CC BY
20
УДК 577.112+612.812.2(092.9)
О.Л. Дроздов , В.1. Чорна
ДИНАМ1КА ВМ1СТУ ГЛ1АЛЬНОГО Ф1БРИЛЯРНОГО КИСЛОГО Б1ЛКА I Л1ЗОСОМНИХ ПРОТЕАЗ У ФРОНТАЛЬН1Й КОР1 ЩУР1В ПРИ ФОРМУВАНН1 УМОВНО-РЕФЛЕКТОРНО1 ПАМЯТ1
Днтропетровська державна медична академiя (зав. ЦНДЛ - д. мед. н., проф. О.Л. Дроздов) Днтропетровський нацюнальний утверситет
Ключовi слова: нейроспецифiчний бшок, цисте'товий катепсин В, неокортекс, навчання, пам 'ять Key words: neurospecific protein, cysteine cathepsin B, neocortex, training, memory
Резюме. Исследована динамика концентрации глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) и уровней свободной и неседимен-тированной форм активности катепсина В (КФ 3.4.22.1) фронтальной зоны неокортекса головного мозга крыс при формировании условной реакции активного избегания (УРАИ). Иммуноферментное определение содержания ГФКБи активностей лизосомного цистеинового катепсина В проводили через 3, 7, 14 и 21 сутки после начала обучения животных. Установлено, что повышение уровней активности исследуемой про-теазы на фоне изменения концентрации нейроспецифического белка опытных крыс при воспроизведении УРАИ может быть одним из механизмов, обеспечивающих перестройку нейронных паттернов в процессах обучения, а также объективной оценкой состояния данной ин-тегративной функции мозга.
Summary. Both glial fibrillar acid protein (GFAP) content dynamics and free and/nonsedimentation cathepsin B (EC 3.4.22.1) activity levels in frontal neocortex of rat brain were researched during the formation of conditioned active avoidance reaction (CAAR). Immunoenzymatic determination of GFAP content and lysosomal cysteine cathepsin B activity was carried out after 3-d, 7-th, 14-th, and 21-st day of training of animals. It was established that the increase of researched protease activity levels with neurospecific protein content changes in experimental rats during CAAR reproduction may be one of the mechanisms providing re-building of neuronal patterns during training processes, as well as objective estimation of state of this integrative brain function.
Суттеву роль у феномеш пластичносп нерво-во! системи вщграють астромальш клггини, яю беруть участь у регуляци метаболiзму i ак-тивност нейрошв. Глiальний фiбрилярний кис-лий бшок (ГФКБ) промiжних фшаменпв цито-скелету мозку (glial fibrillary acidic protein) [3] знаходиться як у розчиннш, так i у фшаментнш формах; пул останнього складаеться з ГФКБ, звязаного з промiжними фшаментами. Розчинна форма притаманна деградованому ГФКБ. Гл> альний фiбрилярний кислий бшок - астро-цитарно-специфiчний бшок залучаеться до про-цешв малитазацл синаптогенезу, кл^инно! адгези, росту нейрита тощо. Для астроцштв визначеш рецептори, яю контролюють роботу юнних каналiв, систему вторинних менеджерiв i впливають на астроцит-нейронш взаемоди [2]. ГФКБ залучаеться до процеав формування вщростюв астроцитарних одиниць у вщповщь на стимулящю нейронiв, а також до пластичних перебудов синаптичних звязюв [3]. Дослщження
останн1х рок1в присвячен1 визначенню рол1 бюсинтезу нейроспециф1чних бшюв у процесах навчання, формувант { збережент енграм памятг 1нтерес до цих бшюв шдвищився у звязку з тим, що 1х обмш значно змшюеться при навчанш, вироблент нових поведшкових нави-чок. За даними Spinkova et а1 [9], спрямовашсть { р1вень цитох1м1чних змш у вщповщност до шформацшного навантаження можуть бути маркерами р1вня навченост При дослщжент ней-рох1м1чних { молекулярних мехашзм1в нейроло-пчно! памят важливе мюце належить обм1ну бшюв, необхщною складовою якого е процеси протеол1зу 1 модифшацп синтезу [4]. Л1зосомт цисте!нов1 протеази беруть участь у деградаци бшюв, яю потрапляють з аксоплазматичним потоком, { в подальшому амшокислоти викорис-товуються для створення нових бшюв безпо-середньо у синаптичнш дшянщ. Пщвищений р1вень протеол1зу супроводжуе нейрональну де-генеращю. Активащю л1зосомного цистешового
катепсину В (КФ 3.4.22.1) встановлено при хво-po6i Альцгеймера [8].
