CC BY
52
УДК: 616.36-002:616.155.32
И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, Е.В. Белобородова,
В.В. Новицкий, Э.И. Белобородова, О.Б. Жукова,
А.П. Зима, М.А. Антошина, В.В. Белоконь
ДИЗРЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ
ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет ФАЗСР, Томск
Хронический вирусный гепатит сопровождается отчетливыми иммунофенотипическими и функционально-метаболическими изменениями лимфоцитов периферической крови. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С, В+С наблюдается дефект Т-звена иммунитета (снижение числа зрелых Т-лимфоцитов, Т-хелперов-индукторов, а также иммунорегу-ляторного индекса), неспецифической резистентности (уменьшение содержания натуральных киллеров) на фоне повышения содержания липидов и активности неспецифической эстера-зы в лимфоцитах и способности лимфоцитарных клеток к пролиферации.
Ключевые слова: вирусы гепатитов В и С, лимфоциты, иммунофенотип, метаболизм, реакция бласттрансформации лимфоцитов
В последние годы хронические вирусные гепатиты (ХВГ) В и С привлекают все большее внимание исследователей в связи с их широкой распространенностью, прогредиентным течением и развитием тяжелых осложнений в виде цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [2, 3,
6, 10, 13, 17, 19, 21, 23]. Применение современных методов молекулярной и клеточной биологии позволило значительно расширить представления о природе вирусов гепатита В (HBV) и С (HCV). Так, установление факта репликации этих вирусов помимо печени в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови позволило объяснить механизм ряда внепеченочных проявлений HBV-и HCV-инфекции [3, 6, 18].
Многие авторы полагают, что именно свойства вирусов определяют течение и исходы болезни, а также эффективность лечения противовирусными препаратами. На сегодняшний день доказана высокая вариабельность геномов HBV и HCV, установлена возможность возникновения мутантов данных вирусов, способных избегать действия иммунного надзора [1, 2, 6, 10, 12].
Однако, несмотря на мощный инфекционный потенциал HBV и HCV, который существенным образом влияет на развитие болезни, не следует исключать значимость функциональных изменений иммунокомпетентных клеток в процессе формирования и поддержания длительной вирусной персистенции. Важным условием эффективности иммунопатологических механизмов защиты макроорганизма от вирусной инфекции является ин-
тенсивность иммунного ответа, определяемая, в свою очередь, функциональной активностью мо-нонуклеарных лейкоцитов периферической крови. Назначение последних связывают с постоянным контролем за проникновением чужеродных микроорганизмов, а также генетической однородностью клеточных популяций самого организма [11, 22]. Воспринимая сигналы о дестабилизации внутренней среды, иммунокомпетентные клетки модулируют свои функции, направленные на восстановление гомеостаза [3, 18, 25].
В последнее время исследователи все большее внимание уделяют раскрытию иммунных механизмов персистентных вирусных инфекций. При этом особый интерес к изучению функционального состояния мононуклеарных клеток обусловлен не только непосредственным участием иммуно-цитов в реализации инфекционного процесса, но и тем, что иммунокомпетентные клетки являются самостоятельной мишенью для действия HBV и HCV. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение иммунофенотипических, метаболических и функциональных особенностей лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническими вирусными гепатитами В, С и В+С.
Методика
Обследовали 112 пациентов (73 мужчины и 39 женщин в возрасте от 18 до 45 лет) с хроническим течением вирусного гепатита В (25 больных), С (66 больных), В+С (21 больной). Верификация диагноза проводилась на основании данных кли-
нико-эпидемиологического, инструментального (сцинтиграфическое, ультразвуковое и морфологическое исследование печени), серологического (иммуноферментный анализ) и молекулярногенетического (полимеразная цепная реакция) методов исследования. Все пациенты были обследованы до начала лечения. Проведенное исследование соответствует этическим нормам Хельсинкской декларации. Критериями исключения из исследования являлись алкогольная и наркотическая зависимость пациентов. Контрольную группу составили 26 практически здоровых доноров со схожими характеристиками по полу и возрасту. Исследовали стабилизированную гепарином (25 ЕД/мл) венозную кровь, взятую утром до приема пищи.
