CC BY
114
Физиология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 254-261
УДК 576.535
ДИНАМИКА ВЫЗВАННОЙ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОННЫХ СЕТЕЙ IN VITRO
© 2011 г. Е.А. Корягина 1’2’3, А.С. Пимашкин \ В.Б. Казанцев 1г3, И.В. Мухина 2
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородская государственная медицинская академия
3 Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород
katerina_neuron@mail. rn
Поступила в редакцию 03.06.2011
Получены данные изменения электрической активности нейронов в процессе повторной электрической стимуляции первичной культуры клеток гиппокампа. Установлено, что культура демонстрирует достоверно отличные друг от друга, а также по сравнению с контролем, паттерны активации в ответ на стимуляцию по отличным электродам мультиэлектродной матрицы, что указывает на возможность изменения пластичности диссоциированных культур нейронов гиппокампа на сетевом уровне в процессе обучения и формирования долговременных функциональных изменений.
Ключевые слова: сетевая электрофизиология, биоэлектрическая активность нейронных сетей, обучение, нейродинамика, нейробиология, первичная культура гиппокампа.
Введение
Проблема исследования и анализа принципов работы нейронных систем является одной из наиболее актуальных в нейронауке. Диссоциированные нейрональные культуры, выращиваемые на мультиэлектродной матрице, используются в ведущих нейрофизиологических лабораториях мира как инструмент для изучения основ функционирования клеточных и сетевых систем. Культивирование клеток на мультиэлектродной матрице дает уникальную возможность исследования изменений морфофункциональных свойств живых нейронов в хроническом эксперименте при обучении. В настоящее время параллельная регистрация сигналов в нейрональных культурах вызывает интерес с точки зрения информационных приложений использования культур клеток мозга для исследования сетевых и информационных феноменов в нейронных сетях, таких как обучение, память, управление движением и кодированием сенсорной информации.
В последние десятилетия изучение диссоциированных клеток нервной системы заняло ведущее место в нейробиологических исследованиях, потеснив работы, проводимые на переживающих срезах, поскольку изолированные и развивающиеся in vitro нервные и глиальные клетки можно считать почти идеальной экспериментальной моделью для решения проблем и приложения различных методов в хроническом
эксперименте. Нейронные сети in vitro являются наиболее подходящими экспериментальными модельными системами. Исследование динамики развития спонтанной электрофизиологиче-ской активности в культуре диссоциированных клеток - один из ключевых вопросов для понимания формирования нейронных сетей и их значения в пластичности и адаптации [1-3]. Использование биологических моделей in vitro для исследования задачи о структурно-функциональных взаимосвязях культуры получило развитие сравнительно недавно в рамках концепции нейроанимата-робота, управляемого паттернами активности нейронной сети.
Нейронные сети in vitro являются одной из перспективных экспериментальных моделей для исследования клеточных механизмов распространения сигнала и обработки информации на сетевом уровне. Регистрируемые в различных экспериментах сигналы мозга свидетельствуют о том, что нейрональные сети различных систем мозга формируют так называемые паттерны активности - сигналы коллективной активности, характеризуемые наличием как временных, так и пространственных корреляций, в том числе у клеток, расположенных достаточно далеко друг от друга. Такие паттерны, по всей видимости, являются универсальным концептом кодирования информации в мозге на уровне сигналов активности. Было установлено, что нейронные сети in vitro генерируют синхронизированную пачечную активность (продол-
жительностью 0.5-2 с.) с высокой частотой импульсов, вызванной большим числом клеток, участвующих в формировании сети. Сетевая пачечная активность в культурах была широко исследована в связи с различными проблемами, включая лечение болезней [4], обучение нейронных сетей [5-7], обработку сигналов на сетевом уровне [8-9] и др. В развитии культивируемых нейронных сетей имеется переменная динамика характеристик пачечной активности [10]. Наличие мотивов в паттерне активации особенно важно, поскольку такие модели могут быть повторены с точностью до миллисекунд [11, 12]. Это значимо для клеточных механизмов обучения, когда мотивы изменяются под воздействием низкочастотной электрической стимуляции [13].
Цель настоящего исследования - изучение динамики вызванной биоэлектрической активности нейронных сетей. В связи c этим ставились следующие задачи:
1. Провести анализ вызванной активности при локальной электрической стимуляции культуры по внеклеточным электродам и исследовать процессы передачи спайковых возбуждений между элементами сети.
