CC BY
54Физика живого, Т. 17, No 2, 2009. С.62-67. © Паливода К. О.
УДК 54-72: 576.385.5+616.155.392
ДІЯ СТАУРОСПОРИНА ЯК ІНДУКТОРА АПОПТОЗУ У ТИМОЦИТАХ ТА Т- ЛІМФОЦИТАХ JURKAT
Паливода К.О.1,2
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра біохімії 2Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ, лабораторія сигнальних механізмів клітини
E-mail: zuav@ukr.net
Поступила в редакцию 14.06.2009
Доведено, що стауроспорин (STS) у діапазоні концентрацій 0,01-1 цМ діє як індуктор апоптозу нормальних (тимоцити щура) і онкотрансформованих (Т-лімфоцити лінії Jurkat) клітин, проте динаміка зниження життєздатності клітин та зростання в них вмісту активованої форми каспази-3 вказує на більш ранню реакцію тимоцитів на дію цього апоптогенного чинника. Преінкубація клітин з фулеренами С60 (10-5 М) послаблює цитотоксичну дію STS у тимоцитах, але не у клітинах Jurkat. Припускається, що можливою причиною вибірковості дії фулеренів С60 є їх різна локалізація та вплив на різні ділянки сигнальної трансдукції у клітинах двох типів.
Ключові слова: стауроспорин, апоптоз, тимоцити, Jurkat, фулерени С60
ВСТУП
Останнім часом активно розвивається напрямок, пов’язаний зі з’ясуванням біохімічних механізмів загибелі нормальних та трансформованих клітин та пошуку шляхів ефективного пригнічення проліферації пухлинних клітин. Припускають, що перспективним для терапії онкозахворювань, зокрема, лейкемій, може бути застосування індукторів апоптозу, до яких належить стауроспорин (STS). Ефект протипухлинних препаратів найчастіше реалізується шляхом безпосереднього впливу на різні ланки передачі регуляторних апоптичних сигналів - це блокування активності рецепторних білків, пригнічення активності тирозинових протеїнкіназ, зміна експресії генів-регуляторів апоптозу. Однак, у багатьох випадках пухлинні клітини уникають апоптозу внаслідок активації антиапоптотичних механізмів, тоді як нормальні клітини зазнають пошкодження. Тому важливим для розробки хіміотерапевтичних засобів є врахування відмінностей між пухлинними і нормальними клітинами та пошук шляхів вибіркового модулювання їх загибелі чи виживання.
Упродовж останніх років особливу увагу дослідників привертають нанорозмірні вуглецеві сполуки - фулерени С60, які виявляють біологічну активність. Завдяки сферичній формі, малим розмірам (0,7 нм у діаметрі) та гідрофобності молекула С60 здатна вбудовуватись у клітинну мембрану [1], взаємодіяти з різними біологічними молекулами, зокрема з білками і нуклеїновими
кислотами, брати участь у процесах вільнорадикального окислення у біологічних
системах [2] та модулювати проведення
регуляторних сигналів у клітині [3]. Однак, участь фулеренів С60 у внутрішньоклітинних сигнальних механізмах, що опосередковують процеси росту, ділення та апоптозу клітин, залишаються недостатньо дослідженими.
Зручними модельними системами для дослідження дії індукторів апоптозу in vitro є суспензія ізольованих тимоцитів - неповністю диференційованих Т-клітин, які характеризуються вищою, порівняно з іншими клітинами,
нестабільністю геному та нижчою активністю систем репарації однониткових розривів ДНК, що полегшує активацію шляхів апоптозу, а також клітини Jurkat - стабільна лінія Т-лімфоцитів хворої на лейкемію людини.
