокинов, но снижается экспрессия молекул МНС
II класса.
Антигенпрезентирующие клетки, активированные СрС-ДНК, сек-ретируют цитокины (а дендритные клетки и костимулирующие молекулы), способствующие вовлечению в иммунный ответ Т-лимфоци-тов (преимущественно ТМ и СТЦ и Ш-клеток, которые в свою очередь начинают продуцировать цитокины, поддерживающие активацию антигенпрезентирующих клеток.
увеличиваться экспрессия индуцибельной NO-синта-зы [61]. По мнению Sester D.P. et al. [54], ответ макрофагов на CpG ДНК имеет общие аспекты с ответом клеток других типов на повреждение ДНК, что может обеспечить ключ к пониманию основного механизма действия ДНК.
CpG ДНК усиливает активацию В-лимфоцитов за счет синергизма при передаче сигналов через В-кле-точный иммуноглобулиновый рецептор [39], а также стимулирует В-лимфоциты к секреции IgM и IL-6 (продукция перечисленных факторов усиливается IFNy) [70]. CpG ДНК способствует длительным В-кле-точным ответам, так как обладает антиапоптотическим действием [67]. NK-клетки также сильно активируются под воздействием CpG ДНК, что проявляется в усилении продукции IFNy. Этот эффект обусловлен пе столько прямым действием CpG ДНК, сколько преимущественным взаимодействием NK-клеток со стимулированными антигенпрезентирующими клетками, которые продуцируют IL-12 и IFNa [19].
Молекулярные механизмы стимуляции иммунокомпетентных клеток CpG ДНК
Одним из наиболее фундаментальных вопросов в определении механизма действия ДНК является идентификация специфических рецепторов, так как для проявления иммуностимулирующих свойств ДНК должна быть интернализована клеткой. Имеющиеся в настоящий момент данные свидетельствуют, что молекулы ДНК связываются белковыми рецепторами на поверхности клетки (р29 и р68кД) независимо от последовательности нуклеотидов в этих молекулах [31].
Олигодезоксипуклеотиды, содержащие CpG, проявляют свою активность после связывания с внутриклеточным, а не с поверхностным клеточным белком. Показано, что препараты, которые препятствуют ацидификации и процессингу олигодезокси-нуклеотидов в эндосомах (например хлороквин), или конкуренция с ДНК, не содержащей CpG-динукле-отидов, полностью блокируют иммуностимулирующие эффекты CpG ДНК [29, 68].
Исследованиями последних лет определены некоторые пути передачи сигналов, которые активизируются олигодезоксинуклеотидами, содержащими CpG ДНК. 10-15 минутная экспозиция антигенпре-зентирующих клеток с CpG ДНК приводит к активации NFkB [57] и индукции МАР-киназных путей [29, 69] с последующей активацией стресс-киназ JNK1/2 и р38, следствием чего является быстрое увеличение уровней мРНК различных антиапопто-тических генов и клеточных протоонкогенов [67]. Такая активация стресс-киназ необходима для продукции цитокинов (в частности TNFa и IL-12). Специфические ингибиторы МАР-киназных путей блоки-
руют увеличение высвобождения цитокинов и дальнейшую активацию транскрипционных факторов, в частности фактор активации транскрипции-2 (АТР-2) и активаторного протеин-1 (АР-1), что отменяет биологический ответ на СрС.
СрС ДНК активирует несколько путей передачи сигналов, общих с бактериальным липополисахаридом (ЛПС), которые ведут к индукции цитокиновых генов, в частности ТОТа. Предварительная обработка клеток ЛПС снижает их чувствительность к последующей активации СрС ДНК. Оба стимула вызывают остановку митотического цикла макрофагов, индуцированного макрофагальным колониестимулирующим фактором роста -1 (С8Р-1), а также и предотвращают апоп-тоз, вызванный удалением ростового фактора.
Хотя в действии СрС ДНК и ЛПС имеется сходство, определены и существенные различия. Так, иммунные эффекты СрС ДНК отмечены у СЗН/Не} мышей, резистентных к ЛПС. Молекулярные механизмы проведения внутриклеточных сигналов после связывания ЛПС и СрС ДНК расходятся в некоторой точке, поскольку при воздействии ЛПС не происходит стимуляции иромотера 1Ь-12 и ряда других генов [24].