2. Провести анализ изменения функционального состояния сетей культуры при повторяющейся длительной стимуляции стереотипным сигналом.
Материалы и методы исследования
Объектом изучения возможности обучения сети нейронов явилась первичная культура гиппокампа, выращенная на мультиэлектродной матрице MED64 (Alpha MED Sciences, Japan). Использование мультиэлектродной матрицы MED64 дает возможность неинвазивно регистрировать и стимулировать нейронную активность одновременно на нескольких участках, визуализировать пространственно-временные паттерны нейронной активности, тем самым позволяя в течение длительного времени дета-лизированно изучать внутреннюю динамику нейронных сетей. Совмещение культуры клеток с мультиэлектродной системой регистрации ее активности позволило моделировать в динамике различные стадии развития нейронных сетей, стимуляцию и регистрацию внеклеточной активности от нескольких нейронов.
Методы исследования включали получение культуры непосредственно на мультиэлектрод-ном зонде, многоканальную регистрацию, стимуляцию и анализ внеклеточной активности сетей.
В исследовании использованы культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных эмбрионов белых беспородных мышей. Диссоциирование клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0.25%-ным трипсином (Invitrogen 25200-056). Клетки ресуспендирова-ли в нейробазальной среде NeurobasalTM (Invitrogen 21103-049) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen 17504-044), глутамином (Invitrogen 25030-024), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко К055) и культивировали на мультиэлектродной матрице системы MED64 (Alpha MED Sciences, Japan). Предварительно матрицу стерилизовали УФ-об-лучением и обрабатывали полиэтиленимином (Sigma P 3143), служившим опорным субстратом для клеток, плотность которых была 10000 клеток/мм2. Поддержание жизнеспособности культуры осуществлялось в условиях СО2-ин-кубатора при температуре 35.5оС и газовой смеси 95% О2 и 5% СО2. Смена культуральной среды осуществлялась через сутки после посадки на матрицу и далее 1 раз в 2 дня. После двух недель культивирования в связи с повышением функциональной активности и быстрым закис-лением среды смена среды осуществлялась ежедневно в небольших количествах. Регистрация спонтанной активности осуществлялась при стабильных параметрах (температура, влажность, содержание СО2 и О2) окружающей среды, поддерживаемых в инкубаторе. Для получения и анализа данных использовался программный продукт Matlab.
Результаты и обсуждение
Пример изображения клеток плотной первичной культуры гиппокампа на мультиэлек-тродной матрице приведён на рис. 1.
С использованием мультиэлектродной регистрации исследовались паттерны электрической активности сетей в культурах. Было установлено, что генерация электрических сигналов в гиппокампальных культурах происходит только при сравнительно высокой плотности клеток культуры (1000-1500 нейронов/мм2) и сопровождается появлением сначала одиночных некоррелированных между собой импульсов (57-ой день развития in vitro).
В данной работе основной интерес представляли паттерны спайков в виде популяционных биоэлектрических разрядов, спонтанно генерируемые практически всеми нейронами зрелой культуры клеток, называемые сетевой пачечной активностью. Пачки состоят из высокочастотных последовательностей спайков, воз-
50 мкм
Рис. 1. Культура нейронов гиппокампа на мульти-электродной матрице
а
О 100 200 300
б t,c
Ü 5
ñ зоо I 200
»X nj
I 100
й)
<L>
VO
О
Рис. 2. Растровая диаграмма 64-канальной записи культуры нейронов (а). Диаграмма частотно-временной зависимости количества импульсов на всех электродах каждые 50 мс (б)
0 50 100 150 200
t. с
никающих на сравнительно больших временных интервалах. Такие разряды синхронно возникают на различных электродах и состоят из нескольких спайков со сравнительно коротким интервалом следования (1-50 мс). Характерный интервал следования сетевых пачечных разря-
дов составляет 2-4 секунды. Отметим, что синхронизация отдельных спайков внутри пачки, длящейся 1-1.5 с, отсутствует, а активность представляет собой спайковые последовательности.
