CC BY
43
Результаты исследований
DOI: 10.24411/2071-5315-2018-11985
Дисфункция эндотелия, сосудистое воспаление и окислительный стресс у пациентов с хронической ишемией мозга при стенозах внутренних сонных артерий
^ А.И. Федин, Е.В. Старых, О.А. Баранова, А.В. Чеканов, И.В. Цой
Кафедра неврологии Факультета дополнительного профессионального образования ФГБОУВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" МЗ РФ, Москва
Статья посвящена изучению функции эндотелия, сосудистого воспаления и окислительного стресса у пациентов с хронической ишемией мозга при стенозах внутренних сонных артерий (ВСА). По мере увеличения степени атеросклеротических стенозов ВСА у пациентов с хронической ишемией мозга выявлено прогрессирование окислительного стресса и эндоте-лиальной дисфункции. Максимальная активность воспалительных процессов сосудистого эндотелия наблюдалась у пациентов с наименьшей выраженностью стенозов ВСА (до 30%). Определялась низкая активность фактора Виллебранда, особенно при стенозах менее 30%, что может свидетельствовать об активности компенсаторно-приспособительных процессов у таких больных.
Ключевые слова: эндотелиальная дисфункция, окислительный стресс, сосудистое воспаление, хроническая ишемия мозга, внутренние сонные артерии.
Диагностика и лечение хронической ишемии мозга (ХИМ) представляют собой одну из приоритетных задач современной неврологии. Особого интереса заслуживает исследование механизмов формирования эндотелиальной дисфункции, иммунологических реакций, сосудистого воспаления, гемостаза, окислительного стресса как ключевых звеньев в инициации гипертонического и атеросклеротического поражения сосудов [1—3]. Установлено, что отклонения от нормальных значений в показателях, характеризующих функцию эндотелия, определяются начиная с I стадии ХИМ [4, 5].
Многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют об активации процессов перекисного окисления липидов и повышении концентра-
Контактная информация: Федин Анатолий Иванович, [email protected]
ции их продуктов в плазме крови при ХИМ [6—10]. Полная окклюзионная ишемия мозга в эксперименте на животных сопровождается увеличением содержания продуктов перекисного окисления липидов начиная с 5-й минуты [7].
Процессы, характеризующие дисфункцию сосудистого эндотелия, воспаление и окислительный стресс, возникают при повреждении тканей и являются факторами как разрушения, так и защиты и заживления [11]. В связи с этим возникает закономерный вопрос: могут ли перечисленные факторы играть первичную роль в патогенезе цереброваскулярной патологии или они только сопровождают ее течение и ухудшают прогноз.
Как известно, одним из этиологических факторов ХИМ, а также транзитор-ных ишемических атак и острых нарушений мозгового кровообращения является
церебральный атеросклероз. В 40—60% случаев причиной очаговой или диффузной ишемии головного мозга могут быть стенозы брахиоцефальных артерий. В связи с тем что в 1/3 случаев стенозы церебральных артерий протекают бессимптомно, актуальным является изучение эндотелиальной дисфункции, сосудистого воспаления и окислительного стресса у больных с ХИМ при стенозах внутренних сонных артерий (ВСА) [12-14].
Цель работы: изучить функцию эндотелия, сосудистое воспаление и окислительный стресс у пациентов с ХИМ при атеро-склеротическом стенозе ВСА.
Материал и методы
В исследование включены пациенты, не имевшие острого нарушения мозгового кровообращения в анамнезе или перенесшие инсульт более чем за 1 год до начала исследования. Критериями исключения являлись сахарный диабет, заболевания крови, васкулиты, онкологические заболевания, выраженная сердечная недостаточность, а также прием препаратов, влияющих на функцию эндотелия, тонус сосудов, оксидантную/антиоксидантную системы.
Всем пациентам проводилось комплексное обследование с оценкой соматического и неврологического статуса. Выполнялись магнитно-резонансная томография головного мозга и ультразвуковое дуплексное сканирование брахиоцефальных артерий. В зависимости от степени выраженности стенозов ВСА пациенты были разделены на 3 группы: 1-я группа — со стенозами до 30%; 2-я группа — со стенозами от 30 до 70%; 3-я группа — со стенозами более 70%.