Общее количество лимфоцитов периферической крови оценивали стандартным гематологическим методом [9]. Определение субпопуляций лимфоцитов по маркерам клеточной дифферен-цировки ^3+, CD4+, CD8+, CD56+, CD22+) проводили иммуноцитохимическим методом [14] с использованием набора реагентов фирмы «Dako» (Дания).
Для приготовления мазков периферической крови использовали метод лейкоконцентрации с трилоном Б [9]. Осуществляли оценку содержания гликогена и липидов, а также активности кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы в лимфоцитарных клетках. Для количественного выражения результатов рассчитывали средний цитохимический коэффициент [16].
Культуральную суспензию для теста бласт-трансформации лимфоцитов готовили по методике [5]. В суспензию вносили фитогемагглютинин («Difco», Германия) в концентрации 0,01 мг/мл культуры. Результаты теста выражали количеством бластных форм лимфоцитов (%) [8].
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили путем вычисления г-коэффициента Спирмена.
Результаты
В ответ на попадание вируса в макроорганизм срабатывают врожденные и адаптивные механизмы иммунного ответа, направленные на ограничение и элиминацию инфекции. В связи с этим вирусы для обеспечения собственного выживания используют пути, позволяющие им избежать действия защитных реакций организма [3, 12, 15]. Так, HBV и HCV способны подавлять индукцию иммунного ответа путем блокирования процессинга и презентации антигенов, «мимикрии» собственных антигенных детерминант, а также путем накопления мутаций «иммунного ускользания»
[18, 21, 23]. Кроме этого, вирусы могут угнетать реализацию иммунного ответа за счет высокой вирусной нагрузки, в результате чего развивается истощение и нарушение функции Т-клеточного звена, играющего ключевую роль в формировании противовирусного иммунитета [18, 24].
По данным литературы, при острой HBV- и HCV-инфекции мощный противовирусный ответ Т-лимфоцитов способствует элиминации вируса, в то время как при хроническом гепатите специфический Т-клеточный ответ ослаблен или отсутствует [2, 3, 6, 12, 19]. Результаты, полученные в ходе нашего исследования, также свидетельствуют о дефекте Т-клеточного звена иммунитета, как в количественном, так и в качественном составе клеток. Так, у пациентов с ХГВ В, С и В+С было выявлено статистически значимое снижение среднего уровня относительного содержания CD3+- и CD4+-клеток по сравнению с соответствующими показателями у здоровых доноров (Таблица 1).
В настоящее время в литературе обсуждается достаточно широкий спектр возможных механизмов, посредством которых вирусы способны оказывать депрессивное действие на иммунную систему [4, 13, 22]. В частности, HCV способен влиять на процесс активации CD4+-Th, нарушая взаимодействие антигенпрезентирующих клеток с Т-лимфоцитами. В ряде исследований показана также возможность процессинга неиммуноген-ных фрагментов шге-белка, которые нарушают распознавание шге-протеина и ингибируют активацию CD4+-клеток [6, 21]. Кроме этого, пер-систенция HBV и HCV в мононуклеарных лейкоцитах может стать причиной их поражения в результате дизрегуляции апоптоза. Вместе с тем дефект популяции CD4+-лимфоцитов может быть опосредован развивающимся в ходе длительной персистенции дисбалансом продукции ^-1/^-2 цитокинов [7, 25].
Следует отметить, что среди механизмов клеточной защиты в противовирусном иммунитете ведущее место занимают CD8+-цитотоксические лимфоциты, основная функция которых направлена на эрадикацию возбудителя, что обусловлено, с одной стороны, их способностью непосредственно вызывать гибель инфицированных клеток, а с другой — способностью продуцировать противовирусные факторы [11]. В современной литературе имеются данные о том, что клетки, экспрессирующие CD8+-рецептор, являются активными и многочисленными при острой саморазрешаю-щейся инфекции, тогда как они фактически не обнаруживаются в случае хронизации процесса [11, 20]. В ходе проведенного нами исследования абсолютное и относительное содержание CD8+-
лимфоцитов у пациентов с ХВГ статистически значимо не отличались от соответствующих показателей у здоровых доноров (Таблица 1).