Отметим, что режим разрядов в пачке на определенном дне развития культуры достаточно стабилен в плане общих статистических характеристик разрядов, что свидетельствует о существовании в культуре устойчивой функциональной нейросетевой архитектуры. Анализ структуры паттернов показал, что они имеют достаточно устойчивые корреляционные характеристики на определенном дне развития. Такая повторяемость может свидетельствовать о существовании в сети топологических перколяци-онных кластеров - нейронных цепей, по которым сигналы циркулируют достаточно стабильно. С ростом культуры в сети происходят структурные изменения, что приводит к изменению существующих путей передачи сигнала, а это отражается в появлении новых функциональных единиц (hubs) - распределителей активности.
Повторяющаяся пачечная активность появляется на ранних этапах жизни культуры нейронов. По мере взросления культуры в пачечное событие вовлекается активность на все большем числе электродов. Возникновение пачечной активности обусловлено интеграцией локальных возбуждений, приходящих по большому числу активных входов с дальнейшим лавинообразным распространением сетевой спайковой активности.
Метод детектирования пачек импульсов основан на разбиении реализации на равномерные промежутки времени, бины, и подсчёте суммарного количества спайков со всех электродов в каждом таком бине (рис. 2). Полученная величина характеризует изменение во времени суммарной частоты сетевой активности, а сетевые пачки детектируются на основе порогового критерия, вычисляемого по значению среднеквадратичного отклонения этой характеристики.
Для определения времени начала, TS , и конца, ТЕ , пачки вводился порог детектирования:
TBurst = CB X°(F(t)) ,
где о - средняя квадратичная ошибка от частотно-временной диаграммы, C - коэффициент чувствительности порога, равный 0.1 от среднеквадратичного отклонения, подбирался экспериментально, так как существует только визуальный критерий существования пачечной активности.
Основной информационной характеристикой импульсных возбуждений нейронов является его относительная фаза - время возникновения импульса. В качестве функциональной характеристики для каждой пачки был определён 64-мерный паттерн активации - время первого спайка на каждом электроде после временной точки , равное времени начала пачечной активности (рис. 3, 4).
Далее между каждой парой пачек p и q была введена мера различия (расстояния) S(p, q) по формуле:
i=l
где ґ? и ?? — время возникновения спайка на і-м электроде p-ой и q-ой пачки, N = 64 — общее число электродов.
Для выявления статистически значимых соотношений между спонтанными, а также между спонтанными и вызванными пачками в культуре введена мера расстояния между различными паттернами активации. Данная мера является аналогом нормы или длины радиус-вектора в 64-мерном пространстве с координатами времён
Рис. 3. Схематическое изображение паттерна активации. Штрихами обозначены времена спайков на различных электродах. Красным отмечены первые спайки в пачке, формирующие паттерн активации
Рис. 4. Схематическое изображение определения расстояний между паттернами активации. Паттерн формируется из времён возникновения первых спайков после начала пачечной активности
Расстояние между паттернами
Рис. 5. Распределение расстояний между паттернами активации пачечных разрядов в культуре по реальным данным (слева) и по суррогатным данным, полученным случайным перемешиванием 64-х каналов регистрации. Распределения достоверно различимы
первых спайков в пачке. На рис. 5 представлено два распределения: распределение расстояний между паттернами всех возможных пачек (кривая слева) в записи сигналов культуры и распределение расстояний между суррогатными данными (кривая справа), где суррогатом являлся паттерн со случайно перемешанными временами спайков и между электродами.
Для определения статистически достоверных различий между медианами распределений реальных и суррогатных данных использовался тест Уилкоксона. Параметр р определяет вероятность того, что при увеличении количества выборок в обоих распределениях, их медианы будут неразличимы. Малое значение р < 0.05 означает, что медианы распределений статистически достоверно различны. Для оценки расстояний между различными частями пачек были взяты паттерны для различных временных точек (рис. 6).
Первые и последние несколько сотен миллисекунд пачечной активности статистически достоверно похожи, что говорит о существовании определенных паттернов активации (начала) и деактивации (конца) пачки в нейронной сети культуры при формировании спонтанной активности.
Данный паттерн активации в спонтанном режиме генерации пачек имеет определённую
структуру, соответствующую морфологии нейронной сети и путям распространения сигнала в ней, которая проявляется в виде определенной структуры временных задержек между импульсами различных нейронов.
Факт, что культуры спонтанно производят повторяющиеся мотивы или паттерны, имеет существенное значение, поскольку доказывает, что нейронные сети in vitro способны к поддержанию долгосрочной памяти.