Индукция защитных реакций естественного и адаптивного иммунитета при воздействии Срв ДНК
Распознавание немегилированных СрС-мотивов представляет собой способ обнаружения специфичных микробных молекул иммунокомпетентными клетками
и, по-видимому, является одним из важных механизмов защиты от патогенов. Внутриклеточное местоположение СрС рецептора является аргументом в пользу предположения, что иммунное распознавание СрС ДНК развивалось как фактор защиты от внутриклеточных бактерий и вирусов, так как нуклеиновые кислоты этих патогенов имеют все возможности для связывания с рецепторами СрС. Интересно, что патогенные микроорганизмы обладают и механизмом ускользания от этого вида распознавания: так, геномы ДНК-содержащих вирусов и ретровирусов являются СрС-супрессивными, в них определяют только 6-20 % СрС-динуклеотидов от ожидаемой рандомной величины [33]. В геноме некоторых внутриклеточных паразитов имеются мотивы, супрессирующие СрС [34]. В геноме аденовируса второго типа определяется шестикратное увеличение частоты иммуносупрессивой комбинации СрС-динуклеотидов с цитозином и гуанином по сравнению с теоретически ожидаемой, что может определять патогенные свойства этого вируса [42].
Все эти факты свидетельствуют о наличии сильного давления отбора, определяющего выживание патогенов, стратегия которых состоит в том, чтобы избежать активации защитных механизмов, связанных с распознаванием СрС. В пользу этого предпо-
ложения свидетельствует и тот факт, что под воздействием CpG ДНК стимулируется ответ по типу Th 1, и именно этот тип ответа является оптимальным для защиты от внутриклеточных патогенов. Активация реакций естественного иммунитета, наблюдаемая у мышей при введении одной дозы CpG-ДНК, обеспечивает долгосрочную защиту (в течение двух - четырех недель) против летальной дозы многих патогенов, включая Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Ebola, Plasmodium malaria, Leishmania и Schistosoma [27, 41, 65, 71]. При этом CpG ДНК не имела заметного защитного действия против инфекции экстрацеллюлярными бактериями.
Развитие антиген-специфичных адаптивных иммунных ответов на чужеродные антигены зависит от сопутствующей активации клеток естественного иммунитета, особенно дендритных клеток. CpG-ДНК -чрезвычайно мощный стимул для дендритных клеток, включающий в них продукцию высоких уровней Thl-цитокинов (IL-12 и IL-18) и экспрессию костимуля-торных молекул, таких, как CD80 и CD86, а также молекул МНС класса II, что увеличивает их способность активировать Т-лимфоциты [30, 32].
У мышей CpG-ДНК обладает свойствами адъюванта для стимуляции иммунных ответов с участием ТЫ, цитотоксических Т-лимфоцитов, причем адъювантные свойства CpG-ДНК превосходят таковые у полного адъюванта Фрейнда [47]. Как адъювант для пептидной вакцины против вируса лимфоцитарного хориоменинги-та, CpG ДНК стимулирует защиту от вируса даже у мышей с В-клеточным иммунодефицитом [50]. При использовании CpG ДНК в качестве адыованта можно даже преодолеть склонность к развитию иммунных ответов с участием Th2, характерных для иммунной системы новорожденных [38]. Недавние исследования подтвердили, что CpG ДНК является также мощным адъювантом и у приматов, включая человека и обезьян [42].
Возможности терапевтического использования препаратов на основе CpG ДНК
CpG ДНК, обладающая мощным адъювантным действием и увеличивая активность ТЫ, предотвращает повышение чувствительности мышей к аллергенам [36]. Назначение только CpG ДНК или её комбинация с аллергеном может отменять воспалительные ответы на аллерген, протекающие с преимущественной активностью Th2, даже у предварительно сенсибилизированных мышей [22, 35, 36, 59]. Кроме того, показана возможность применения CpG ДНК для лечении легочных заболеваний, так как она уменьшает воспаление, вызванное ингаляцией эндотоксина [52].
В различных экспериментальных моделях CpG ДНК стимулирует несколько различных типов противоопухолевых эффектов [40]. Активация естественно-
го иммунитета CpG ДНК в некоторых экспериментах обеспечивала запрет опухолевого роста [26, 62]. Важным фактором, определяющим противоопухолевую эффективность CpG ДНК, является способность увеличивать активацию Т-лимфоцитов, стимулируя АПК к производству интерферонов I типа [59] и костиму-ляция Т-лимфоцитов, активированных антигеном при связывании антигенраспознающего рецептора [32].