При хронической вирусной персистенции существенное прогностическое значение имеет соотношение числа СD4+- и СD8+-экспрессиру-ющих лимфоцитов, отражающее эффективность клеточного иммунного ответа. По результатам нашего исследования у пациентов с ХВГ В, С и В+С было выявлено достоверное снижение им-мунорегуляторного индекса (СD4+/СD8+), что подтвердило предположение о слабом пролиферативном ответе Т-клеток на вирусные антигены (Таблица 1).
Не менее важная роль в защите организма от внутриклеточных патогенов отводится механизмам неспецифической резистентности, представленной, в основном, интерферонами и NK-клетками (СD56+). Последние по эффектор-ным функциям являются киллерами, способными индуцировать апоптоз в клетках-мишенях, и вместе с тем обладают способностью продуцировать цитокины (№N-7, TNF-a, ^-5, ^-8). Зарегистрированное нами достоверное снижение абсолютного и относительного содержания СD56+-клеток у пациентов с ХВГ В, С и В+С (Таблица 1), возможно, объясняется дефицитом основного активатора NK-клеток — ^-2 либо снижением секреции макрофагами ^-12, способного многократно увеличивать активность естественных киллеров [7, 11, 15].
Согласно современным представлениям, ключевая роль в формировании противовирусной защиты принадлежит Т-звену системы иммунитета,
однако известно, что определенный вклад в защиту организма от вирусов вносит и гуморальный иммунный ответ. Специфический В-клеточный ответ направлен на нейтрализацию вирусных антигенов в крови и межклеточном пространстве, а также защиту от повторного реинфицирования [2, 3, 7, 19]. Хотя имеются сведения о том, что возможно повторное инфицирование вирусами, причем не только иными, но и гомологичными штаммами [10]. Таким образом, вырабатываемые в ходе иммунного ответа антитела нацелены лишь на профилактику и успешное разрешение острого конфликта, в случае же хронизации инфекции они малоэффективны [17]. Проведенное нами исследование количества клеток, экспрессирующих общий популяционный маркер В-клеток (СD22+), не выявило достоверных изменений по сравнению с контролем (Таблица 1).
Установлено, что все модуляторы функциональной активности лимфоцитов, в том числе и вирусы, способны изменять метаболизм клетки, переключая субстратный поток с одного метаболического пути на другой. Именно в клетке начинается формирование ответных реакций на внешнее воздействие, позволяющее составить представление об иммунной стратегии, избранной организмом [3, 8, 16]. Исследование цитохимического статуса лимфоцитов периферической крови у пациентов с ХГВ В, С и В+С свидетельствовало об изменении характера внутриклеточного метаболизма. Так, у обследованных пациентов средние величины цитохимических коэффициентов, позволяющих судить о содержании липидов и активности неспецифической эстеразы в
Иммунофенотип лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С, В+С; ( X ±ш)
Таблица 1
Показатели Здоровые доноры Пациенты с хроническим вирусным гепатитом
В С В+С
Общее количество лимфоцитов 109/л 2,70±0,09 3,23±0,45 2,52±0,19 2,86±0,39
% 43,97±0,85 49,84±2,05 43,34±2,19 45,77±3,61
CD3+ 109/л 1,59±0,32 1,39±0,13 1,46±0,17 1,55±0,44
% 66,17±1,87 54,50±3,51** 57,08±3,52** 59,95±2,02***
CD4+ 109/л 0,56±0,14 0,45±0,09 0,36±0,07 0,28±0,07
% 42,45±3,11 21,35±2,43* 28,53±3,07** 26,24±2,97**
CD8+ 109/л 0,71±0,15 0,58±0,11 0,68±0,08 0,71±0,11
% 28,93±1,26 23,77±3,32 29,36±2,96 27,20±2,35
CD56+ 109/л 0,42±0,11 0,21±0,07** 0,29±0,06*** 0,26±0,05***
% 17,23±1,59 7,84±1,08** 12,34±1,91*** 10,35±1,57**
CD22+ 109/л 0,35±0,05 0,33±0,06 0,43±0,07 0,38±0,09
% 15,72±0,77 13,82±1,58 18,62±1,88 13,72±2,35
CD4+/CD8+, усл. ед. 1,48±0,09 0,80±0,15** 1,00±0,12*** 0,93±0,14***
Примечание. * — р<0,001, ** — р<0,01, *** — р<0,05 достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.