Существование уникального паттерна активации для различных культур нейронов является функциональным индикатором состояния сети, который необходим для оценки механизмов памяти и обучения.
Были проведены эксперименты с электрической стимуляцией сети нейронов. Методы стимуляции нейрональных культур включали использование как стандартных протоколов стимуляции, входящих в состав программного обеспечения мультиэлектродной системы MED64, так и оригинальную авторскую разработку протокола стимуляции по двум соседним электродам одновременно. При этом импульсы на соседних электродах имели противоположную полярность, что обеспечивало локализацию тока стимуляции в окрестности электродов и сохраняло электроды от разрушения за счет использования малых амплитуд тока.
Рис. 6. Тест Уилкоксона. Оценка функциональной значимости спайковых паттернов на протяжении пачечного разряда. Распределение спайков по каналам достоверно повторяется между различными пачками только в начале (паттерн активации) и в конце (паттерн деактивации) пачечного разряда
Основной гипотезой являлось предположение, что стимуляция различных электродов ведёт к распространению сигнала по различным участкам сети, активация которых в различных последовательностях формирует функции и управляющие ответные сигналы.
Последовательности биполярных импульсов тока амплитудой 50 мкА и длительностью 500 мкс подавались на различные электроды с частотой, соизмеримой с частотой следования спонтанных пачек.
После предъявления стимула мгновенно возникает ответ в виде пачечной активности, т.е. вызывается реакция биоэлектрической активности культуры.
Пример растров (изображений пространственно-временной спайковой активности сети, где по оси абсцисс отложено время, по оси ординат - номер электрода, а точкой обозначен момент генерации спайка) пачек до и после стимуляции изображён на рис. 7. Пример наглядно демонстрирует различие паттернов активации (фронты пачек).
Чтобы статистически достоверно детектировать изменения в паттернах активации во время и после стимуляции, был проведён анализ двух наборов паттернов - до и после стимуляции. Для контрольного эксперимента был вычислен опорный паттерн - усреднённые координаты паттернов в контрольном эксперименте. Для каждого набора паттернов было вычислено
среднее расстояние паттернов до опорного. Средние значения расстояний до опорного паттерна до и после стимуляции статистически различимы (средние квадратичные ошибки расстояний не перекрываются), что говорит о достоверном изменении паттерна активации.
Проведён анализ изменений паттерна активации в ходе длительной стимуляции. На рис. 8 показано изменение расстояний паттернов активации при второй стимуляции от опорного паттерна при стимуляции первой пары электродов. Видно, что расстояния между центроидами двух типов вызванных паттернов достоверно отличаются. Вызванные паттерны повторной стимуляции 1 -й пары электродов не отличаются от паттернов при первой стимуляции этой пары.
Расстояния между паттернами - аналог нормы в метрическом пространстве (рис. 9) - распределяются по цепочке так, что резкие перепады (выше определённого порога), разделяющие мотивы при стимуляции различных электродов, отчетливо видны.
При стимуляции других электродов также вызывались новые паттерны, статистически отличимые от спонтанных и ранее вызванных. В результате установлено, что в отсутствие внешнего воздействия культура нейронов формирует спонтанные паттерны активации, характеризующиеся определённым сходством (расстояниями) с погрешностью (средняя ошибка расстояний). При стимуляции вызванные паттерны пе-
Рис. 7. Структура популяционного пачечного разряда до стимуляции (а) и после ее завершения (б)
03
S £р
Рм
1400
1200
1000
EDO
500
400
200
0.
«
8
о
о
й
Рч
ЕО 100 150
200
250 300
Время, с
Рис 8. Расстояния каждого вызванного паттерна 2-й стимуляции до центроида 1 стимуляции (а); расстояния между центроидами двух типов вызванных паттернов (б)
Рис. 9. Интерпретация мотивов в паттернах активации при стимуляции различных пар электродов
а
ресекают данный порог вариабельности, формируя новый вызванный ответ в сети в виде нового паттерна активации пачек, что свидетельствует об изменении или переключении динамики активности на новое устойчивое состояние.