Поскольку несбалансированная активация иммунной системы является важным фактором развития системных аутоиммунных заболеваний, имелись опасения, что CpG ДНК может являться стимулятором этих заболеваний, в частности системной красной волчанки (СКВ) [64]. Обоснованность этих подозрений была связана с тем, что характерными чертами СКВ являются поликлональная активация В-лимфоцитов, гиперпродукция IL-6, нарушение толерантности к аутоантигенам и продукция анти-ДНК антител. CpG мотивы бактериальной ДНК индуцируют различные иммунологические эффекты, в том числе поликлональную активацию В-лимфоцитов, секрецию IL-6 и резистентность к апоптозу, что может способствовать повышению резистентности аутореактивных клеток [44]. Однако исследования на животных показали, что назначение CpG ДНК не только не стимулирует СКВ, но даже уменьшает ее тяжесть у мышей, генетически предрасположенных к этому заболеванию [28].
Однако некоторые органоспецифические аутоиммунные заболевания, в которых IL-12 является патогенетическим фактором, могли быть индуцированы или усилены CpG ДНК за счет стимуляции экспрессии IL-12. Например, в тех случаях, когда CpG ДНК использовалась как адъювант при иммунизации антигенами Chlamydia, имеющими перекрестную реактивность с антигенами миокарда, наблюдали развитие аутоиммунного миокардита [18]. Введение CpG ДНК в соединительную ткань стимулировало транзиторный воспалительный артрит [25]. Обработка клеток селезенки CpG ДНК in vitro могла активизировать аутореактивные эффекторные Thl-лимфоциты, специфичные для основного белка миелина, что вызывало развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита [53]. Назначение CpG ДНК мышам, инфицированным вирусом мышиного энцефаломиелита, повышало активность демиелинизирующих заболеваний дозо-зависимым образом [63]. Однако интерпретация этих результатов осложняется тем, что при использовании других экспериментальных моделей CpG ДНК может уменьшать тяжесть экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита [21].
При введении мышам CpG ДНК без аутоантигенов каких-либо токсических эффектов не наблюдалось, однако отмечались некоторые эффекты, опосредованные иммунотропными свойствами CpG ДНК, например появление экстрамедуллярных очагов кроветворения [56] и мультиорганную инфильтрацию
мононуклеарными клетками. Эти эффекты у обезьян отмечались значительно реже, что позволяет надеяться на безопасность CpG ДНК-терапии у людей [46]. Несмотря на мощную активность CpG ДНК как В-клеточного митогена, она не способствовала развитию лимфомы у трансгенных мышей, являющихся моделью лимфомы Бёркитта [55]. Напротив, в этой модели использование CpG-олигодезоксинуклеотидов полностью предотвращало развитие лимфомы.
Приведенные данные свидетельствуют, что хотя иммунная активация CpG ДНК может в ряде случаев быть связана и с неблагоприятными побочными эффектами, CpG ДНК может иметь терапевтическое значение и как иммуномодулятор, и как адъювант для вакцин против некоторых инфекционных агентов, рака и аллергии. Все эти факты обусловили интерес к созданию синтетических олигодезоксинуклеотидов, которые дифференцированно активируют IL-12 без продукции TNFa в антигенпрезентирующих клетках. Такие иммуно-стимуляторные ДНК были активны как адъюванты, а их присутствие способствовало развитию ци-тотоксических Т-лимфоцитов, которые определяли устойчивость мышей BALB/c к инфекции летальной дозой Leishmania major. То есть синтетические иммуностимуляторные CpG-содержащие олигонуклеотиды являются прототипом новых им-муностимуляторных препаратов, лишенных неблагоприятных побочных эффектов бактериальной ДНК [47]. В настоящее время проходят клинические испытания препаратов на основе CpG ДНК у человека, в которых получение первых результатов ожидается в 2001 году [45].