Метою роботи було оцінити апоптогенну дію стауроспорину на нормальні (тимоцити щура) та трансформовані (клітини лінії Jurkat) Т-лімфоцити в контролі та за преінкубації клітин з фулеренами С60.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
У дослідах використовували самок щурів лінії Вістар масою 150-180 г. Тимоцити отримували шляхом перетирання тимусу через нейлоновий фільтр у середовищі RPMI 1640. Клітини лінії Jurkat були люб’язно надані проф., д.б.н. Дробот Л.Б з банку клітин лабораторії сигнальних механізмів клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ. Клітини вирощували в СО2-
інкубаторі в атмосфері 5% СО2 при 37°С в середовищі RPMI 1640, що містило 10% ембріональну сироватку теляти. Кількість клітин підраховували за допомогою світлового мікроскопу Olympus „СКХ 41SF” у камері Нойбауера з використанням 0,2% розчину трипанового синього.
Клітини інкубували у середовищі RPMI 1640 упродовж 1, 6 та 24 год без добавок або за умови додавання STS (Sigma, USA) у концентраціях 0,01,
0,1, 1 цМ. Преінкубацію клітин з фулеренами С60 (кінцева концентрація у пробі 10 "5 М) здійснювали упродовж 1 год, після чого вносили STS.
Життєздатність клітин оцінювали за активністю мітохондріального електрон-транспортного ланцюга, яку визначали за допомогою тесту з МТТ-реактивом [4]. В основу методу покладено здатність мітохондріальних дегідрогеназ дихального ланцюга перетворювати МТТ на формазан. Вміст утвореного формазану визначали спектрофотометрично за А=570 нм (спектрофотометр ^.Quant, BioTek, USA). Життєздатність клітин за дії STS виражали у процентах відносно контролю. Клітини Jurkat є стабільною клітинною лінією, їх життєздатність після інкубації протягом 24 год у контролі не змінювалась. Первинна культура тимоцитів щура є переживаючою, після 24 год інкубації життєздатність тимоцитів у контролі знижувалась на 38±5%.
Активацію каспази-3 оцінювали методом Вестерн-блот аналізу [5]. Клітини відмивали від середовища фосфатним буфером і отримували клітинний лізат. Концентрацію білка визначали за допомогою BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Електрофоретичне розділення білків клітинного лізату (зразки по 30 p,g) здійснювали в 15 % SDS - поліакриламідному гелі [6]. Розділені у ПААГ білки переносили на полівінілдифторидну мембрану, яку блокували 5% сухим молоком у фосфатному буфері з 0,1% Tвін-20 протягом 1 год, після чого проводили інкубацію з першими антитілами протягом ночі при 4°С. Мембрани відмивали і інкубували з другими анти-кролячими антитілами, кон’югованими з пероксидазою хрону, протягом 1 год. Детекцію імунореактивних смуг здійснювали методом посиленої хемілюмінісценції (ECL, plusWestern blotting detection system (Amersham, Arlingtn Height, IL, USA).). В якості контролю рівномірності нанесення білка використовували Р-актин.
Стабільні колоїдні розчини фулеренів С60 (2,4 x10-4 М) було виготовлено в Технічному університеті Ільменау (Німеччина). Метод отримання такого розчину базується на перенесенні фулеренів С60 з органічного розчинника (толуолу) у воду. Рівномірний розподіл молекул С60 досягається при тривалій обробці розчину ультразвуком. Для приготування водорозчинних фулеренів було використано зразки фулеренів С60 з чистотою >99.5 %) [7].
Експериментальні дані оброблялись
статистично з використанням ^-критерію Стьюдента. Статистичний аналіз одержаних даних здійснювали в режимі програмного забезпечення Exel.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Як індуктор клітинної загибелі нормальних та трансформованих Т-лімфоцитів було обрано мікотоксин стауроспорин, який індукує апоптоз у клітинах різних типів [8, 9]. Стауроспорин є неселективним інгібітором внутрішньоклітинних протеїнкіназ РКА (Кі=7,0 нМ), PKG (Кі=8,5 нМ), РКС (Кі=0,7 нМ), СаМК (ІС50=20 нМ), тирозинових кіназ (ІС50=70 нМ), кінази фосфорилази (ІС50=0,5 нМ), інгібування яких здійснюється за рахунок взаємодії з АТФ-зв’язувальним сайтом. Викликаний STS апоптоз відбувається за механізмом, контрольованим білком Вс1-2. Проте, внутрішньоклітинні сигнальні механізми ініційованого STS апоптозу залишаються ще не повністю відомими і залежать від типу клітин.