Для поглибленого розумшня ролi цисте!нових катепсишв i обмеженого протеолiзу в процесах формування, зберiгання i вiдтворення памятного стду нами було поставлено за мету дослщити змiни концентраци фшаментно! форми ГФКБ i динамiку активност катепсину В у фронтальнiй зош неокортексу головного мозку щурiв при виробленш умовно! реакци активного уникнення (УРАУ).
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛЩЖЕНЬ
Дослiдження проводили на 79 щурах лши Вiстар масою 180-230г. Для ощнки динамiки рiвнiв активностi катепсину В i вмiсту нейро-специфiчного бiлка ГФКБ у процесi формування енграм памят як модель мнестичних реакцiй використано умовну реакцiю активного уникнення (УРАУ). Вибiр дано! моделi зумовлений можливiстю тестування стану процесу формування енграм памят протягом кожно! доби навчання. Умовну активно-оборонну навичку формували в Y-подiбному лабiринтi з електри-фiкованою шдлогою вiдсiкiв. Умовним стимулом слугував св^ловий подразник, а безумовним пiдкрiпленням - ноцицептивна електростиму-ляцiя. Навчання тварин проводили по шють сеансiв на тиждень iз 10 сполученнями умовного сигналу з безумовним шдкршленням до досяг-нення критерiю навчання 95% переходiв в освiтлений вiдсiк, яю вiдбувалися до подачi ноцицептивного подразника. Через 2 год. шсля заюнчення сеансiв навчання тварин декаш-тували. Всi операщ! з тканинами головного мозку виконували за t=0-4°C.
Показники формування енграм умовно-реф-лекторно! памят^ вмiсту ГФКБ та активностi катепсину В у фронтальнш зонi неокортексу головного мозку контрольних i дослщних щурiв аналiзували через 3, 7, 14 i 21 добу шсля початку вироблення УРАУ. Вмiст фшаментно! форми ГФКБ визначали у цитоскелетнш фракщ! фронтально! зони неокортексу методом твердофазного iмуноферментного аналiзу. При цьому використовували варiант шпбування антигеном [1] i концентрацiю ГФКБ виражали в мкг/г тканини. Вшьну активнiсть катепсину В вияв-ляли в 10%-му розчиш гомогенатiв у 0,025 М трис-буферi з рН 7,4, який мютить 0,15 М NaCl та 1мМ EDTO, неседиментовану фракщю отримували iз застосуванням центрифуги VAC-601 (105000 g х 50 хв.).
Активнiсть катепсину В дослiджували за роз-щепленням ¿»-штроаншду N, а-бензош-D, L-aргiнiну (БАПА) ("Fluka", Швейцарiя) [5] i
виражали - в мкмоль р-штроаншну за 1 хв. на 1 мг бшка. Кшьюсну оцiнку загального бшка в пробах проводили за методом Бредфорда [6]. Результати статистично обробляли iз застосуванням ^критерда Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
В результат проведених дослiджень вста-новлеш закономiрнi змiни концентраци фшаментно! форми ГФКБ та вшьно! i неседиментовано! форм активностi лiзосомного цисте-!нового катепсину В у фронтальнш зош неокортексу щурiв у процес вироблення умовно-рефлекторно! памяти
Динамiка вмiсту нейроспецифiчного бшка ГФКБ у цитоскелетнш фракщ! неокортексу при формуванш УРАУ надана на рисунку. Показано, що на 7 та 14 добу спостережень концентращя ГФКБ у мозку шддослщних щурiв вiрогiдно зменшилась на 64% та 62% вщповщно порiвняно з контролем. На 21 добу вироблення УРАУ спостер^али закршлення навички УРАУ, яке виявлялося у поступовому скороченш латентного перюду, i саме на 21 добу шсля початку навчання вщзначали шдвищення експресп ГФКБ в 2, 3 разу порiвняно з контролем.