Иммуностимулирующие свойства ДНК, выделенной из молок осетровых и лососевых рыб
Отсутствие в ДНК позвоночных иммуностимулирующих CpG-динуклеотидов и присутствие иммуно-нейтрализующих/иммуносупрессивных мотивов определяет различия иммуномодулирующих свойств этого типа ДНК по сравнению с бактериальной ДНК. Уже первые сравнительные изучения показали, что ДНК, выделенная из молок лососевых рыб, как и позвоночных других видов, не обладает способностью активировать естественные киллерные клетки [66]. По-видимому, эти факты обусловили отсутствие широкого интереса к изучению иммунотропных свойств ДНК рыб в странах Западной Европы и США. Напротив, в нашей стране ДНК лососевых и осетровых рыб изучалась активнее, чем бактериальная ДНК из-за наличия у нее радиопротекторных свойств [11,12, 16]. Оказалось, что ДНК лососевых рыб обладала выраженным протективным действием при заражении мышей летальными дозами Salmonella enteritidis
и Escherichia coli. Однократное (за сутки до инфицирования) или двукратное (за сутки до- и в момент инфицирования) введение ДНК обеспечивало более чем 60% выживаемость животных на фоне 100% летальности в контрольной группе. Исследование иммунологических показателей выявило, что введение ДНК лососевых рыб стимулировало ответ на тимус-зависимый корпускулярный антиген (эритроциты барана), увеличивало количество антителообразующих клеток в селезенке мышей и повышало фагоцитарную активность (как поглотительную, так и переваривающую) моноцитов периферической крови, а также число перитонеальных макрофагов [2]. Было определено, что в ответ на введение ДНК в крови снижается уровень холестерина и увеличивается концентрация ПГЕ2 [13], что может рассматриваться как следствие системной активации макрофагов.
Интересно, что нуклеопротеиды молок лососевых рыб обладают действием, сходным с действием нативной ДНК, поскольку их белок протамин (сальмин), в отличие от белков (гистонов) других рыб, образует с ДНК более сильный биологически активный комплекс. Так, при исследовании иммуностимулирующих свойств полипептидов, полученных из молок лососевых, была показана их способность активировать фагоцитоз макрофагов, увеличивать количество антителообразующих клеток в селезенке мышей и увеличивать титр антител к эритроцитам барана у мышей как низкоотвечающих, так и высокоотвечающих линий [10], то есть проявлять те же эффекты, что наблюдались после введения нативной ДНК.
Нативная ДНК осетровых рыб обладает такими же иммуностимулирующими свойствами, как и ДНК лососевых, в том случае, если ее м.м. не превышает 500 кД, что обеспечивает молекулам ДНК проникновение в клетку [4]. На основе нативной ДНК из молок осетровых рыб был создан препарат - раствор дезоксирибонуклеата натрия, получивший коммерческое название деринат. В 1996 - 98 годах деринат прошел широкие клинические испытания, которые подтвердили наличие у него радиопротекторной и иммуномодулирующей активности при отсутствии токсичности. С 1999 года деринат одобрен Фармакологическим комитетом РФ и разрешен для применения в качестве иммуностимулятора. Включение дерината в протоколы лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и желудка (этиологически связанной с инфекцией Н. Pylori) и рецидивирующего урогенитального хламидиоза, показало, что препарат обладает выраженным противоинфекцион-ным и репаративным действием [15, 17].
Применение дерината при хирургическом сепсисе способствовало снижению сроков лечения у выживших пациентов, однако существенного влияния на летальность в обследованной группе из 30 пациентов показать не удалось. Сопоставление иммунологических параметров лиц, лечившихся с примене-
ние дерината и без использования этого препарата, выявило, что в группе пациентов, получавших дери-нат, наблюдалась достоверная стимуляция лимфо-поэза при снижении количества незрелых форм ней-трофильных гранулоцитов, что обусловило более раннюю нормализацию гематологических показателей. К 3-4 дню от начала терапии деринатом существенно возрастало количество В-лимфоцитов, что приводило к увеличению количества ЦИК к 5-7 дню и приблизило их концентрацию к таковой у здоровых лиц. В эти же сроки достоверно увеличивалась активность фагоцитирующих клеток в лизосомаль-но-катионном тесте, повышалось количество СЭЗ+ Т-лимфоцитов и субпопуляции СВА+ лимфоцитов [6]. При совместном назначении дерината и ронко-лейкина (рекомбинантного 1Ь-2) был выявлен синергизм иммуностимулирующего действия препаратов при их последовательном применении. Использование одного ронколейкина не приводило к существенному увеличению количества лимфоцитов у больных сепсисом. Деринат, применяемый отдельно, способствовал увеличению количества лимфоцитов примерно на 40% по сравнению с их исходным уровнем, а при сочетании ронколейкина и дерината отмечено более чем 3-х кратное увеличение количества лимфоцитов в периферической крови [6].