С целью изучения окислительного стресса измеряли количество SH-групп путем определения степени окисленности белков плазмы с использованием DTNB (10 мМ) в метаноле и Tris-EDTA (20 мМ) буфера (рН 8,2): 200 мл плазмы смешивали в пробирках объемом 10 мл с 0,6 мл Tris-EDTA буфера с последующим добав-
лением 40 мкл 10 мМ DTNB и 3,16 мл метанола. Смесь перемешивали и помещали в темное место, где наблюдали окрашивание в течение 15—20 мин, после чего смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем отбирали супернатант и измеряли оптическую плотность при 412 нм. Далее рассчитывали концентрацию SH-групп по формуле (А — 0,03) х 1,47, где А — оптическая плотность образца, 1,47 — коэффициент молярной экстинкции.
При добавлении к плазме крови источников свободных радикалов (в системе in vitro) при помощи метода люминолза-висимой хемилюминесценции определяли суммарную антиокислительную устойчивость растворимых компонентов плазмы. Измерения проводили при комнатной температуре на хемилюминомет-ре SMARTLUM 5773 ("Interoptika-S", Россия) при постоянном перемешивании образца. Стандартный образец содержал 10 мМ боратного буфера (рН 10,0), 10 мкМ люминола, 100 мкл плазмы, разбавленной в 100 раз, 10 мкМ водорастворимого азо-инициатора ААРН. Объем пробы составлял 1000 мкл. Реакцию запускали путем добавления через диспенсер 10 мкМ ААРН и измеряли интеграл спектра хемилюми-несценции. Степень тушения хемилюми-несценции рассчитывали как отношение значения интеграла хемилюминесценции в присутствии плазмы к величине интеграла хемилюминесценции в контроле (|Хл об-разца/|Хл контроля). Длительность измерения составляла 10 мин.
Функцию эндотелия оценивали при помощи исследования маркеров эндотелиаль-ной дисфункции и сосудистого воспаления: молекул межклеточной адгезии VCAM-1 (vascular cellular adhesion molecule-1 — молекула адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа), фактора Виллебранда и E-селектина. При осуществлении всех лабораторных методик в качестве антикоагулянта использовали цитрат натрия 3,8%. Количественное определение молекул межклеточной ад-Лечебное дело 1.2018|б
Результаты исследований
Таблица 1. Распределение больных в зависимости от степени стеноза ВСА
Больные
1-я группа 2-я группа 3-я группа
%
%
%
Общее 21 100,0 30 100,0 18 100,0
количество
Мужчины 12 57,1 17 56,7 13 72,2
Женщины 9 42,9 13 43,3 5 27,8
гезии VCAM-1 и Е-селектина проводили методом твердофазного иммунофермент-ного анализа по стандартной методике с использованием набора Bender MedSystems (Австрия). Кровь забирали утром натощак и центрифугировали при 1200 об/мин. Полученную плазму разливали в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и замораживали при —20°C.
Статистическую обработку результатов проводили при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, США). При статистической обработке оценивали такие параметры, как медиана, нижний и верхний квартили, также рассчитывали верхние и нижние процентили. В качестве критерия достоверности использовали статистический критерий Манна—Уитни для двух несвязанных групп и критерий Кру-скала—Уоллиса для трех и более несвязанных групп. Достоверными считали значения при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Распределение больных в зависимости от степени стеноза ВСА представлено в табл. 1. В 1-ю группу со стенозами ВСА до 30% вошел 21 пациент, во 2-ю группу со
Таблица 2. Распределение больных по возрасту
стенозами 30—70% — 30 пациентов, в 3-ю группу со стенозами более 70% — 18 пациентов.
В работе использовалась возрастная схема согласно классификации Всемирной организации здравоохранения: пациентами молодого возраста считались лица до 45 лет, среднего — от 45 до 59 лет, пожилого — от 60 до 74 лет и старческого — от 75 лет и старше. Медиана возраста пациентов составила 75,7 года (табл. 2).
Также в исследование было включено 10 практически здоровых добровольцев в возрасте от 20 до 25 лет для оценки содержания SH-групп в отсутствие атероскле-ротического стеноза ВСА. Практически здоровыми признавали лиц, имеющих нормальный уровень общего холестерина и триглицеридов, при отсутствии субъективных жалоб, объективной соматической и неврологической симптоматики. Необходимым условием считалось отсутствие в анамнезе черепно-мозговых травм и токсических поражений печени.