А
Б
Рис. 1. Життєздатність тимоцитів (А) та клітин Jurkat (Б) після інкубації з STS у різних концентраціях (0,01, 0,1, 1 цМ)
Вплив STS на життєздатність тимоцитів та клітин лінії Jurkat досліджували у динаміці після його внесення у середовище інкубації клітин у
Паливода К.О.
концентраціях 0,01, 0,1 та 1 цМ. Як видно з представлених на рис. 1 даних, STS спричиняє виразний цитотоксичний ефект, концентраційна залежність та швидкість виявлення якого у клітинах двох типів відрізняються.
Життєздатність тимоцитів знижується вже через 6 год - за 0,1 цМ концентрації STS - на 20±4%, а у разі підвищення концентрації STS до 1 цМ - на 35±5%. Хоча цитотоксична дія STS на тимоцити виявляється досить швидко, через 24 год життєздатність клітин навіть за 1 цМ концентрації агента знижується не більше, ніж на 60±1% (рис. 1А). Можливою причиною цього може бути неоднорідність популяції тимоцитів, серед яких чутливими до індукторів апоптозу (таких, як дексаметазон, АТФ, іони Са2) є лише попередники периферичних Т-лімфоцитів - медулярні тимоцити, які швидко діляться [10].
Життєздатність Т-клітин Jurkat у період до 6 год після інкубації з STS у досліджуваному діапазоні концентрацій не знижується. Проте через 24 год спостерігається значне, залежне від концентрації STS, падіння показника. За 0,01 цМ концентрації STS спричиняв такий же ефект, як у тимоцитах - падіння життєздатності на 42±3 %, але у разі підвищення концентрації STS до 0,1 та 1,0 цМ життєздатність клітин Jurkat знижувалась на 67±3 % та 89±4 % відповідно.
Зниження життєздатності тимоцитів та Т-клітин Jurkat за дії STS може бути свідченням клітинної загибелі за механізмом апоптозу. Для підтвердження цього було досліджено активацію каспази-3 як маркера апоптозу [11]. Каспаза-3
експресується в клітинах у вигляді неактивного попередника з молекулярною масою 35 кДа. На завершальних етапах апоптозу внаслідок дії регуляторних каспаз відбувається активація каспази-3 шляхом протеолітичного розщеплення попередника на два каталітично активні фрагменти з молекулярними масами 17 і 19 кДа. При використанні методики Вестерн-блот аналізу можуть детектуватися одна (17 кДа) або обидві (і
17, і 19 кДа) смуги білку, що залежить від типу клітин, природи апоптогенного фактору та тривалості його впливу.
Для з’ясування того, чи залучена каспаза-3 до механізмів цитотоксичної дії STS, оцінювали активацію ензиму у тимоцитах та Т-клітинах Jurkat на ранніх етапах (1 та 4 год) після дії STS у концентраціях 0,01 та 0,1 цМ.
Активацію каспази-3 у тимоцитах виявлено вже через 1 год після дії STS у концентрації 0,1 цМ -вміст активованої 17 кДа-субодиниці у клітинному лізаті значно перевищує контрольний (Рис. 2). У Т-лімфоцитах Jurkat через 1 год після дії STS активація каспази-3 не відбувається. Через 4 год після дії STS активацію каспази-3 виявлено в обох типах клітин. Цей ефект є концентраційно залежним — за 0,1 цМ концентрації чинника вміст 17 кДа-субодиниці зростає більшою мірою, ніж за його 0,01 цМ концентрації. У клітинах лінії Jurkat окрім субодиниці з молекулярною масою 17 кДа, ідентифікується також 19 кДа-субодиниця як один з продуктів розщеплення неактивного попередника каспази-3 (рис. 2).
