CC BY
48
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у пациенток с привычным выкидышем аллоиммунного генеза в течение беременности
Тетруашвили Н.К., Кречетова Л.В., Сарибегова В.А., Вторушина В.В., Голубева Е.Л., Хачатрян Н.А., Агаджанова А.А.
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва
В данной работе оценивали иммунологические показатели у женщин с идиопатическим привычным выкидышем (ПВ) после иммуноцитотерапии в течение всего гестационного периода. Также проведен анализ гестационных осложнений и исходов беременностей.
Цель исследования - исследовать динамику субпопуляций Ш200+ и Трег-клеток у пациенток с идиопатиче-
ским ПВ в течение беременности, развивающейся после иммуноцитотерапии, проведенной в I триместре.
Материал и методы. В исследование были включены 100 пациенток с идиопатическим ПВ, из них забеременевших после проведенной предгестационной иммуноцитотерапии (группа с предгестационной подготовкой, включающей 2 процедуры аллоиммунизации) - 49 пациенток; вступивших в беременность без предгестационной подготовки (группа без предгестационной подготовки) - 23 пациентки. Также в исследование были включены 42 женщины контрольной группы в разные сроки физиологического течения беременности. Проводили фенотипирование лимфоцитов периферической крови. Кровь для анализа у беременных забирали натощак из локтевой вены в 5-6 нед гестации до аллоиммунизации, затем в 8-9 нед после первой процедуры аллоиммунизации и до 2-й процедуры, в 12 нед (через 3-4 нед после 2-й процедуры аллоиммунизации) и далее в течение всей беременности в 16, 20, 25, 30, 34 и 37-38 нед гестации.
Результаты. У женщин с неблагоприятным исходом первой половины беременности содержание субпопуляций NK-клеток было значимо ниже, а также содержание Трег-клеток в ранних сроках беременности у женщин с преждевременными родами было достоверно ниже, чем в контрольной группе. Различий в субпопуляционном составе лимфоцитов пациенток с ПВ из группы с предгестационной подготовкой и женщин контрольной группы с 12 нед гестации в отличие от пациенток с ПВ без предгестационной подготовки не обнаружено. Можно предположить, что для нормализации состояния иммунной системы пациенток с привычным невынашиванием 2 процедур аллоиммунизации в I триместре недостаточно, и предгестаци-онная аллоиммунизация необходима при подготовке пациенток с ПВ к беременности.
Вывод. Иммунизация беременных женщин клетками полового партнера привела к сбалансированности воспалительных реакций и достижению такого состояния иммунной системы, которое способствовало вынашиванию данной беременности.
Ключевые слова:
привычный
выкидыш,
Т-регуляторные
клетки, CD200,
аллоиммунный
генез,
предгестационная подготовка, иммуноцито-терапия
Dynamics of subpopulation structure of lymphocytes of peripheral blood at patients with a habitual abortion of alloimmunny genesis during pregnancy
TetruashviliN.K., Krechetova L.V., Saribegova V.A., Vtorushina V.V., Golubeva E.L., Khachatryan N.A., Agadzhanova A.A.
V.I. Kulakov Obstetrics, Gynecology and Perinatology National Medical Research Center of Ministry of Healthcаre of the Russian Federation, Moscow
In this study the authors estimated immunological indicators in women with idiopathic recurrent abortion (RA) after immunocytotherapy during all gestational period. The analysis of gestational complications and pregnancy outcomes was also conducted.
The aim of the study was to investigate NK cells, CD200+ and Treg-cells subpopulations dynamics, in patients with idiopathic RA during pregnancy, which developed after first-trimester immunocytotherapy.
Material and methods. The study included 100 patients with idiopathic RA. 49 of them became pregnant after prepregnancy immunocytotherapy (group with pregestational preparation, including 2 alloimmunization procedures); 23 patients became pregnant without pregestational preparation (group without pregestational preparation ). Also, in the study control group were included with 42 women of different gestational age. Phenotyping of peripheral blood lymphocytes was carried out. Blood for analysis was taken from pregnant women in fasting state from median cubital vein at 5-6 weeks of gestational age before alloimmunization, then at 8-9 weeks of gestational age after first alloimmunization procedure and before 2nd procedure, at 12 weeks of gestational age (3-4 weeks after 2nd alloimmunization procedure) and further during entire pregnancy at 16, 20, 25, 30, 34 and 37-38 weeks of gestational age.