Приведенные данные свидетельствуют, что ДНК из молок лососевых и осетровых рыб обладает иммуностимулирующим эффектом в организме мыши и человека. Однако не исследованными остаются факторы, определяющие иммунотропные свойства этой ДНК, типы отвечающих иммунокомпетентных клеток и механизмы их активации. Сопоставление иммуностимуляторных эффектов, определяемых при использовании бактериальной СрС ДНК и ДНК лососевых и осетровых рыб, свидетельствует о наличии некоторых общих эффектов, связанных с активацией фагоцитирующих клеток, в частности макрофагов. Это сходство заставляет с определенной настороженностью относиться к возможности широкого неконтролируемого использования ДНК-со-держащих препаратов из молок рыб, поскольку для бактериальной СрС ДНК показана нецелесообразность ее использования в тех ситуациях, когда иммунные реакции протекают с гиперактивностью ТЫ (например при некоторых аутоиммунных заболеваниях).
Необходимо учитывать также, что активация макрофагов ДНК-содержащими препаратами сопровождается усиленной продукцией провоспалительных цитокинов. Так, при использовании бактериальной СрС ДНК было показано значительное усиление продукции ТЫБа (см. выше). Усиление продукции провоспалительных цитокинов может, по-видимому, наблюдаться и при использовании ДНК лососевых и осетровых рыб, о чем свидетельствует факт повышения температуры тела, что наблюдается у ряда пациентов после введения дерината. Следовательно, в клинических ситуациях, связанных с гиперпродук-
цией провоспалительных цитокинов (что часто наблюдается при инфекционных процессах, в патогенезе которых участвуют бактериальные и вирусные суперантигены) дополнительная активация продукции провоспалительных цитокинов может привести к развитию нежелательных последствий, в том числе таких угрожающих, как септический шок. Однако это предположение нуждается в целенаправленной проверке, поскольку пока еще точно не установлено, с преимущественным усилением продукции каких цитокинов связано иммуностимулирующее действие ДНК лососевых и осетровых рыб.
Список литературы
1. Антонов М.И., Глинка Б.Б., Тогузов Р.Г. и др. Биохимия деструктивных и репаративных процессов при перерезке общего печеночного протока у крыс// Проблемы регенерации патологически измененных органов и обратимости патологических изменений. -Горький., 1975. - С. 177-181.
2. Беседнова H.H., Касьяненко Ю.И., Эпштейн Л.М. и др. Иммунотропные свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - Том 44, № 10. - С. 13-15.
3. Вайнберг Ю.П., Каплина Э. Н. Кольцов П.А. и др. Активность лекарственных средств, полученных на основе нативной ДНК в отношении РНК- и ДНК-содер-жащих вирусов // Ктин. мед. - 1995. - Т.73, №6. - С.3-5.
4. Вайнберг Ю.П., Каплина Э. Н. Кольцов П.А. и др. Получение высокополимерной ДНК из молок осетровых рыб // Хим. фарм. журн. - 1982. - №7. - С.67-70
5. Вайнберг Ю.П., Каплина Э. Н. Кольцов П.А. и др. Противовирусная активность препаратов нативной ДНК // Воен.- мед. журн. - 1993. - №12. - С.48-49.
6. Громов М.И. Реаниматологические проблемы хирургического сепсиса. Автореферат дис. ...д-ра. -Санкт-Петербург., 1998.
7. Дин Р. Процессы распада в клетке. - М.: Медицина, 1971 - 254 с.
8. Казьмин С.Л. Биохимия митотического цикла опухолевых клеток. - Киев, 1984 - 354 с.
9. Караськов А.М., Вайнберг Ю.П., Волков А.П. Эффективность применения натриевой соли ДНК при инфаркте миокарда // Воен.- мед. журн. - 1995. - №6. -С.64-65.
10. Касьянин A.B., Юшков В.В. Иммунологические эффекты молокина // ЖМЭИ. - 1998. - №2. - С.97 - 99.
И. Кириллова Е.Н., Либинзон P.E. Лечебное действие гетерологичной ДНК при фракционированном пролонгированном облучении // Радиобиология. -1973. - Т.13, №1,-С. 29-34.
12. Кудрявцев В.Д., Гуменюк Л.Н., Цыганков А.П. Влияние гетерологичной ДНК на репаративные процессы в слизистой оболочке тонкого кишечника крыс и мышей при лучевом кишечном синдроме // Радиобиология. - 1978. - Т.18, №1. - С.92 - 95.
13. Левачев М.М., Эпштейн Л.М., Касьяненко Ю.И. Биологическое использование препарата низкомолекулярных ДНК из молок лососевых / Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарствен-
ные, лечебно-профилактические и технические препараты. Тез. Всесоюзн. Сов.: Владивосток. 1991.
14. Логинов А.С., Вайнберг Ю.П., Шагалов Л.Б. и др. Репаративное действие препаратов нуклеиновых кислот при экспериментальной язве желудка.//Бюлл. эксперимент, биологии и медицины. - 1991. - № 7. - С. 59-60.