Тимоцити г0, 01 цМ STS- г0,1 цМ STS-
4 год 1 год 4год Ігод 4год
^17 кДа
Р-актин
Jurkat
4 год
г0, 01 цМ STS-1 год 4год
г0,1 цМ STS-1год 4год
^19 кДа ^17 кДа
-актин
Рис. 2. Вестерн-блот аналіз активації каспази-3 в тимоцитах та клітинах лінії Jurkat після дії STS у 0,01 та 0,1 цМ концентрації
Таким чином, і нормальні, і пухлинні клітини внаслідок впливу STS зазнають загибелі шляхом апоптозу. У дослідженнях на клітинах лінії HCEC [12] та на епітеліальних клітинах рогівки ока телят [13] також показано, що через 3 год після дії STS у концентраціях 0,2 та 1 цМ відповідно відбувається активація каспази-3. Той факт, що у тимоцитах та у клітинах лінії Jurkat STS спричиняє активацію каспази-3 у набагато нижчих концентраціях, свідчить про високу чутливість Т-клітин до дії цього апоптогенного чинника.
Слід відзначити, що апоптогенний ефект STS у тимоцитах виявляється за його нижчих
концентрацій і у більш ранній термін, ніж у
клітинах Jurkat. Згідно літературних даних, STS спричиняє апоптоз й інших нормальних клітин, таких як кардіоміоцити [14], епітеліоцити [13] та гепатоцити [15], що обмежує його можливе застосування для протипухлинної терапії на рівні цілого організму.
Щоб з’ясувати можливість модулювання апоптогенної дії STS у нормальних і
трансформованих клітинах, було проведено експерименти із застосуванням фулеренів C60 та STS у 0,01 цМ концентрації, за якої через 24 год
спостерігалось приблизно однакове зниження життєздатності тимоцитів та клітин Jurkat (на 44±5 та 42±3 % відповідно). Клітини попередньо
інкубували упродовж 1 год без фулеренів C60, або за наявності 10-5М фулеренів C60, після чого вносили STS та оцінювали життєздатність через 24 год.
Рис. 3. Вплив фулеренів С6о на життєздатність тимоцитів та клітин Jurkat за дії 0,01 цМ STS. Клітини попередньо інкубували упродовж 1 год без С60 або за наявності 10-5 М фулеренів С60, після чого вносили STS та оцінювали життєздатність через 24 год.
Примітки: * - різниця достовірна (Р<0,05) по
відношенню до значення без додавання фулеренів.
Встановлено, що у разі преінкубації тимоцитів з фулеренами C60 (10-5М) протягом 1 год
цитотоксичний ефект стауроспорина
послаблюється - життєздатність клітин підвищується на 25±9 % (Рис. 3). В
онкотрансформованих Т-клітинах протекторний
ефект фулеренів C60 був відсутній - преінкубація клітин з фулеренами C60 не впливала на спричинене дією STS зниження їх життєздатності (Рис. З). Таким чином, виявлено вибірковість у біологічній дії фулеренів C60 у нормальних та трансформованих Т-клітинах.
Виявлена відмінність у біологічній дії фулеренів C60 у тимоцитах та клітинах Jurkat може бути пов’язана з їх впливом на різні ланки проведення регуляторних сигналів, а також з особливостями їх внутрішньоклітинного розподілу. Літературні дані вказують на можливу участь фулеренів C60 в модифікації механізмів сигнальної трансдукції в клітинах різного тканинного походження. Зокрема, фулерени здатні впливати на апоптоз ендотеліальних клітин, діючи на експресію білка адгезії ICAM-1 [16] та модулювати сигнальну трансдукцію фактору росту-Р у гепатоцитах людини [17]. Немодифіковані фулерени C60 здатні зв’язуватись з клітинною поверхнею, вбудовуватись у плазматичну мембрану клітин. Mалігнізовані клітини деяких типів ефективно поглинають фулерени C60, які виявляються в цитоплазмі та мітохондріях [18, 1]. Питання щодо особливостей локалізації C60 у нормальних клітинах потребує подальшого дослідження.