Таблица 2
Метаболические и функциональные свойства лимфоцитов периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С, В+С; ( X ±ш)
Показатели Здоровые доноры Пациенты с хроническим вирусным гепатитом
В С В+С
Средний цитохимический коэффициент, усл. ед. Содержание липидов 0,08±0,04 0,49±0,08* 0,40±0,06** 0,54±0,09*
Содержание гликогена 1,08±0,02 1,08±0,03 1,05±0,05 1,07±0,06
Активность неспецифической эстеразы 1,14±0,04 1,96±0,11*** 2,06±0,15** 1,99±0,09***
Активность кислой фосфатазы 1,51±0,13 1,21±0,08 1,35±0,07 1,40±0,09
Пролиферативная активность, % бластных форм 71,46±1,05 90,71±1,75** 86,70±1,63*** 87,74±1,39***
Примечание. * — р<0,001, ** — р<0,01, *** — р<0,05 достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.
лимфоцитах, статистически значимо превышали соответствующие показатели у здоровых доноров (Таблица 2). С одной стороны, увеличение активности неспецифической эстеразы и содержания липидов в лимфоцитах могло быть связано с возможной внутриклеточной перестройкой, вызванной вмешательством вирусов, вероятно, способных оказывать стимулирующее влияние на метаболическую активность инфицированных клеток [16]. С другой стороны, увеличение функциональной активности лимфоцитарных клеток у пациентов с ХВГ, зарегистрированное нами в стимулированной фитогемагглютинином реакции бласттрансформации in vitro (Таблица 2), могло сопровождаться изменением метаболических показателей, поскольку метаболизм лимфоцитов во многом определяет участие иммунокомпетен-тных клеток в процессах распознавания возбудителя и формирования иммунного ответа, отражая общую направленность регуляторных процессов целостного организма [8].
Заключение
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что хронический вирусный гепатит сопровождается отчетливыми иммунофенотипическими и функционально-метаболическими изменениями лимфоцитов периферической крови. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С имеется дефект Т-клеточного звена иммунитета (снижение числа зрелых Т-лимфоцитов, Т-хелперов-индук-торов, а также иммунорегуляторного индекса), неспецифической резистентности (уменьшение содержания натуральных киллеров) на фоне повышения содержания липидов и активности неспецифической эстеразы в лимфоцитах и способности лимфоцитарных клеток к пролиферации.
Исследование выполнено при поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ Российской Федерации № НШ-1051.2003.4. ________
IMMUNOPHENOTIPICAL AND FUNCTIONAL-METABOLIC PARTICULARITIES OF LYMPHOCYTES AT CHRONIC VIRAL HEPATITIS
I.O. Naslednikova, N.V. Ryazantseva,
E.V. Beloborodova, V.V. Novitsky,
E.I. Beloborodova, O.B. Zhukova, A.P. Zima,
M.A. Antoshina, V. V. Belokon’
The chronic viral hepatitis is accompanied well-marked immunophenotipical and functional-metabolic changes of lymphocytes of peripherial blood. Patients with chronic viral hepatitis В, С, B+C have defect of Т-link immunity (the reduction of number mature Т-lymphocytes, Т-helper-inductors, as well as immunoregulating index), nonspecific resistance (the reduction of the contents natural killers) on background of increasing of the contents of lipids and activities of nonspecific esterase in lymphocytes and abilities of lymphocytes to proliferation.
Литература
1. Анализ белков вируса гепатита С в клетках печени больных хроническим гепатитом С / О.В. Масалова, А.Г. Абдулмеджилова, Т.В. Шкурко и др. // Вопр. вирусологии. — 2003. — № 1. — С. 9-14.
2. Апросина З.Г. Патогенез хронического гепатита В / З.Г. Апросина, В.В. Серов // Архив патологии.
— 2001. — Т. 63. — № 2. — С. 58-61.
3. Взаимодействие вирусов гепатита В и С с клетками иммунной системы макроорганизма / В.Т. Ивашкин, С.Н. Мамаев, А.О. Буеверов, Ю.О. Шульпекова // Клиническая лабораторная диагностика. — 2001. — № 7. — С. 45-48.
4. Внепеченочные проявления хронических вирусных заболеваний печени / З.Г. Апросина, В.В. Серов, П.Е. Крель, Т.М. Игнатова // Архив патологии. — 1999.
— № 5. — С. 51-55.
