CC BY
21
УДК 577.112:577.122:579.222
М1к-Сабат М.Я., астрант;
Калачнюк Л.Г., к.б.н., старший науковий сшвроб^ник;
Сухорська О.П., к.с-г.н., старший науковий сшвроб^ник;
Ключковська Ю.Р., аспiрант;
Баран М.*, д.б.н., професор, Калачнюк Г.1., д.б.н., професор НД1 бютехнолог1чних основ тдвищення продуктивност1 тварин ЛНУВМтаБТ ¡мет. С. З. Гжицького, Email: lilimarg@polynet.lviv.ua 1нститут ф1зюлогп тварин Словацьког АН, Кошще, Словацька Республжа
ДИНАМ1КА ЗМ1Н ЗОВШШНЬОКЛГГИННОГО РЕДОКС-ПОТЕНЦ1АЛУ (Eh) ТА ПОКАЗНИК1В ФЕРМЕНТАЦП ФРУКТАН1В РОСЛИННОГО Й БАКТЕР1АЛЬНОГО ПОХОДЖЕННЯ М1КРОБНОЮ ЕКОСИСТЕМОЮ
РУБЦЯ
Д1апазон вгдхилень в1д 'емних значень Eh у рубцевт мжробтй екосистем1
значно ширший при ферментацИ тулту пор1вняно з леваном (-160 --220 мВ
проти -155 —195 мВ). Вгдмгчет в1дхилення знаходяться у вгдповгднт лттнт залежност1 в1д змт рН, rH, суми ЛЖК i росту бюмаси м1крооргашзм1в (А6оо). Введення у культуральне середовище природного сорбенту клтоптилолту суттево тдсилюе ттенсивтсть утилiзацiíяк тулту, так i левану.
Для прискореного збыьшення продукцп енергИ, необхiдних промiжних сполук та процеЫв бюсинтезу у мжробтй екосистемi рубця доцыьно використовувати рослинний i бактерiальний фруктани у поеднант з природним сорбентом. При цьому вищий бюефект одержуеться при застосуваню низькомолекулярного полiмеру-iнулiну з (3(2 —1)-зв 'язками порiвняно з високомолекулярним леваном з (3(2—6)-зв 'язками.
Ключовi слова: редокс-потенщал (Eh), rH, рН, ЛЖК, рют мiкробноí бюмаси, тулт, леван, фруктани, рубцевий мжробний метаболiзм, клтоптилолт.
Фруктани - це група полiмерiв фруктози, як мютять один з двох фруктозил-фруктоза ковалентш зв'язки: ((2-1) чи ((2-6), i синтезуються багатьма рослинами та певними бактерiями [1, 2]. Важливо зазначити, що рослинш фруктани ^нулши й флеши з ((2- 1)-зв'язками) мають вщносно м^ ступеш полiмеризацil (до ~40) [12], а бактерiальнi (левани з ((2-6)-зв'язками) - дуже велию (>100000) [9]. Щоб засво1тися оргашзмом жуйно! тварини згадаш фруктани спочатку мусять розщепитися мшробною популящею шлунково-кишкового тракту (ШКТ) до мономерiв, а потiм до кiнцевих продукив ферментаци, у тому числi - до летких жирних кислот (ЛЖК). Як показали результати наших дослщжень, такий процес для кожного полiмеру протжае з рiзною швидкiстю [1, 6], а це мае суттеве значення для постачання необидно!
©Мк-Сабат МЯ., Калачнюк Л.Г., Сухорська О.П., Ключковська Ю.Р., Баран М, Калачнюк Г.1., 2008
83
енерги та pi3H0MamTH^ промiжних сполук, яю е важливими складовими для пiдтримання високого piBra реакцiй бiосинтезу de novo з ефективним використанням багатьох джерел азотовмшних речовин [3, 5-8, 10]. До цього ж, слщ додати, що сучасних бютехнолопв особливу увагу привертають новi науковi розробки щодо збшьшення piвня дiетичних вуглеводiв, i зокрема фрукташв, у ботанiчному складi пасовищ з метою пiдвищення ефективностi засвоення тваринною !х легкоперетравних джерел азоту [1, 5, 10]. Бактеpiальнi фруктани також можна наробляти мжробюлопчними способами. Враховуючи вищесказане, вченим сьогоднi необхщно знати бiльше про можливостi й ефектившсть використання фpуктанiв piзного походження оргашзмом жуйних та iнших тварин, що й спонукало нас провести ряд комплексних фiзiолого-бiохiмiчних дослщжень у цьому напpямi, частину яких наведено нижче.
Матер1али i методи. Дослiдження проводили в умовах in vivo та in vitro. Джерелом змшаних мжробних популяцiй було вмютиме рубця телят 3-мiсячного вшу, яке вiдбиpали носостpавохiдним зондом i фiльтpували через нейлонову матеpiю. Дослщження в умовах in vitro здшснювали за методикою, що була описана рашше [3, 7].