ВИСНОВКИ
Таким чином, порівняльне дослідження дії стауроспорина на тимоцити та онкотрансформовані Т-лімфоцити показало зниження їх життєздатності, однак концентраційна залежність та швидкість виявлення цитотоксичного ефекту STS у клітинах двох типів відрізняються. Так, після дії 0,1мкM STS життєздатність тимоцитів знижується вже через 6 год, а клітин Jurkat - через 24 год. Виявлене підвищення вмісту активованої форми каспази-З доводить, що STS спричиняє загибель клітин за механізмом апоптозу. Причиною того, що за дії 0,1 ^M STS життєздатність тимоцитів знижується раніше, може бути більш швидка активація каспази-З, яка відбувається через 1 год, тоді як у клітинах Jurkat - через 4 год.
Той факт, що STS індукує апоптоз тимоцитів за нижчих концентрацій і у більш ранній термін, ніж клітин Jurkat, вказує на вірогідність небажаного цитотоксичного впливу цього чинника на нормальні клітини у разі його застосування для протипухлинної терапії на рівні організму.
Показано, що немодифіковані фулерени С60 частково протектують тимоцити від цитотоксичної дії STS. Так, життєздатність тимоцитів через 24 год після дії 0,1 ^M STS зростає на 25% у разі преінкубації з С60 (10-5M). Ці результати
підтверджують можливу участь фулеренів С60 у модифікації механізмів сигнальної трансдукції.
Паливода К.О.
Важливою є виявлена вибірковість протекторної дії С60, яка не виявляється в онкотрансформованих Т-клітинах - їх преінкубація з С60 не впливає на спричинене STS зниження життєздатності. Можливою причиною вибірковості дії фулеренів С60 є їх різна локалізація та вплив на різні регуляторні ділянки у клітинах двох типів. Отримані дані вказують на перспективність використання фулеренів С60 для направленої модифікації виживання нормальних та трансформованих клітин за дії апоптогенних чинників.
Література
1. Foley S., Crowley C., Smaihi M., Bonfils C., Erlanger B.F., Seta P., Larroque C. Cellular Localisation of a Water-Soluble Fullerene Derivative // Biochem. Biophys. Res. Commun - 2002. - Vol. 294. - P. 116-119.
2. Kamat J.P., Devasagayam T.P.A., Priyadarsini K.I., Mohan H. Reactive oxygen species mediated membrane damage induced by fullerene derivatives and its possible biological implications // Toxicology. - 2000. - Vol. 155.
- P. 55-61.
3. Bosi S., Da Ros T., Spalluto G., Prato M. Fullerene derivatives: an attractive tool for biological applications // Eur. J. Med. Chem. (Eur. J. of Med. Chemistry). - 2003. -Vol. 38. - P. 913-923.
4. Carmichael J., Degraff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D.,
Mitchell J.B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of
chemosensitivity testing // Cancer Res. - 1987. - Vol. 47.
- P. 936-942.
5. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Biotechnology. - 1992. - Vol. 24. - P. 145-149.
6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. -1970. - Vol. 227, № 259. - P. 680-685.
7. Scharff. P., Risch K., Carta-Abelmann L., Dmytruk I.M., Bilyi M.M., Golub O.A., Khavryuchenko A. V., Buzaneva E.V., Aksenov V.L., Avdeev M.V., Prylutskyy Yu.I. and Durov S.S. Structure of C60 fullerene in water: spectroscopic data // Carbon. - 2004. - Vol. 42. - P. 1203-1206.
8. Jacobsen M.D., Weil M., Raff M.C. Role of Ced-3/ICE-family proteases in staurosporine-induced programmed cell death // J Cell Biol. - 1996. - Vol. 133. - P. 1041-51.
9. Xia Z., Dickens M., Raingeaud J., Davis R.J., and Greenberg M.E. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis // Science. - 1995. - Vol. 270.
- P. 1326-31.
10. Ross P.E., Ehring G.R., Cahalan M.D. Dynamics of ATP-induced calcium signaling in single mouse thymocytes // J Cell Biol. - 1997. - Vol. 138, № 5. - P. 987-998.
11. Nicholson D.W., Thornberry N.A. Caspases: killer proteases // TIBS (Trends Biochem. Sci.). - 1997. - Vol. 22. - P. 299 - 306.