15. Мельников Д.Ю., Ощепков С.П.. Применение препарата деринат в лечении рецидивирующего хла-мидиоза // Паллиативная медицина и реабилитация.
- 1999. - №1. - С.29-30.
16. Рогачева С.А., Турдакова В.А. К механизму терапевтического действия различных доз ДНК при лучевом поражении крыс // Радиобиология. -1976. - Т. 16, №5 . - С.783 - 785.
17. РомашкинаТ.С. Эффективность лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки деринатом / / Автореферат дис. ...канд. - М., 1999.
18. Bachmaicr К., Neu N., de la Maza L.M. et.al. Chlamydia infections and heart disease linked through antigenic mimicry // Science. - 1999. - Vol. 283. - P. 1335-1339.
19. Balias Z.K., Rasmussen W.L., Krieg A.M. Induction of natural killer activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA //J. Immunol. - 1996. - Vol. 157. - P. 1840-1845.
20. Bird A.P. CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus // Trends Gene. - 1987. - Vol. 3. - P. 342-347.
21. Boccaccio G.L., Mor F., Steinman L. Non-coding plasmid DNA induces IFN-y in vivo and suppresses autoimmune encephalomyelitis // Int. Immunol. - 1999. -Vol 11.-P. 289-296.
22. Broide D., Schwarze J., Tighe H. et al. Immunostimulatory DNA sequences inhibit 1L-5, eosinophilic inflammation, and airway hyperresponsiveness in mice//J. Immunol. - 1998.-Vol. 161. - P. 7054-7062.
23. Chu R.S., Askew D., Noss E.H. et al. CpG oligodeoxynucleotides down regulate macrophage class II MHC antigen processing // J. Immunol. - 1999. - Vol. 163. - P.l 188-1194.
24. Cowdery J.S., Boerth N.J., Norian L.A. et al. Differential regulation of the IL-12 p40 promoter and of p40 secretion by CpG DNA and lipopolysaccharide // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162. - P. 6770-6775.
25. Deng G-М., Nilsson I-М., Verdrengh M. et al. Intra articularly localized bacterial DNA containing CpG motifs induces arthritis //Na.t Med. -1999. - Vol. 5. - P. 702-705.
26. Dow S.W., Frandkin L.G., Liggitt D.H. et al. Lipid— DNA complexes induce potent activation of innate immune responses and antitumor activity when administered intravenously//J. Immunol. - 1999.-Vol. 163.-P. 1552— 1561.
27. Elkins K.L., Rhinehart-Jones T.R., Stibitz S.et al. Bacterial DNA containing CpG motifs stimulates lymphocyte-dependent protection of mice against lethal infection with intracellular bacteria // J. Immunol. - 1999. -Vol. 162.-P. 2291-2298.
28. Gilkeson G.S., Conover J., Halpern M. et al. Effects of bacterial DNA on cytokine production by (NZB/ NZW)F1 mice//J. Immunol. - 1998. - Vol. 161. - P. 3890-3895.
29. Ндскег H., Mischak H., Miethke Th. et al. CpG-DNA-specific activation of antigen-presenting cells requires stress kinase activity and is preceded by nonspecific endocytosis and endosomal maturation // EMBO . - 1998. - Vol. 17. - P. 6230-6240.
30. Hartmann G., Weiner G., Krieg A.M. CpG DNA as a signal for growth, activation and maturation of human dendritic cells // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1999. - Vol. 96.-P. 9305-9310.
31. Hefeneider S.H., Cornell K.A., Brown L.E. et al. Nucleosomes and DNA bind to specific cell-surface molecules on murine cells and induce cytokine production //Clin Immunol. Immunopathol. - 1992. - Vol. 63, № 3. -P. 245-51.
32. Jakob Т., Walker P.S., Krieg A.M. et al. Activation of cutaneous dendritic cells by CpG-containing oligodeoxynucleotides: a role for dendritic cells in the augmentation of Thl responses by immunostimulatory DNA //J. Immunol. - 1998. - Vol. 161. - P.3042-3049 .
33. Karlin S., Doerfler W., Cardon L.R. Why is CpG suppressed in the genomes of virtually all small eukaryotic viruses but not in those of large eukaryotic viruses?// J. Virol. - 1994. - Vol. 68. - P. 2889-2897.
34. Karlin S., Ladunga I., Blaisdell B.E. Heterogeneity of genomes: measures and values //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1994. - Vol. 91. - P.12837-12841.