Results. In women with adverse recent pregnancy outcome NK-cells subpopulations content was significantly lower than in control group, and in women with preterm labor in recent pregnancy Treg-cells content was also significantly lower than in control group. There were no differences in subpopulation composition of lymphocytes of patients with RA in prepregnancy preparation group and in control group (from 12 weeks of gestation) in contrast to patients with RA without prepregnancy preparation. It can be assumed that 2 alloimmunization procedures in I trimester is not enough for patients with recurrent abortion immune system recovery. Pregestational alloimmunization is necessary for patients with RA pregnancy preparation.
Conclusion. Immunization of pregnant women with sexual partner cells led to inflammatory responses balance and achievement the immune system state which promoted carrying of this pregnancy.
Keywords:
habitual
miscarriage,
T-regulatory
cells, CD200,
homoimmune
genesis,
prepregnancy
preparation,
immunocyto-
therapy
Идиопатический привычный выкидыш (ПВ) в структуре причин привычных потерь беременности составляет 5-20%. Этиологию данного состояния в настоящее время связывают с нарушениями функционирования материнской иммунной системы, развивающей неадекватный ответ на отцовские антигены плода (аллоиммунные причины) [1]. По данным зарубежных авторов, шанс доносить беременность без терапии после 3 выкидышей, обусловленных аллоим-мунными механизмами, составляет 30%, после 4 - 25%, после 5 - 5% [2, 3]. Своевременная диагностика и назначение иммунокорригирующей терапии составляет основу тактики подготовки пациенток с идиопатическим ПВ к беременности. Установлено, что женщины с ПВ на ранних сроках гестации составляют группу риска, в которой существенно повышена вероятность развития плацента-ассоциированных осложнений: плацентарной недостаточности, задержки роста плода, ранних преждевременных родов, отслойки плаценты во II и в III триместрах беременности [4, 5]. В этой связи предгеста-ционная подготовка представляет собой профилактику не только ранних потерь беременности, но и поздних ге-стационных осложнений. В настоящее время даже 2 последовательных выкидышей рассматриваются как основание для постановки диагноза «привычный выкидыш», последующего обязательного обследования, в том числе иммунологического, и оптимизации подготовки к беременности [6].
Одним из вариантов иммуномодулирующей терапии является - иммуноцитотерапия (ИЦТ) - иммунизация женщин с ПВ аллогенными лимфоцитами партнеров. Показано, что ИЦТ в предгестационной подготовке способствует формированию состояния иммунной системы, необходимого для успешной имплантации, а во время беременности - для стимуляции развития плаценты и обеспечения нормального развития эмбриона [7, 8]. ИЦТ широко используется в России [9, 10] и за рубежом [11, 12], однако механизмы влияния аллоиммунизации на имплантацию и последующую гестацию остаются малоизученными. Оценка клеточных субпопуляций периферической крови - необходимая составляющая анализа эффектов иммунокорригирующей терапии, поскольку ее главной целью является подавление агрессивных эффекторных реакций, в первую очередь связанных с увеличенным содержанием в периферической крови пациенток с ПВ субпопуляций клеток с естественной киллерной активностью.
Киллерные клетки с фенотипом CD56+, CD16+, CD3-CD56CD16+,CD3-CD8+ являются клетками врожденного иммунитета. Цитотоксические клетки, появляющиеся в эффекторной фазе иммунного ответа и имеющие фенотип CD3+CD8+ и CD3+CD56,CD16+, относят к клеткам адаптивного иммунитета. Предполагается, что в генезе привычного выкидыша большую роль играет нарушение взаимодействий ^56+,
CD16+) и клеток адаптивного иммунитета. Однако, несмотря на довольно продолжительный период изучения периферической крови в генезе ПВ,
значимость их оценки для прогноза осложнений беременности остается невыясненной [13].
Особую значимость в последнем десятилетии приобрели исследования субпопуляции Т-регуляторных клеток с фенотипом CD4+ CD25+ и конститутивной экспрессией фактора Foхр3 (Трег). Считается, что Трег-специфическая иммуносупрессия способствует формированию толерантности, необходимой для реализации гестационных процессов в I триместре беременности [14]. В связи с этим обсуждается точка зрения, что целью иммунотерапии должна быть не иммуносупрессия, а стимуляция толерантности к аллоантигенам плода отцовского происхождения [15].