12. Thuret G., Chiquet C., Herrag S., Dumollard J-M., BoudardD., Bednarz J., Campos L., Gain P. Mechanisms of staurosporine induced apoptosis in a human corneal endothelial cell line // Br J Ophthalmol. - 2003. - Vol. 87.
- P. 346-352.
13. Andersson M., Sjostrand J., Petersen A., Honarvar A.K., Karlsson J.O. Caspase and proteasome activity during staurosporin-induced apoptosis in lens epithelial cells // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2000. - Vol. 41, № 9. - P. 2623-32.
14. Yue T.L., Wang C., Romanic A.M., Kikly K., Keller P., DeWolf W.E. Jr., Hart T.K., Thomas H.C., Storer B., Gu J.L., Wang X., Feuerstein G.Z. Staurosporine-induced apoptosis in cardiomyocytes: A potential role of caspase 3 // J Mol Cell Cardiol. - 1998 . - Vol. 30, № 3.
- P. 495-507.
15. Feng G., Kaplowitz N. Mechanism of staurosporine-induced apoptosis in murine hepatocytes // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. - 2002 - Vol. 282, №5.
- P. G825-34.
16. Gelderman M.P., Simakova O., Clogston J.D., Patri A.K., Siddiqui S.F., Vostal A.C., Simak J. Adverse effects of fullerenes on endothelial cells: Fullerenol C-60(0H)(24) induced tissue factor and ICAM-1 membrane expression and apoptosis in vitro // Int. J. Nanomedicine. - 2008. -Vol. 3. - P. 59-68.
17. Huang Y.L., Shen C.K., Luh T.Y., YangH.C., HwangK.C. and Chou C.K. Blockage of apoptotic signaling of transforming growth factor-beta in human hepatoma cells by carboxyfullerene // Eur. J. Biochem. - 1998. - Vol. 254, P. 38-43.
18. Levi N., Hantgan R.R., Lively M.O., Carroll D.L. and
Prasad G.L. C60-Fullerenes: detection of intracellular photoluminescence and lack of cytotoxic effects // Journal of Nanobiotechnology. - 2006. - Vol. 4, № 14.2.
ДЕЙСТВИЕ СТАУРОСПОРИНА КАК ИНДУКТОРА АПОПТОЗА В ТИМОЦИТАХ И Т-ЛИМФОЦИТАХ JURKAT
Паливода К.О.
Доказано, что стауроспорин (STS) в диапазоне концентраций 0,01-1 ^M действует в качестве индуктора апоптоза нормальных (тимоциты крыс) и онкотрансформированых (Т-лимфоциты линии Jurkat) клеток. Динамика снижения жизнеспособности клеток и увеличения содержания в них активированной формы каспазы-3 указывает на более раннюю реакцию тимоцитов на действие этого апоптогенного фактора. Преинкубация клеток с фуллеренами С60 (10-5 M) ослабляет цитотоксическое влияние STS на тимоциты, но не на клетки линии Jurkat. Предполагается, что избирательное действие фуллеренов С60 объясняется их различной локализацией и влиянием на различные звенья сигнальной трансдукции в клетках двух типов.
Ключевые слова:: стауроспорин, апоптоз, тимоциты, Jurkat, фуллерены С60.
THE EFFECT OF STAUROSPORINE AS APOPTOSIS INDUCER ON THYMOCYTES AND JURKAT T-LYMPHOCYTES
Palyvoda K.O.
The effect of staurosporine (0.01-1 ^M) as apoptosis inducer in normal rat thymocytes and transformed Jurkat line T cells is proved. The dynamics of cell viability decrease as well as of enhancing of activated caspase-3 level demonstrates earlier reaction of thymocytes on STS action. Preincubaton with C60 fullerenes (10-5 M) occurred to decrease the cytotoxic effect of STS on thymocytes, but not on Jurkat cells. It is assumed, that the specificity of C60 effect is determinated by its influence on distinct pathways of signal transducing and by different localization of C60 in the cells of two types.
Key words: staurosporine, apoptosis, thymocytes, Jurkat, C60 fullerene.