В рамках изучения сосудистого воспаления и эндотелиальной дисфункции исследовали молекулы межклеточной адгезии ^АМ-1 и Е-селектин. Повышение адге-зивности играет важную роль в патогенезе дисфункции эндотелия при воспалении и атеросклерозе. Известно, что процесс формирования атеросклеротической бляшки сопровождается сосудистым воспалением. Определенный нами уровень молекул межклеточной адгезии ^АМ-1 свидетельствует о более выраженном процессе сосудистого воспаления при атеросклеротическом поражении ВСА менее 30% в сравнении со
Количество больных
Группа
<45 лет
45—59 лет
0-74 года
>75 лет
n
%
1-я 0 1 4,8 10 34,5 10 27,8
2-я 0 1 3,3 10 34,5 19 52,7
3-я 0 2 11,1 9 31,0 7 19,5
стенозами ВСА более 30% (рис. 1). При стенозах до 30% уровень ^АМ-1 составил 41 [58,4; 35,2] нг/мл, при стенозах 30—70% — 20,0 [37,2; 14,3] нг/мл и при стенозах более 70% - 20,1 [22,3; 15,1] нг/мл. Различия достоверны между 1-й и 2-й, а также между 1-й и 3-й группами (р < 0,05).
Аналогичная тенденция отмечалась при исследовании маркера эндотелиальной дисфункции Е-селектина. Наибольшее значение данного показателя выявлено у пациентов с атеросклеротическим поражением ВСА до 30%, что свидетельствует о наиболее выраженном процессе воспаления у этих больных (рис. 2). При стенозах до 30% уровень Е-селектина составил 0,06 [0,07; 0,05] о.е.; при стенозах 30-70% - 0,03 [0,04; 0,02] о.е.; при стенозах более 70% — 0,03 [0,05; 0,03] о.е. Различия достоверны между 1-й и 2-й, а также между 1-й и 3-й группами (р < 0,05).
Таким образом, более активный процесс сосудистого воспаления наблюдался у пациентов с атеросклеротическим поражением ВСА до 30%. У пациентов с более выраженным стенозом ВСА показатели межклеточной адгезии ^АМ-1 и Е-селектин имели меньшие значения. Указанные изменения свидетельствуют об отсутствии активности воспаления у пациентов с гемо-динамически значимыми стенозами.
Функцию эндотелия изучали также при помощи определения активности фактора Виллебранда. Он участвует в первичном гемостазе, который осуществляется за счет адгезии тромбоцитов к поврежденным участкам сосудистой стенки, играет важную роль при формировании тромбов в артериальных капиллярах и мелких артериях. Адгезия тромбоцитов к стенке сосуда, опосредуемая фактором Виллебранда в месте повреждения, является одним из ранних событий запуска образования тром-боцитарной пробки. Полученные нами результаты свидетельствуют об усугублении эндотелиальной дисфункции по мере прогрессирования степени стеноза ВСА, что проявляется в тенденции к увеличе-
240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20
1-я группа 2-я группа 3-я группа
п Медиана □ 25-75%
~Г Минимум-максимум Рис. 1. Уровень VCAM-1 в зависимости от степени стеноза ВСА.
0,14
0,12
о 0,10
с
Я 0,08
е И 0,06
е с
к 0,04
0,02
0
1-я группа 2-я группа 3-я группа
п Медиана □ 25-75%
~Г Минимум-максимум Рис. 2. Уровень Е-селектина в зависимости от степени стеноза ВСА.
нию активности фактора Виллебранда при нарастании выраженности стеноза. В 1-й группе активность фактора Виллебранда составила 38,7%, во 2-й группе - 49,9%, в 3-й группе - 56,1% (рис. 3). Учитывая, что референсный диапазон для фактора Виллебранда составляет от 50 до 160%, в первых двух группах выявлены значения ниже
Результаты исследований
60
50
40
30
20
10
0
1-я группа 2-я группа 3-я группа Рис. 3. Активность фактора Виллебранда у пациентов с различной степенью стеноза ВСА.
0,50 0,45 ч 0,40 | 0,35
а 0,30 п уп
гру0,25 г
® 0,20 0,15 0,10
1-я группа 2-я группа 3-я группа
п Медиана □ 25-75%
I Минимум-максимум Рис. 4. Концентрация восстановленных SH-групп у пациентов с различной степенью стеноза ВСА.
референсных. Особенно низкие значения этого показателя наблюдались в 1-й группе.
Согласно данным литературы, повышение уровня фактора Виллебранда служит индикатором повреждения эндотелия при сосудистых заболеваниях [15-21]. Причем степень повышения указанного маркера является предиктором неблагоприятного исхода [22, 23]. Это подтверждает тот факт, что по мере прогрессирования стенозов ВСА ухудшается функция сосудистого эндотелия.