5. Гольдберг Е.Д. Методы культуры тканей в гематологии / Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, В.П. Шахов.
— Томск, 1992. — 204 с.
6. Закономерности персистенции HCV в плазме и лейкоцитах при хронической HCV-инфекции / Н.Д. Ющук, О.О. Знойко, Е.А. Климова и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопрокто-логии. — 2000. — № 4. — С. 59-63.
7. Иммунорегуляторные ТЫ- и ТЬ2-цитокины при хронических инфекциях, вызванных вирусами гепатитов В и С / Л.С. Приймяги, В.Т. Тефанова, Т.Г. Талло и др. // Вопросы вирусологии. — 2003. — № 4. — С. 37-40.
8. Клетки крови — современные технологии их анализа / Г.И. Козинец, В.М. Погорелов, Д.А. Шмаров и др. — М., 2002. — 200 с.
9. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / В.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотницкая и др.; Под ред. В.В. Меньшикова.
— М., 1987. — 368 с.
10. Львов Д.К. Вирусные гепатиты / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. — 2002. — № 6. — С. 44-46.
11. Маммаев С.Н. Субпопуляционный состав лимфоцитов крови больных хроническим гепатитом С в динамике интерферонотерапии / С.Н. Маммаев // Клиническая лабораторная диагностика. — 2002.
— № 6. — С. 15-18.
12. Персистенция вирусов: иммунологические и патогенетические аспекты / А.Н. Маянский., А.Н. Бурков, Д.Г. Астафьев, С.П. Россанов // Клиническая медицина. — 1998. — № 12. — С. 19-25.
13. Серов В.В. Иммунопатология хронических вирусных заболеваний печени / В.В. Серов, Н.А. Мухин // Вестник РАМН. — 2000. — № 11. — С. 44-47.
14. Стандартизация методов иммунофенотипирова-ния клеток крови и костного мозга человека / А. А. Тото-
лян, И. А. Балдуева, Л. Н. Бубнова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. — 2002. — № 1. — С. 44-50.
15. Хаитов Р.М. Современные представления о защите организма от инфекции / Р.М. Хаитов, Б.В. Пине-гин // Иммунология. — 2000. — № 1. — С. 61-64.
16. Хейхоу Дж.Ф.Г. Гематологическая цитохимия / Дж. Хейхоу, Д. Кваглино. — М., 1983. — 319 с.
17. Хронический вирусный гепатит / В.В. Серов,
З.Г. Апросина, Т.М. Игнатова // Вестник РАМН. — 2003. — № 4. — С. 34-38.
18. Хронический вирусный гепатит С: особенности иммунитета у больных с персистенцией вируса в моно-нуклеарных клетках / И.Ф. Фридлянд, О.Н. Гришаева, М.П. Гришаев и др. // Иммунология. — 2002. — № 2.
— С. 121-124.
19. Antiviral cell-mediated immune responses during hepatitis B and hepatitis C virus infections / C. Ferrari, A. Penna, A. Bertoletti et al. // Recent Results Cancer Res.
— 1998. — Vol. 154. — P. 330-336.
20. Armerding D. Functional cutaneous Lymphocyte antigen can be indused in essentially all peripheral blood T lymphocytes / D. Armerding, T.S. Kupper // Int. Arch. Allergy Immunol. — 1999. — Vol. 119. — P. 212-222.
21. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection / A.G. Freeman, G. Marinos, R.A. French, A.R. Lloyd // Immunology and Cell Biology. — 2001. — Vol. 79. — P. 515-536.
22. Koziel M.J. The role of immune responses in the pathogenesis of hepatitis C virus infection / M.J. Koziel. // J. Vir. Hepat. — 1997. — Vol. 4. — № 2. — P. 31-41.
23. Lok A.S.F. Hepatitis B infection: pathogenesis and menegement / A.S. F. Lok // J. Hepatology. — 2000. — Vol. 32. — P. 89-97.
24. Reiner S.I. T helper cell differentiation in immune response / S.I. Reiner, R.A. Seder // Curr. Opin. Immunol.
— 1995. — Vol. 7. — P. 360-366.
25. Romagnani S. The Th1/Th2 paradigm / S. Ro-magnani // Immunol. Today. — 1997. — Vol. 18. — P. 263-266.