Рослинний фруктан - ^лш iз кореня Chicory root з Р(2^1)-зв'язками, бактеpiальний леван iз Erwinia herbicola (виробництво Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) та iншi реактиви люб'язно були надаш нам 1нститутом фiзiологil та генетики тварин Чесько! АН (Прага) й 1нститутом фiзiологil тварин Словацько! АН (Кошiце) [1 - 3]. Дослщжуваш субстрати розчиняли у штучнш слинi (буфер McDougall) iз вмютом штучно! сечовини, дpiжджового екстракту, панкреатичного гiдpолiзату казе!ну (в 1 л було 0,45 г N), в^амшв i мшроелеменив. У якостi контролю використовували тшьки пpоцiджену через нейлонову матеpiю рубцеву рщину, яку iнкубували за аналопчних умов, тобто застосовували згадану рщину, змшану iз штучною слиною у пропорци 1:2. У дослiдних ваpiантах до iнкубату додавали ще фруктани у кшькостях 2 мг/мл. Порошок клшоптилол^ тониною помелу 0,05-1,00 мм [1, 6] вносили в кшькостях 6-10 мг/мл. Через кожну (0,5) 1 годину шкубаци вщбирали проби для визначення змiн pедокс-потенцiалу з допомогою платинових електpодiв. Для калiбpування Pt-електрода використовували розчин хiнгiдpону в буфеpi з рН=4-6 (гИ=24/18°С). Час стабшзаци потенцiалу тривав близько 50 хв. Шсля кожного вимipювання очищали електрод в концентрованш H2SO4 за температури ~100°С. Для вираховування експоненти Кларка (rH) використовували формулу: rH= Eh/30 + 2 pH [4, 11], в якш Eh виражаеться у мЫвольтах (мВ).
Продукти ферментацп визначали як було описано рашше [3 - 7], за загальноприйнятими методами: ЛЖК - за допомогою парово! дистиляци в апаpатi Маркгама, ркт мiкpооpганiзмiв-симбiонтiв - туpбiдиметpично (А600). Обробку отриманих цифрових даних проводили статистично, використовуючи критерш "t" Стюдента.
Результати i обговорення. Результаты дослщжень наведеш на рис. 1 - 3. Фруктани рослинного ^нулш) i бактеpiального (леван) походження
84
вiдрiзняються мiж собою за хiмiчною структурою, зокрема, за специфiчнiстю фруктозилфруктозо ковалентних (3(2^-1)- та Р(2^6)-зв'язюв i величиною полiмерiв (рис. 1).
infjm HOIb£ О
Kff
ЯШ)
—о—гн: о
ФРУКТОЗА hl Oll:
I i" JI!f ., i p HO
н (.Ърн Щ| f-X
Dil I OH II
fi
<tliOH
-40 MOMOMEpis
CtyntHi гтотмериицГр'
KS «9А
H (höh
ОИ II
моем.
ПЕВАН
ншь£ f)
ÄH) t о н<
iOH
Рис.1. В1дм1нност1 х1м1чно1 структури фруктан1в рослинного (1нул1н) 1 бактер1ального (леван) походження.
1з даних рис. 2 i 3 видно ч^ю рiзницi за всiма характеристиками штенсивносп ферментацiйних процесiв, якi зумовлюються рiзними видами фруктанiв, а також присутшстю клiноптилолiту (природного сорбенту) у культуральному середовищi.
Рiвень зовнiшньоклiтинного окисно-вщновного потенцiалу (ЕЬ) за умов ферментацп iнулiну (рис. 2) змiнюeться в межах -160 до -220 мВ, рН -в межах 7,0-5,0, експонента Кларка (гН) - 7,0-8,6, крива, що вщображае динамшу змш рiвня утворення ЛЖК виходить на плато на 3й годиш шкубацп, а експоненцiйна фаза (log-фaзa) продовжуе зростати на 4й годинi. Наведен характеристики iнтенсивностi ферментацп пiдсилюються присутшстю сорбенту в середовищь
85
Eh
мВ pH
- 250 #
7,5 -
-200 - 7 ■
-150 6,5 -
6
-100 ■ 5,5 -
5 ■
-50 - J.5 -
IHY.iíh
гН
'Л—Л—Д.
.пжк
мМ
цбОО
—i—i i i i i
3 4 5 6 7 8
ГАД
6 +■
70 14
SO ■ 12 ■ 1 -
50 - 0J8 -
40 0£
30 ■ 04 0.2 '
- го - 0 ■
"Eh: —ü-Eh + CopS
■pH —Э-рН + Сорб
■ ги —0-гн+соре
-лжк
>АЮ0
—t -JDRK+ Copó —□ - AGQO+CopS
Рис. 2. Динaмiкa змш редокс-потенцiaлу Ta iнших покaзникiв ферментацн ¡нулшу змшшною мжробною популящею рубця.
