CC BY
15
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.64:631.46
ДИНАМИКА ВЫЖИВАНИЯ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ И САПРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ПРОХОЖДЕНИИ ЧЕРЕЗ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЙ ТРАКТ ПТИЦ, В ИХ ЭКСКРЕМЕНТАХ И В ВОДЕ
А.А. Куприянов, А.М. Семенов, А.Х.К. Ван Бругген*, А.И. Нетрусов, Е.В. Семенова
(кафедра микробиологии; e-mail: aakupriyanov@mail.ru)
Выявлена способность сапротрофной Pseudomonas fluorescens 32 gfp и двух энтеропа-тогенных Salmonella enterica var. Typhimurium МАЕ 110 gfp и Escherichia coli O157:H7 gfp бактерий к прохождению через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) птиц (домашних кур), динамика выживания этих бактерий в экскрементах кур и при перемещении в воду. Курам скармливали комбикорм, инокулированный упомянутыми бактериями, в количестве 107 кл/г сух. комбикорма. В экскрементах кур учитывали количество выживших бактерий и иноку-лировали этими экскрементами нестерильную и стерильную прудовую воду. В воде в динамике учитывали меченые бактерии. Выявлена хорошая выживаемость всех исследуемых бактерий во всех испытанных субстратах. Это указывает на возможность перемещения бактерий, в том числе опасных для человека, в природе через ряд субстратов и ниш в виде цикла и инфицирования этих ниш и субстратов, в том числе используемых человеком в пищу.
Ключевые слова: энтеробактерии, популяционная динамика, выживание, птицы, экскременты, вода.
Перемещение микроорганизмов между разными наземными нишами в основном имеет случайный, ненаправленный характер и происходит в виде диссипации, что и отражено в первой части известного выражения Бейеринка "все есть везде". Диссипативное распространение как живых микроорганизмов, так и их покоящихся форм происходит главным образом с воздушными и водными потоками, а также на кожных покровах различных животных (Sojka, Entry, 2000; Ушакова, 2006). Помимо такого ненаправленного распространения микроорганизмов, несомненно, имеет место и закономерное, направленное перемещение, которое происходит вдоль пищевой цепи. Все субстраты, в том числе пищевые, если они специально не подвергались стерилизации, в большей или меньшей степени, но обсеменены микроорганизмами. При поедании пищи живыми объектами имеет место пассивное хищничество в отношении микроорганизмов. Попадая в пищеварительные тракты животных, одни микроорганизмы погибают, другие же способны выживать и даже увеличивать свою численность (Третьякова и др., 1996; Бызов, 2003). С экскрементами микроорганизмы опять попадают в окружающую среду, контаминируя почву, воду
и растительный мир. Таким образом, имеет место очевидный круговорот микроорганизмов, или цикл, однако его закономерности и количественные характеристики далеко не ясны. Познание закономерностей поведения сапротрофных, а особенно патогенных для человека и животных, микроорганизмов при перемещении по такому циклу, несомненно, важно как с теоретической, так и с практической стороны (Семенов, 2005; Van Brüggen et al., 2008).
Наиболее мобильными векторами в таком цикле являются птицы. С одной стороны, они часто питаются вблизи различных животных, нередко питаясь даже их экскрементами, а затем во время миграции перемещаются не только над сушей, но и над водными объектами. При этом как суша, так и вода могут контаминироваться различными, в том числе и патогенными бактериями, что впоследствии может привести к инфицированию людей (Waldenstrom et al., 2003). Известно, что водоемы нередко становятся резервуаром энтеропатогенов (Martinez-Urtaza et al., 2004). Серьезную опасность для человека при попадании в желудочно-кишечный тракт представляют штаммы таких бактерий, как Escherichia coli 0157:Н7, Salmonella enterica и Salmonella enteritidis, Campilobacter jejuni, Listeria
* Группа органического земледелия университета Вагенингена, Нидерланды.
7 ВМУ, биология, № 3
monocytogenes и др. Важнейшим резервуаром энте-ропатогенов является крупный рогатый скот. Однако патогенные штаммы Е. coli, в частности Е. coli 0157:Н7, были выделены из домашних и диких животных: овец, свиней, кошек, собак, оленей, ослов, диких кроликов, крыс и птиц (Asakura et al., 1998; Bailey et al., 2002; Van Bruggen et al., 2008).
Целью настоящих исследований было изучение выживания бактерий, сапротрофных и аналогов энтеропатогенных, при прохождении через пищеварительный тракт птиц, в нашем случае домашних кур, с дальнейшим прослеживанием динамики выживания этих бактерий в экскрементах кур и при инокулировании воды их экскрементами.