Особливютю динамiки катепсину В було вiро-гiдне зниження як вшьно!, так i неседиментовано! активносп на 34% i 86% (р<0,05) на третю добу з початку навчання (рис.) i iстотне шдвищення на 7 добу формування УРАУ на 57% вшьно! активносп та в 3,5 разу неседиментовано! порiвняно з контролем. Визначення вiльно! i неседиментовано! форм активностi катепсину В е iнформативним у сенсi встановлення змш ком-партменталiзацi! катепсинiв у клггинах мозку при навчаннi, а визначення неседиментовано! активносп е найбшьш поширеним i визнаним методом ощнки стабшьност мембран лiзосом [7]. На наступному еташ (21 доба) вироблення у щурiв умовно! активно-оборонно! навички вшьна i неседиментована активностi катепсину В знижуються порiвняно з попередшм термiном, але залишаються вище за норму, особливо неседиментована форма активностi. Враховуючи данi про те, що рiвень експресi! нейроспе-цифiчних бiлкiв корелюе зi стадiями формування енграм памят [8], ми можемо припустити, що встановлеш нами змiни концентрацi! ГКФБ можуть вiдбивати етапи формування умовно-рефлекторно! память Цi данi узгоджуються з уявленнями про важливу роль ГФКБ у забез-печеннi синаптично! пластичностi. Астроглiальнi клiтини тiсно асоцшоваш iз синаптичними структурами нейронiв i мають рецептори, якi реагують на нейротрансмтерну стимуляцiю [9].
09/ Том XIV/ 4
9
Отримаш результати шдтверджують ютотну реактивнiсть лiзосом клiтин нервово! тканини, в першу чергу кл^ин неокортексу головного мозку, щодо вироблення пам ятного слщу i високу чутливiсть протеолiзу кори головного мозку експериментальних щурiв при виробленнi УРАУ.
Показано, що пiдвищення активностi катеп-сину В може бути пов язано зi збшьшенням мРНК катепсину В, тому що катепсин В ко-дуеться одним особистим геном i не дае
перехресно! пбридизаци з мРНК катепсину Н, катепсину L i кальпа!шв [10]. 1снуе рiзниця у процесингу катепсину В у секреторних пухирцях та лiзосомах, яка може привести до утворення активних високомолекулярних форм ферменту зi специфiчними характеристиками. Можливо, щ-ею особливiстю i пояснюються рiзнi рiвнi вшьно! i неседиментовано! активностi катепсину В у фронтальнш зонi неокортексу головного мозку щурiв при формуваннi УРАУ.
350
%
300
250
200
150
100
50
1-контроль; 2-3 доби; 3-7 дiб; 4-14 дiб;
□ вiльна актившсть катепсину В
□ неседиментована активнiсть катепсину В
□ ГФКБ
Динамжа вшьноТ, неседиментованоТ активностi катепсину та вмкту ГФКБ у фронтальнш зош неокортексу щурiв у процесi формуваммя умовмо-рефлектормо1 пам'ятк вшьна активмiсть катепсину В,
неседиментована актившсть катепсину В, ГФКБ
Прим1тка: *р < 0,05 - в1ропдшсть змши по вщношенню до контролю
5
ВИСНОВКИ
1. Таким чином, експериментально вста-новлено, що в процес формування умовно-рефлекторно! памят у щурiв у фронтальнш зош неокортекса змши концентраци нейроспеци-фiчного ГФКБ i активностi катепсину В вщби-вають складний характер взаемовщносин бшок-синтетичних i протеолггичних процесiв.
2. Визначенi пiдвищення вшьно! i неседи-
ментовано! активностi катепсину В свщчать про вiрогiдний мембранотропний вплив вироблення УРАУ на лiзосомально-вакуолярний апарат неокортексу головного мозку шддослщних тварин.