Увеличение содержания фактора Вил-лебранда в плазме крови наряду с повышением концентрации фибриногена может рассматриваться как основной предиктор гиперкоагуляции. В то же время известно, что в ответ на любое повреждение организм отвечает совокупностью реакций, способствующих возмещению нарушенной функции за счет деятельности неповрежденных систем или отдельных органов, что отражает работу компенсаторных механизмов.
Ф.З. Меерсон, который многие годы плодотворно изучает компенсаторные процессы, считает их типом адаптационных реакций организма на повреждение [24]. Таким образом, пониженное содержание фактора Виллебранда в плазме крови, особенно у больных с минимальной степенью выраженности стеноза, может быть расценено как проявление компенсаторных реакций организма в ответ на повреждение сосудистой стенки. Аналогичные данные о понижении уровня фактора Виллебранда при нарушении целостности церебрального эндотелия представлены ранее группой американских ученых [25].
Далее нами была проведена оценка окислительно-восстановительных свойств крови путем анализа концентрации восстановленных БЫ-групп, отражающих количество окисленных белков плазмы крови, и суммарной антиокислительной устойчивости плазмы крови. Сульфгидрильная БЫ-группа, содержащаяся в аминокислотном остатке цистеина, играет важную антиокислительную роль и обладает значительной реакционной способностью в окислительно-восстановительных реакциях. Концентрацию восстановленных БЫ-групп измеряли не только у пациентов со стенозами ВСА, но и у практически здоровых лиц. Этот параметр имел следующие значения: 0,41 [0,38; 0,51] ммоль/л в группе условно здоровых лиц, 0,29 [0,28; 0,35] ммоль/л у пациентов со стенозами ВСА до 30%, 0,26 [0,19; 0,29] ммоль/л у пациентов со стенозами 30-70% и 0,15
[0,13; 0,27] ммоль/л у пациентов со стенозами более 70%. Результаты исследования свидетельствуют о том, что уровень SH-групп имеет тенденцию к снижению по мере возрастания степени стеноза ВСА (рис. 4). Между всеми группами пациентов установлены достоверные различия (р < 0,05).
Выявленные изменения концентрации восстановленных SH-групп свидетельствуют о том, что окислительный стресс служит одним из ключевых патогенетических компонентов, обусловливающих развитие сте-нозирующего процесса ВСА.
Общая антиокислительная устойчивость плазмы крови достоверно не различалась между группами и составила 0,24 [0,18; 0,29] ЕД у пациентов со стенозами менее 30%, 0,28 [0,19; 0,33] ЕД при стенозах 30-70% и 0,25 [0,20; 0,45] ЕД при стенозах более 70%. Вероятнее всего, это связано с приемом некоторыми пациентами до начала исследования препаратов, относящихся к группе антиоксидантов, с учетом пожи-
лого возраста и отягощенного сосудистого анамнеза.
Таким образом, по мере увеличения степени атеросклеротического стеноза ВСА у пациентов с ХИМ имело место прогрес-сирование окислительного стресса и эндо-телиальной дисфункции. Максимальная активность воспалительных процессов сосудистого эндотелия наблюдалась у пациентов с наименьшей выраженностью стеноза ВСА (до 30%). Повышение активности фактора Виллебранда в крови при прогрессировании стеноза ВСА отражает, с одной стороны, нарастание повреждения сосудистого эндотелия, с другой - изменения в системе гемостаза. Выявленная недостаточность фактора Виллебранда, особенно у больных 1-й группы, может свидетельствовать об активности компенсаторно-приспособительных процессов.
Со списком литературы вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru
Endothelial Dysfunction, Vascular Inflammation and Oxidative Stress in Patients with Chronic Cerebral Ischemia and Internal Carotid Artery Stenosis A.I. Fedin, E.V. Starykh, O.A. Baranova, A.V. Chekanov, and I.V. Tsoy
The article is devoted to endothelial function, vascular inflammation and oxidative stress in patients with chronic cerebral ischemia and internal carotid artery stenosis. Oxidative stress and endothelial dysfunction progressed with increase in degree of internal carotid artery stenosis. The maximum activity of endothelial inflammation was observed in patients with the lowest degree of internal carotid artery stenosis (<30%). Deficiency of von Willebrand factor may indicate the activity of compensatory processes in patients with internal carotid artery stenosis <30%. Key words: endothelial dysfunction, oxidative stress, vascular inflammation, chronic cerebral ischemia, internal carotid arteries.