Показано, что важная роль в иммунорегуляции принадлежит толерогенной молекуле СD200. В результате взаимодействия CD200 с рецепторами как дендритных клеток, так и клеток с естественной киллерной активностью индуцируется секреция индоламиндиоксигеназы, и они приобретают способность посредством продукции трансформирующего фактора роста в (ТФР в) стимулировать генерацию Трег-клеток и, соответственно, индуцировать формирование специфической периферической толерантности [16-19].
Исследования, посвященные одновременной оценке динамики субпопуляций лимфоцитов периферической крови, включая субпопуляции с киллерной активностью, Трег и CD200+-клеток, в динамике беременности практически не встречаются в доступной литературе.
Поэтому анализ субпопуляционного состава периферической крови беременных с идиопатическим ПВ является актуальным для поиска иммунологических критериев прогноза развития беременности, особенно на фоне иммуномодулирующей терапии.
Цель данной работы - исследование динамики субпопуляций NK-клеток, CD200+ и Трег-клеток у пациенток с идиопатическим ПВ в течение беременности, развивающейся после иммуноцитотерапии, проведенной в I триместре.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование были включены пациентки с ПВ неясного генеза, имеющие в анамнезе 2 и более спонтанные потери беременности от одного партнера.
Критерии включения: подписание формы информированного согласия на участие в исследовании, возраст женщины от 20 до 40 лет, самопроизвольное наступление беременностей, нормальный кариотип обоих партнеров, нормозооспермия у партнера, отсутствие анатомических, генетически обусловленных, аутоиммунных, гормональных нарушений, препятствующих наступлению и вынашиванию беременности, отсутствие тяжелых экстрагени-тальных заболеваний.
Критерии исключения: отсутствие возможности пациентки продолжать исследование, нарушение требований протокола исследования, отягощенный аллергоанамнез.
Всего в исследование были включены 100 пациенток с идиопатическим ПВ, из них забеременевших после про-
веденной предгестационной иммуноцитотерапии (группа с предгестационной подготовкой, включающей 2 процедуры аллоиммунизации, группа СПП) - 49 пациенток; вступивших в беременность без предгестационной подготовки (группа без предгестационной подготовки, группа БПП) - 23 пациентки. Также в исследование были включены 42 женщины контрольной группы с разными сроками физиологического течения беременности.
Предгестационная иммуноцитотерапия включала 2 курса аллоиммунизации лимфоцитами полового партнера дважды с интервалом в 1 мес на 5-9-й день менструального цикла. При этом пациенткам внутрикожно вводили 50 млн клеток в ладонную поверхность предплечья в 10-12 точек.
В I триместре беременности аллоиммунизацию проводили всем 49 пациенткам с ПВ в анамнезе в сроке 5-6 и 8-9 нед беременности.
Кровь для анализа у беременных забирали натощак из локтевой вены в 5-6 нед гестации до аллоиммунизации, затем в 8-9 нед после 1-й процедуры аллоиммунизации и до 2-й процедуры, в 12 нед (через 3-4 нед после 2-й процедуры аллоиммунизации) и далее в течение всей беременности в 16, 20, 25, 30, 34 и 37-38 нед гестации.
Поверхностный фенотип клеток периферической крови определяли с помощью стандартного набора мо-ноклональных антител (мАт), меченных флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) или фикоэритрином (ФЭ), против антигенов CD3 (ФИТЦ), CD16 (ФЭ), CD56 (ФЭ), CD200 (ФЭ) (Becton Dickinson и eBioscience, США). Оценивали содержание CD200+-клеток, NK-клеток (CD56+, CD16+), а также содержание Трег.
Лимфоцитарный гейт, позволяющий исключить из анализа другие клетки крови, выявляли с помощью мАт к CD45, меченных перидинин-хлорофилл протеином (Per-CP) (Dako, Дания). Для оценки позитивно-окрашенных субпопуляций использовали соответствующие ФИТЦ или ФЭ-меченые изотипические IgG.