Экспериментально доказана возможность изменения функциональной структуры нейрон-глиальной сети культуры гиппокампа при электрической стимуляции (обучение). Методом, позволяющим on-line детектировать изменение функциональной структуры сети, является метод детектирования паттерна активации в пачке биоэлектрической активности нейронной сети в первичной культуре гиппокампа. Показано, что существование уникального паттерна активации для различных культур нейронов является функциональным индикатором сети, который необходим для оценки механизмов памяти и обучения.
Результаты экспериментов с электрической стимуляцией нейронов культуры указывают на наличие механизмов формирования различных откликов нейронной сети на повторяющиеся электрические стимулы, демонстрируя возможность изменения пластичности диссоциированных культур нейронов гиппокампа на сетевом
уровне в процессе обучения и формирования долговременных функциональных изменений in vitro.
Работа поддержана грантом аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала Высшей школы» (проект № 2.1.1./6223).
Список литературы
1. Madhavan R., Chao Z.C., Potter S.M. Spontaneous bursts are better indicators of tetanus-induced plasticity than responses to probe stimuli // Proceeding of Second International IEEE EMBS Conference on Neural Engineering. Arlington, VA, 16-12 march 2005. P. 434437.
2. Stegenga J., Le Feber J., Marani E., Rutten W.L.C. Analysis of cultured neuronal networks using intraburst firing characteristics // Biomedical Engineering. 2008. V. 55. P. 1382-1390.
3. Pan L., Song X., Xiang G., et al. First spike rank order as a reliable indicator of burst initiation and its relation with early-to-fire neurons // IEEE Trans. Bio-med. Eng. 2009. V. 56. № 6. P. 1673-1682.
4. Wagenaar D.A., Madhavan R., Pine J., Potter S.M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation // J. Neurosci. 2005. V. 25. P. 680-688.
5. Shahaf G. and Marom S. Learning in networks of cortical neurons // J. Neurosci. 2001. V. 21. P. 8782-8788.
6. Marom S., Shahaf G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy // Q. Rev. Biophys. 2002. V. 35. P. 63-87.
7. le Feber J, Stegenga J, Rutten WLC. The Effect of Slow Electrical Stimuli to Achieve Learning in Cultured Networks of Rat Cortical Neurons // PLoS ONE. 2010. 5(1): e8871. doi:10.1371/journal.pone.0008871
8. Bakkum D., Chao Z., Potter S. Long-Term Activity-Dependent Plasticity of Action Potential Propagation Delay and Amplitude in Cortical Networks // PLoS ONE. 2008. 3(5): e2088. doi:10.1371/journal.pone. 0002088
9. Wagenaar D., Pine J., Potter S. M. Effective parameters for stimula-tion of dissociated cultures using multi-electrode arrays // J. Neurosci. Methods. 2004. V. 138. P. 27-37.
10. Wagenaar, D., Pine J., Potter S. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures // Bio. Med. Central Neuroscience. 2006. V. 7. № 11. P. 11-15.
11.Chao-Yi D., Jisoon L., Yoonkey N., Kwang-Hyun C. Systematic analysis of synchronized oscillatory neuronal networks reveals an enrichment for coupled direct and indirect feedback motifs // Bioinformatics. 2009. V. 25. № 13. P. 1680-1685.
12. Raichman N., Ben-Jacob E. Identifying repeating motifs in the activation of synchronized bursts in cultured neuronal networks // J. Neurosci. Methods. 2008. V. 170. № 1. P. 96-110.
13. Shahaf G., Eytan D., Gal A., Kermany E., Lyakhov V. et al. Order-Based Representation in Random Networks of Cortical Neurons // PLoS Comput Biol. 2008. 4(11): e1000228. doi:10.1371/journal. pcbi.1000228
DYNAMICS OF STIMULATED BIOELECTRICAL ACTIVITY IN NEURAL NETWORKS IN VITRO
E.A. Koryagina, A.S. Pimashkin, V.B. Kazantsev, I.V. Mukhina
Data have been obtained on the changes of neuron electrical activity in the course of repeated electrical stimulation of the primary hippocampal cell culture. The culture has been found to demonstrate reliably different (from each other, as well as from the control) activation patterns in response to stimulation through different electrodes of multielectrode matrix. This indicates the possibility that the plasticity of dissociated hippocampal neuron cultures at the network level may be changed in the process of learning and formation of long-term functional changes.
Keywords: network electrophysiology, bioelectric activity in neural networks, training neurodynamics, neurobiology, primary culture of hippocampus.