Материалы и методы
Микроорганизмы и среды для их выявления и выращивания. Объектами исследований были генетически маркированные бактерии, способные синтезировать зеленый флуоресцирующий белок (GFP). Использовали антибиотикоустойчивые и авирулент-ные (гены вирулентности удалены) штаммы бактерий.
S. Typhimurium МАЕ ПО gfp выявляли на среде, содержащей, г/л: дрожжевой экстракт — 5, бак-топептон — 10, агар — 17. Вода дистиллированная 1 л, рН среды 7,21—7,4. Среду стерилизовали при повышенном давлении в 0,5 атм в течение 30 мин с антибиотиком налидиксовая кислота 50 мг/л. После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик канамицин 50 мг/л. Е. coli О157:Н7 gfp выявляли на среде, содержащей, г/л: дрожжевой экстракт — 5, бактопептон — 10, NaCl — 10, агар — 17. Вода дистиллированная 1 л. рН среды 7,2—7,4. Среду стерилизовали при повышенном давлении в 0,5 атм в течение 30 мин. После авто-клавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик ампициллин 50 мг/л. P. fluorescens 32 gfp выявляли на среде, содержащей, г/л: бактопептон — 2; К2НРО4 — 1,4; MgSO4S7H2O — 1,5; глицерин — 15 мл/л; агар — 17. Вода дистиллированная 1 л. pH среды 7,0—7,2. Среду стерилизовали при повышенном давлении в 0,5 атм в течение 30 мин. После автоклавирования вносили стерилизованные фильтрацией антибиотики канамицин и рифампицин по 50 мг/л.
Биомассу бактерий для инокулирования комбикорма выращивали в тех же средах (жидкая форма) до достижения начальной стадии стационарной фазы роста (~ 24 ч для S. Typhimurium МАЕ 110 gfp и 15 ч для Е. coli О157:Н7 gfp и P. fluorescens 32 gfp). Температура выращивания бактерий составляла 37° для S. Typhimurium МАЕ 110 gfp и Е. coli O157:H7 gfp и 25° для P. fluorescens 32 gfp.
Животные. Использовали кур-несушек породы "Московская" в возрасте 1 год.
Вода. Использовали природную воду, отобранную из пруда вблизи пос. Николина Гора Одинцовского р-на Московской обл. Использовали нестерильную и стерильную воду. Стерилизацию проводили автоклавированием при повышенном давлении в 0,5 атм в течение 30 мин.
Скармливание инокулированного бактериями корма курам. Использовали "запаренный" (смесь 1 кг комбикорма с 500 г горячей воды) и охлажденный комбикорм. Состав комбикорма: ячмень, отруби, пшеница, шрот рапсовый, жмых подсолнечнико-вый с добавлением поваренной соли и микроэлементов. Комбикорм инокулировали мечеными бактериями до конечной концентрации 107 КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий и скармливали 5 курам. Сразу после скармливания кормушки убирались, а пол в помещении, где содержались куры, застилали чистой пленкой.
Определение динамики выживания бактерий в экскрементах кур. Сбор экскрементов проводили приблизительно через сутки после скармливания. В свежесобранных экскрементах сразу учитывали исследуемые бактерии и после этого подвергали их инкубации в течение 8 сут, в динамике определяя выживание бактерий. Навески экскрементов делили на три равные части в количестве 50 г и вносили в пластиковые емкости объемом 0,1 л. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте при постоянной температуре +18°. Влажность экскрементов после сбора составляла в среднем 42%, рН 6,3.
Учет бактерий в экскрементах кур осуществляли методом посева на селективные питательные среды с антибиотиками. В каждые три чашки вносили по 100 мкл суспензии. Чашки с энтеробак-териями инкубировали при 37°, а с псевдомонадами при 25°. Флуоресцирующие колонии выявляли и учитывали под темно-голубым светом лампы (a black-light lamp, 220V, 11 wt, PL-S, Philips, Eindhoven, N1). Количество колоний образующих единиц (КОЕ) пересчитывали на 1 г сухого вещества. Влажность образцов определяли путем их высушивания в течение нескольких часов при 105°.
Смешивание экскрементов с водой и прослеживание динамики меченых бактерий в воде. Момент смешивания экскрементов, содержащих тест-бактерии, с водой определяли экспериментально, после достижения квазистационарного состояния популя-ционной плотности интродуцента (выход на "плато"). Влажность экскрементов перед смешиванием с водой составляла в среднем 40%. Смешивание экскрементов с водой производили в соотношении 1 : 10, т.е. 10 г экскрементов смешивали с 90 г воды и инкубировали в темноте при температуре +18°.
Эксперименты были проведены в июне—июле 2007 г. в трех повторностях три раза.
Рис. 1. Схема эксперимента по изучению выживаемости исследуемых бактерий в разных эконишах и способности преодолевать барьеры, разделяющие эти ниши, с образованием почти завершенного экологического микробного цикла.