3. Встановлеш змши концентраци фша-ментно! форми ГФКБ i рiвнiв активностi катепсину В можуть бути объективною ощнкою дано! iнтегративно! функцi! мозку.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Антитела. Методы / Под ред. Кетти. - Д., М.: Мир, 1991.-384 с.
2. Дроздов А.Л., Черная В.И. Нейроспеци-фические белки ГФКБ и NCAM гиппокампа при формировании энграмм условно-рефлекторной памяти // Нейрохимия. - 2005.-Т. 22, №4.- С. 285-289.
3. Дука Т.Т., Лещинська 1.О., Чорна В.1. Характеристика гл1ального ф1брилярного кислого б1лка -компоненти астрогл1альних пром1жних фшаменлв центрально! нервово! системи // Б1опол1мери i клггина. -2002.-Т. 18, №3.- С. 179-185.
4. Artal - Sanz P., Tavernakis N. Proteolytic mechanisms in neurotic cell death and neurodegeneration // FEBS Left.- 2005.- Vol. 579.-P. 3287-3296
5. Barrett A. J., Kirske H., Cathepsin B. // Meth. Enzymol.- 1981.- Vol. 80.- P.535-561.
6. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quatitation of microgram quantities of protein utiliring the principle of protein-dye binding // Aval. Biochen.-1976.-Vol. 72.-P. 248-250.
7. Guicciardi M., Leist M., Gores G. Lysosomes in cell death // Oncogene.- 2004.- Vol. 23.- P. 2881-2890.
8. Mohamed M. M., Sloane B. Cystein cathepsins: Multi functional enzyme in cancer // Nature.-2006. - N 6.-P. 764-775.
9. Shpinkova V., Gershtein L., Nikolskaya K. Individual reculiarites of rats learning and its cytochemical correlates // Eur. J. Neurosci.-1998. - Vol. 98, N10. -P.156-162.
10. Stoka V., Turk B., Turk V. Lysosomal cystein proteases: structural features and their role in apoptosis // IUBMB life.-2005.- Vol. 57.-P. 347-353.
♦
УДК 615.015.35:591.151:616.72-002-092.9
H.I. Волощук СТАТЕВИЙ ДИМОРФ1ЗМ
ФАРМАКОЛОГ1ЧНО1 АКТИВНОСТ1 ТА ТОКСИЧНОСТ1 ДИКЛОФЕНАКУ НАТР1Ю У ЩУР1В З АД'ЮВАНТНИМ АРТРИТОМ
Втницький нацiональний медичний унiверситет iм. М.1. Пирогова
кафедра фармакологи
(зав. - д. мед. н., проф. Г.1. Степанюк)
Ключовi слова: статевi вiдмiнностi, диклофенак натрт, ад 'ювантний артрит, токсичнкть, щури Key words: sexual differences, diclophenac-sodium, adjuvant arthritis, toxicity, rats
Резюме. В опытах на самцах и самках крыс с ад 'ювантным артритом было установлено, что аутоимунный процесс существенно повышает анальгезирующий эффект, гастро- и нефротоксичность диклофенака натрия у животных обоего пола. Выявленные ранее половые различия фармакодинамики с превалированием силы и длительности антино-цицептивного и антифлогогенного эффекта и меньшей токсичности у самок крыс по сравнению с самцами, которые имеют место у ин-тактных животных, при моделировании воспалительного процесса сохраняются.
Summary. In the experiments on rats of both sexes with adjuvant arthritis it was determined that autoimmune process significantly increases analgesic effect, gastro- and nephrotoxicity of diclophenac sodium. Previously revealed sex differences of pharmacodynamics with predominance of force and persistence of antinociceptive and antiphlogogenic effect and less toxicity in female rats as compared to male rats, occuring in intact animals in modeling of inflammatory process, persist.
Нестеро!дш протизапальш препарати (НПЗП) е добре вщомими i широко вживаними лшарсь-кими засобами. За бшьш шж 100-лггнш перюд вщ початку !х застосування масштаби регу-
лярного використання цих препаратiв охоп-люють близько 26% населення нашо! планети. Щоденно певнi НПЗП приймають 40 млн осiб, причому приблизно в 1/3 випадюв - безре-
09/ Том XIV/ 4
11