Леепн
Eh мВ Рн
-250 п В - 7.5 -
-200 ■ 7
-150 - S,5 S
-100 - 5,5 5
-50 - 4,5 -
гН
лжк
м1\1
^еоо
10 - 70 ■ 1-4 -,
&.5 - $0. 1.2 ■
9 ■ 1
8.5 - 50 . 0.3 -
г -
7.5 - 40 ■ 0.G -
7 30 - 0.4 ■
6,5 - 0,2.
S ■ 20 . ■ ° J
-Eh
■ pH
■ гН
год
■—А " Eh+Cop5 —О - pH + Cops ♦ - гН + Copó
-лжк —е-лжк+copñ -woo —(j-ßeoo + cops
Рис. 3. Динaмiкa змш редокс-потенцiaлу Ta iнших покaзникiв ферментaцiï левaну змiшaною мiкробною популяцieю рубця.
86
nopÍB^HO суттеве зниження вищевказаних характеристик швидкост й обсяпв зброджування спостерiгаються у левану, фруктану бактерiального походження (рис. 3). Тут вiдмiчаються значно вужчi межi змш редокс-потенцiалу (вiд -155 до -190 мВ), рН (7,0-5,8), гИ (8,0-8,6), крива, що вiддзеркалюе змши рiвня ЛЖК, виходить на плато Í3 значним запiзненням (на 4-5й годинах шкубацп), а темпи росту мiкроорганiзмiв-симбiонтiв знижуються, загалом на 2-3 години. Введення сорбенту в культуральне середовище також i на цьому субстратi позитивно впливае на ферментацшш процеси.
Наведенi цифровi результати дослщжуваних показникiв ферментаци узгоджуються iз даними лiтератури [3 - 7]. Але, слщ зазначити, недостатне висв^лення питання, яким же чином Eh i гИ проявляють свою дш на процеси ферментаци основних груп оргашчних сполук рослинного й бактерiального походження. Як випливае iз змш динамiки окисно-вщновно! рiвноваги за умов in vivo та in vitro, вона може проявляти певну дш вщносно видового складу i метаболiчноl активностi екосистеми мiкроорганiзмiв-симбiонтiв рубця. Важливу роль при цьому ввдграе видовий склад мшробно! популяци ШКТ [4 -7] та переважаючо! кшькост окремих видiв i штамiв мiкробiв [4, 7], на чому й, очевидно, базуються сучаснi розробки вщповщних пробiотичних препаратiв [10].
Висновки.
1. Крив^ що вiдображають динамiку змш вщ'емних значень зовнiшньо клiтинного редокс-потенщалу (Eh) та показникiв ферментаци низькомолекулярного фруктану рослинного походження iнулiну (вуглеводу, в якого мономери з'еднаш у положенш р(2—>1)) знаходяться на вiрогiдно вищих рiвнях утилiзацil порiвняно з такими ж кривими iнтенсивностi зброджування високомолекулярного бактерiального фруктану (левану з Р(2—6)-зв'язками).
2. Анаеробне й редукуюче рубцеве мжробне середовище створюе значно ширший дiапазон вiд'емних значень Eh за умов утилiзацil iнулiну (-160
--220 мВ) порiвняно з використанням левану (-155 --195 мВ). Це
тдтверджуеться вщповщними погодинними дiапазонами вщхилень рiвнiв рН, гИ, ЛЖК та росту мкробно! бiомаси (А600), що знаходяться у лшшнш залежностi вщ Eh.
3. Введення у культуральне середовище адсорбенту клшоптилол^ пiдсилюе штенсившсть утилiзацil обох дослiджуваних фруктанiв.
4. Для прискореного збiльшення продукци енерги та необхiдних промiжних сполук у мкробнш екосистемi рубця доцiльно використовувати рослинш й бактерiальнi фруктани, з яких вiрогiдно вищою стартовою ефектившстю характеризуеться iнулiн.
Л1тература
1. Барладин А.О., Калачнюк Л.Г., Mík М.Я., Сухорська О.П., Баран М., Калачнюк Г.1. Кшетика утилiзацil фрукташв з Р(2—1)- i Р(2—6)-
87
зв'язками змшаною мкробною популящею рубця та вплив 1х на процеси амiакоутворення за ди сорбенту // Наук. вiсник ЛНУВМтаБТ iM. С.З. Гжицького, Львiв, 2007. Т.9, №3(34), Ч.1.-С.3-9.