1 — культура, 2 — комбикорм, 3 — куры, 4 — вода
Результаты и обсуждение
Общий дизайн экспериментов представлен на рис. 1. После скармливания курам комбикорма, содержащего 107 кл. меченых бактерий/г сухого комбикорма, через сутки в экскрементах было обнаружено до 1,2 • 104 меченых клеток энтеробактерий и еще меньше сапротрофной P. fluorescens 32 gfp в гр. сух. вещ. Таким образом, среда ЖКТ птиц неблагоприятна для исследуемых бактерий, но и не смертельна. Сходная закономерность была выявлена при скармливании инокулированного мечеными бактериями комбикорма коровам и учете этих бактерий в их экскрементах (McGee et al., 2004).
При наблюдении динамики численности меченых бактерий в течение 8 дней в экскрементах выявлено значительное увеличение численности S. Ty-phimurium — почти на два порядка (рис. 2, А), несколько меньше для Е. coli О157:Н7 gfp (рис. 2, Б) и отсутствие прироста у P. fluorescens 32 gfp (рис. 2, В). И в этом случае имеет место некоторая аналогия с динамикой выживания этих бактерий в экскрементах крупного рогатого скота (ЭКРС) с той разницей, что в ЭКРС наиболее активно подрастала популяция P. fluorescens 32 gfp, а в экскрементах кур — S. Typhimurium. Полученные нами результаты находятся в соответствии с известными литературными данными о том, что куры являются активными "инкубаторами" и устойчивыми
Рис. 2. Динамика выживания S. var. Typhimurium МАЕ ПО gfp (A), E. coli О157:Н7 gfp (Б) и P. fluorescens 32 gfp и аборигенов (В) в экскрементах кур после скармливания им комбикорма, иноку-лированного бактериями и после инокулирования воды этими экскрементами; стрелкой показано время инокулирования воды.
1 — нестерильная вода, 2 — стерильная вода, 3 — нестерильная вода, аборигены, 4 — стерильная вода, аборигены
"носителями" сальмонелл и других энтеробактерий (Newell, Fearnley, 2003). Становятся вполне понятными причины частой контаминации яиц салмо-неллами, что может легко происходить при выходе яиц через клоаку кур, инфицированных сальмонеллами.
Наши результаты указывают на серьезную опасность распространения с экскрементами кур и штаммов Е. coli 0157:Н7. С учетом того что инфекционная доза шига-токсин продуцирующих (8ТЕС)/эн-терогемморагических (ЕНЕС) штаммов Е. coli 0157:Н7 крайне низка — менее 100 кл., выявленные в наших экспериментах численности Е. coli 0157:Н7 в экскрементах кур — до 3,6*104 представляются впечатляющими (Altwegg, Bockemuhl, 1998).
В ранее проведенных экспериментах нами было детально исследовано выживание всех трех бактерий в ЭКРС, смеси ЭКРС—почва, а также на разных растениях. Помимо почвы другим не менее важным источником контаминации и распространения микроорганизмов является вода. В этой связи была исследована динамика выживания указанных бактерий в природной нестерильной и про-стерилизованной воде (рис. 2, Л—В). Для этого через 8 дней наблюдения численности меченых бактерий в экскрементах кур их часть (10 г) была внесена в 90 мл воды и прослежена дальнейшая динамика численности бактерий. Динамика всех бактерий как в нестерильной, так и в стерильной воде была монотонно убывающей. При этом в стерильной воде снижение было несколько медленнее, чем в нестерильной, что может быть связано, с одной стороны, с многочисленными хищниками, которые, как правило, обильно развиваются в прудовых водах, а с другой — из-за сильного конкурентного давления со стороны аборигенных мик-
роорганизмов (рис. 2, В). В этой связи следует указать на еще одну опасность при распространении и выживании патогенов в природных средах, связанную с возможностью проявления феномена "незавершенного фагоцитоза". По Литвину с соавт. (1997), такое явление может происходить в случае чрезмерного фагоцитирования бактерий какими-то простейшими хищниками, но неспособными, однако, лизировать (переваривать) эти бактерии. Иногда в таких случаях бактерии начинают размножаться в клетке хищника и после гибели самого хищника увеличившееся количество патогенов оказывается вновь в окружающей среде.
Выводы
1. Бактерии, использованные в исследованиях, успешно выживают при прохождении через ЖКТ птиц, обнаруживаясь в экскрементах в численности, достаточной для инфицирования других субстратов.
2. Находясь уже в экскрементах, бактерии могут заметно увеличить свою популяционную численность в течение нескольких последующих дней.