35. Kline J.N., Krieg A.M., Waldschmidt T.J. et al. CpG oligodeoxynucleotides do not require Thl cytokines to prevent eosinophilic airway inflammation in a murine model of asthma // J. All. Clin. Immunol. - 1999. - Vol. 104. - P.1258-1264.
36. Kline J.N., Waldschmidt T.J., Businga T.R. et al. Cutting edge: modulation of airway inflammation by CpG oligodeoxynucleotides in a murine model of asthma //J. Immunol. - 1998. - Vol. 160. - P.2555-2559.
37. Kossel A. //Arch.Phisiol. Leipz. - 1894. - Vol.19. -P.285-288 (цитируется по Каплина Э.Н. Деринат - иммуномодулятор XXI века. Некоторые итоги клинического применения дерината с 1976 по 2000 г // Медицинская картотека. - 2000. - Т.34, №3. - С.22-23).
38. Kovarik J., Bozzotti Р., Love-Homan L. et al. CpG oligodeoxynucleotides can circumvent the Th2 polarization of neonatal responses to vaccines but may fail to fully redirect Th2 responses established by neonatal priming//J. Immunol. - 1999. - Vol.162. - P. 1611-1617
39. Krieg A.K., Yi А-K., Matson S. et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct В-cell activation // Nature.
- 1995. Vol. 374. - P. 546-549.
40. Krieg A.M. Mechanisms and applications of immune stimulatory CpG oligodeoxynucleotides // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - № 93321. P. 1-10.
41. Krieg A.M., Love-Homan L., Yi А-K., Harty J.T. CpG DNA induces sustained IL-12 expression in vivo and resistance to Listeria monocytogenes challenge // J. Immunol. - 1998. - Vol. 161. - P. 2428-2434.
42. Krieg A.M., Wu Т., Weeratna R. Et al. Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory CpG motifs //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -
1998. Vol.95.-P. 12631-12636.
43. Krieg A.M., Yi A.-K., Schorr J., Davis H.L. The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines // Trends Microbiol. - 1998. - Vol. 6. - P. 23-27.
44. Krieg AM. CpG DNA: a pathogenic factor in systemic lupus erythematosus? //J. Clin. Immunol. -1995.
- Vol.6. - P. 284-292.
45. Krieg A.M. The role of CpG motifs in innate immunity //Cur. Opin. Immunol. - 2000. - Vol. 12, No2.
- P. 35-43.
46. Levin A.A., Monteith D.K., LeedsJ.M. et al. Toxicity of oligodeoxynucleotide therapeutic agents / In Handbook of Experimental Pharmacology 131: Antisense Research and Application. Edited by Crooke S. New York: Springer-Verlag, 1998. - P. 169-215.
47. Lipford G.B., Sparwasser T., Bauer M. et al. Immunostimulatory DNA: sequence-dependent production of potentially harmful or useful cytokines / / Eur. J. Immunol. - 1997. - Vol.12. - P. 3420-3426.
48. Martin-Orozco E., Kobayashi H., Van Uden J. et al. Enhancement of antigen-presenting cell surface molecules involved in cognate interactions by immunostimulatory DNA sequences // Int. Immunol. -1999,-Vol. 11.-P. 1111-1118.
49. Messina J.P., Gilkeson G.S. Pisetsky D.S. Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA //J. Immunol. - 1991. - Vol. 147. - P. 1759-1764.
50. Oxenius A., Martinic M.M.A., Hengartner H., Klenerman P. CpG containing oligonucleotides are efficient adjuvants for induction of protective antiviral immune responses with T-cell peptide vaccines //J. Virol.
- 1999.-Vol. 73.-P. 4120-4126.
51. Pisetsky D.S. The influence of base sequence on the immunostimulatory properties of DNA //Immunol. Res.
- 1999. - Vol. 19, №1.- P.35-46.
52. Schwartz D.A., Wohlford-Lenane C.L., Quinn T.J., Krieg A.M. Bacterial DNA or oligonucleotides containing unmethylated CpG motifs can minimize LPS-induced inflammation in the lower respiratory tract through an IL-
12 dependent pathway//J. Immunol. - 1999.-Vol. 163. -P. 224-231.
53. Segal R., Bermas B.L., Dayan M. et al. Kinetics of cytokine production in experimental systemic lupus erythematosus //J. Immunol. - 1997. - Vol. 158. - P. 3009-3016.