2. Барладин А.О., Калачнюк Л.Г., Сухорська О.П., Савка О.Г.,М1к М.Я., Мароунек М., Калачнюк Г.1. Метаболiзм фруктану з в(2^1)-зв'язками мшробними популяцiями, сформованими на рiзних субстратах, за умов ди сорбенту та змiн рiвнiв рН // Наук. вiсник ЛНАВМ iм. С.З. Гжицького, Львiв, 2006. Т.8, №2(29), Ч.3. С.8-16.
3. Возна О.£. Екзогенна регуляцiя метаболiзму вуглеводiв мiкробною популяцiею рубця. Автореферат дис.канд.с.-г. наук за спещальшстю 03.00.04 - «бiохiмiя». - 1н-т бюлогн УААН, Львiв - 2002. - 16 с.
4. Калачнюк Г.1., Мароунек М., Калачнюк Л.Г., Савка О.Г. Метаболiзм бактерш рубця за ди зовшшньокл^инного редокс-потенцiалу // Укр. б^м. журн. 1994. - Т.66, № 1. - С.30-41.
5. Калачнюк Г.1., Мароунек М., Калачнюк Л.Г. та т. Метаболiзм глютамiну мшрооргашзмами рубця: вплив монензину // Укр. бiохiм. журн. 1992. - Т.64, №4. - С.72-78.
6. Мж М.Я., Калачнюк Л.Г., Барладин А.О., Сухорська О.П., Баран М., Калачнюк Г.1. Швидюсть метаболiзму рiзних фрукташв окремими фракцiями мiкроорганiзмiв рубця та змши рiвня амiаку у культуральному середовищi з клiноптилолiтом // Наук. вшник ЛНУВМтаБТ iм. С.З. Гжицького, Львiв, 2007. Т.9, №3(34), Ч.3.-С.85-91.
7. Руснак Н.1. Внутршньокл^инний метаболiзм мiкробних популяцiй травного тракту тварин за ди екзогенних факторiв. Автореф. дис. канд.бюл. наук за спещальшстю 03.00.04 - «бiохiмiя». - 1н-т бюлогп УААН, Львiв - 2008. - 20 с.
8. Baran M., Kravtsiv R., Kalachnyuk G., Bomba A., Zitnan R. Optimisation of ruminant digestion by influencing the ruminal fermentation // Slov. Vet. J. 2008. XXXIII, №2. P.117-118.
9. Keith J., Willey B., Ball D. et al. Continuous culture system for production of biopolymer levan using Erwinia herbicola// Biotechnol. Bioeng. 1991. Vol.38. - P.557-560.
10. Kmet' V.,. Baran M., Kalachnyuk G.I. Rumen ecosystem manipulation of calves and lambs by microbial preparation / Ed. K. Bod'a. Bratislava: Veda, 1990. 112 p.
11. Marounek M., Bartos S., Kalachnyuk G.I. Dynamics of the redox-potential, and rH in the rumen fluid of goats // Physiol. Bohemoslov. 1982. Vol. 31, №4. - P.369-374.
12. Pontis H.G., del Campillo E. Fructans. In: Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants. Ed. by Dey P.M. and Dixon R.A. 1985, Academic Press, London. - P.205-227.
Summary
M.Mik-Sabat, L. Kalachnyuk, Sukhors'ka, Yu. Klyuchkovs'ka, M. Baran*,
G. Kalachnyuk
88
Biotechnology Research Institute of Animal Production S.Z. Gzhytskyi L'viv National University of Veterinary Medicine and Bio-Technologies,
Pekarska st. 50, L'viv 79010, Ukraine; e-mail: lilimarg@polynet.lviv.ua * Institute of Animal Physiology, Slovak Academy of Sciences, Kosice, Slovak
Republic
DYNAMICS OF EXTRACELLULAR REDOX-POTENTIAL (Eh) ALTERATIONS AND INDICATORS OF PLANT AND BACTERIAL
ORIGINE FRUCTANS FERMENTATION BY THE MICROBIAL ECOSYSTEM OF RUMEN
A range of deviations of negative values of Eh in the microbial ecosystem of rumen is wider under inulin fermentation than under levan fermentation (-160 - -220 mVagainst -155 - -195 mV). The deviations are in corresponding linear dependence of alterations of pH, rH, total VFA and growth of biomass of microorganisms (A600). Addition of natural sorbent clinoptylolite into cultural medium essentially rises intensity of utilization of inulin and levan.
In a purpose of faster increase of energy production, of necessary intermediates and of biosynthesis processes in the microbial ecosystem of rumen, plant and bacterial fructans with additive of natural sorbent are good for use. Bio-effect of use low molecular polymer inulin with /3(2^1)-linked fructofuranose residues is higher than high molecular polymer levan with /3(2^6)-linked fructofuranose residues.
Key words: redox-potential (Eh), rH, pH, VFA, growth of microbial biomass, inulin, levan, fructans, the microbial metabolism of rumen, clinoptylolite.
Cmammx nadiuMna do peda^i'i 3.04.2008
89