3. После попадания экскрементов кур с мечеными бактериями в воду хотя и наблюдалось монотонное снижение их численности, однако их количество оставалось достаточно высоким, чтобы
инфицировать другие организмы или субстраты.
* * *
Исследования поддержаны NWO — RFBR (Dutch— Russia) collaborative grants (Dossier numbers 047.014.001 and 047.0147.011) for A.H.C.van Bruggen and A.M. Se-menov and NWO fellowship for A.M. Semenov Dos-siernr. 040.11.057.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Вызов Б.А. 2003. Зоомикробные взаимодействия в почве: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М.
Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушка-рева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В. 1997. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.
Семенов A.M. 2005. Трофическое группирование и динамика развития микробных сообществ в почве и ризосфере: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М.
Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Вызов Б.А., Звягинцев Д.Г. 1996. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными // Микробиология. 65. № 1. 102.
Ушакова Н.А. 2006. Изучение мутуалистиче-ских взаимодействий микроорганизмов и животных и использование микросимбионтов в биотехнологических целях: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М.
Altwegg M., Bockemuhl J. 1998. Escherichia and Shigella / Eds. A. Ballows, B.I. Duerden // Microbiology and microbial infections. Systematic Bacteriology. Vol. 2. London. P. 935-967.
Asakura H., Makino S., Shirahata T., Tsukamoto T., Kurazono H., Ikeda T., Takeshi K. 1998. Detection and genetical characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli from wild deer // Microbiol. Immunol. 42. P. 815—822.
Bailey J.R., Warner L., Pritchard G.C., Williamson S., Carson T., Willshaw G., Cheasty T. 2002. Wild rabbits — a novel vector for ve-rocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC) 0157 // Commun. Dis. Public Health. 5. 74—75.
M art ine z - U rt az a J., Saco M., Novoa J., P e r e z - P i n e i r o P., Peiteado J., Lozano-Le-on A., Garcia-Martin O. 2004. Influence of environmental factors and human activity on the presence of Salmonella serovars in a marine environment // Appl. Environ. Microbiol. 70. 2089—2097.
McGee P., Scott L., Sheridan J.J., Ear-ley B., Leonard N. 2004. Horizontal transmission of Esgherichia coli O157:H7 during cattle housing // J. Food Prot. 67. 2651—2656.
Newell D.G., Fearnley C. 2003. Sources of Campylobacter colonization in broiler chickens // Appl. Environ. Microbiol. 69. 4343—4351.
Sojka R.E., Entry J.A. 2000. Influence of Polyacrylamide application to soil on movement of microorganisms in runoff water // Environmental pollution. 108. 405—412.
Van Bruggen A.H.C., Franz E., Seme-no v A.M. 2008. Human pathogens in organic and con-
ventional foods and effects of the environment / Eds. I. Gi-vens, S. Baxter, A.M. Minihane, E. Shaw // Health Benefits of Organic Food: Effects of the environment. Wallingford, UK. P. 160-189.
Waldenstrom J., Ottval R., Hassel-quist D., Harrington C, Olsen B. 2003. Avian reservoirs and zoonotic potential of emerging human pathogen Helicobacter canadensis // Appl. Environ. Microbiol. 69. 7523-7526.
nocTynma B pe^aKUHM 18.02.09
DYNAMICS OF A SURVIVAL OF ENTEROPATHOGENIC
AND SAPROTROPHIC BACTERIA AT PASSAGE THROUGH A DIGESTIVE PATH
OF BIRDS, IN THEIR EXCREMENT AND IN WATER
A.A. Koupriyanov, A.M. Semenov, A.H. C. Van Brüggen, A.I. Netrusov, E. V. Semenova
Ability of saprotrophic Pseudomonas fluorescens 32 gfp and two enteropathogenic Salmonella enterica var. Typhimurium MAE 110 gfp and Escherichia coli O157:H7 bacteria to passage through gastroenteric path (GEP) of birds (domestic hens), dynamics of a survival of these bacteria in excrement of hens and in water after moving to one was traced.
Key words: enterobacteria, dynamic of population, survival, birds, dung, water.
Сведения об авторах
Куприянов Алексей Александрович — аспирант кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. 8-903-240-48-16; e-mail: aakupriyanov@mail.ru
Семенов Александр Михайлович — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-42-23; e-mail: amsemenov@list.ru
Ван Бругген Арина Хендрика Корнелия — проф. университета г. Вагенинген, Нидерланды, группа органического земледелия. Тел. +31317481191; e-mail: Ariena.vanBruggen@wur.nl
Нетрусов Александр Иванович — докт. биол. наук, проф., зав. кафедрой микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-27-63; e-mail: anetrusov@mail.ru
Семенова Елена Владимировна — канд. биол. наук, доц. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-45-45; e-mail: amsemenov@list.ru