54. Sester D.P., Stacey K.J., Sweet M.J., Beasley S.J., Cronau S.L., Hume D.A. The actions of bacterial DNA on murine macrophages //J. Leukoc. Biol. -1999. - Vol. 66, No.4. - P. 542-548.
55. Smith J.B., Wickstrom E. Antisense c-myc and immunostimulatory oligonucleotide inhibition of tumorigenesis in a murine B-cell lymphoma transplant model //J. Natl. Cancer. Inst. - 1998. - Vol. 98. - P. 1146— 1154.
56. Sparwasser T., Hultner L., Koch E.S. Immunostimulatory CpG-oligodeoxynucleotides cause extramedullary murine hemopoiesis //J. Immunol. - 1999.
- Vol. 162. - P. 2368-2374.
57. Stacey K.J., Sester D.P., Sweet M.J., Hume D.A. Macrophage activation by immunostimulatory DNA / / Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2000. - Vol. 247. -P. 41-58.
58. Sun S., Beard C., Jaenisch R. et al. Mitogenicity of DNA from different organisms for murine В cells //J. Immunol. - 1997. - Vol. 159. - P. 3119-3125.
59. Sun S., Zhang X., Tough D.F., Sprent J. Type I interferon-mediated stimulation of T cells by CpG DNA / /J. Exp. Med. - 1998. - Vol. 188. - P. 2335-2342.
60. Sur S., Wild J.S., Choudhury B.K. et al. Long term prevention of allergic lung inflammation in a mouse model of asthma by CpG oligodeoxynucleotides //J. Immunol. -1999. - Vol. 162. - P. 6284-6293.
61. Sweet M.J., Stacey K.J., Kakuda D.K. et al. IFN-y primes macrophage responses to bacterial DNA //J-Interferon Cytokine Res. - 1998. - Vol. 18. - P. 263-271.
62. Tokunaga Т., Yamamoto H., Shimada S. et al. Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from mycobacterium bovis GCG. I. Isolation, physicochemical characterization, and antitumor activity //J. Natl. Cancer. Inst. - 1984. - Vol 72. - P. 955-962.
63. Tsunoda I., Tolley N.D., Theil D.J. et al. Exacerbation of viral and autoimmune animal models for multiple sclerosis by bacterial DNA // Brain Pathol. -
1999.-Vol. 9.-P. 481-493.
64. Tuetken R.S., Yi А-K., Krieg A.M. The immune effects of bacterial DNA and their possible role in the pathogenesis of lupus. //In Lupus: Molecular and Cellular Pathogenesis/ ed. Tsokos GC, Kammer G. Totowa -Humana Press: NJ 1999, P. 79-100.
65. Walker P.S., Scharton-Kersten Т., Krieg A.M. Immunostimulatory ligodeoxynucleotides promote protective immunity and provide systemic therapy for leishmaniasis via IL-12- and IFN-y-dependent mechanisms // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1999. - Vol. 96 - P. 6970-6975.
66. Yamamoto S., Yamamoto T„ Shimada S. et al. DNA from bacteria, but not from vertebrates, induces interferons, activates natural killer cells and inhibits tumor growth // Microbiol. Immunol. - 1992. - Vol. 36. - P. 983-97.
67. Yi А-K., Hornbeck P., Lafrenz D.E., Krieg AM. CpG DNA rescue of murine В lymphoma cells from anti-IgM induced growth arrest and programmed cell death is associated with increased expression of c-myc and bcl-xL // J Immunol. - 1996.
- Vol. 157. - P. 4918-4925.
68. Yi А-K., Krieg A.M. Rapid induction of mitogen activated protein kinases by immune stimulatory CpG DNA //J. Immunol. 1998. - Vol. 161. P. 4493-4497.
69. Yi А-K., Tuetken R., Redford T. et al. CpG motifs in bacterial DNA activates leukocytes through the pH-dependent generation of reactive oxygen species // J. Immunol. - 1998. - Vol. 160. - P. 4755-4761.
70. Yi A.- K., Chace J.H., Cowdery J.S., Krieg A.M. IFN-gamma promotes IL-6 and IgM secretion in response to CpG motifs in bacterial DNA and oligodeoxynucleotides //J. Immunol. - 1996. - Vol. 156. - P. 558-564.
71. Zimmerman S., Egeter O., Hausmann S. et al. Cutting edge: CpG ligodeoxynucleotides trigger protective and curative Thl responses in lethal murine leishmaniasis //J. Immunol. - 1998. - Vol. 160. - P. 3627-3630.
поступила в редакцию 25.11.2000 принята к печати 22.01.2001