Субпопуляцию Трег-клеток с фенотипом CD4+CD25high и внутриклеточной экспрессией транскрипционного фактора Foxp3+ определяли как субпопуляцию с поверхностным фенотипом CD4+CD25highCD127low/- [20]. Для оценки процентного содержания Трег-клеток использовали набор, содержащий моноклональные антитела к антигенам CD4, меченые Per-CP (eBioscience, США), CD25, меченые ФИТЦ (Becton Dickinson, США) и CD127, меченые ФЭ (eBioscience, США).
Моноклональные антитела добавляли непосредственно к цельной крови, затем лизировали с помощью раствора FACS Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Анализ проводили с использованием проточного цитофлуориме-тра FACSСalibur (Becton Dickinson, США).
Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами вариационной статистики. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего. Соответствие расчетных выборок показателей нормальному распределению оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка с использованием статистического пакета MedCalc12 для Windows 7.
Значимость наблюдаемых отклонений средних значений измеренных параметров оценивали с помощью двухвыбо-рочного f-критерия Стьюдента с различными дисперсиями для средних значений с использованием пакета статистического анализа для Microsoft Office Excel 2007. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Для оценки диагностической значимости тестов фе-нотипирования лимфоцитов периферической крови женщин с привычным беременности выкидышем использовали ROC-анализ пакета MedCalc12 для Windows 7.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Динамика иммунологических параметров в течение беременности у пациенток с привычным выкидышем
На рис. 1 представлено содержание в периферической крови Трег и CD200+-клеток в разные сроки беременности.
Как следует из представленных данных (см. рис. 1), содержание Трег в 8-9 нед гестации в обеих группах с ПВ значимо ниже, чем в контроле, а в 12 нед гестации значимо ниже только в крови беременных без предгестацион-
15 т-
9 --
3 --
СПП -■- БПП -А-Контроль
5-6 8-9 12 16 20 25 30 34 37-38 Сроки беременности, нед
20 т
о 10-
5 --
СПП -■- БПП •■■А'-*Контроль
#
-+-
5-6 8-9 12 16 20 25 30 34 Сроки беременности, нед
37-38
Рис. 1. Содержание СР200+-клеток и Трег в периферической крови пациенток с привычным выкидышем в течение беременности, развивающейся на фоне аллоиммунизации в I триместре
Здесь и далее на рис. 2-5: СПП - группа с предгестационной аллоиммунизацией; БПП - группа без предгестационной аллоиммунизации; # - различия достоверны в группах СПП и контрольной; ^ - различия достоверны в группах СПП и БПП; * - различия достоверны в группах БПП и контрольной.
12 ■-
*
6 ■-
0
#
15 ■-
0
ной аллоиммунизации (группы БПП). Важно отметить, что в 37-38 нед (последнее обследование в сроке перед родами) в группе БПП содержание Трег оказалось значимо выше, чем в контроле и в группе прошедших предгестаци-онную подготовку (группа СПП).
Отличий в динамике Трег в группе СПП и в контрольной не отмечалось в течение всего периода наблюдения.
Содержание CD200+-клеток в 5-6 нед (до аллоиммунизации в I триместре) в группе с прегравидарной подготовкой было значимо выше, чем в группах без проведения подготовки и контрольной, а в 8-9 нед - значимо выше, чем в контроле. После первой процедуры аллоиммунизации исчезли различия в содержании CD200+-клеток в группе СПП и БПП.
В 25 и 30 нед беременности содержание CD200+-клеток в группе без подготовки было значимо ниже, чем в контроле и в группе с проведением предгестационной подготовки. Различий в содержании CD200+-клеток в эти и в другие сроки в контрольной группе пациенток и в группе с подготовкой не выявлено.
На протяжении всего исследования во все сроки не обнаружено различий между обследованными группами в содержании NK-клеток с фенотипом CD3+CD16+ (рис. 2). Содержание NK-клеток с фенотипом CD3+CD56,16+ было выше в группе с предгестационной подготовкой, чем в контроле, только в 8-9 нед беременности, при этом содержание с этой субпопуляции в группе без подготовки было одинаковым. Однако в течение беременности различий между группами по данному показателю не выявлено (рис. 2).
Содержание субпопуляций ИК-клеток различных фенотипов в течение беременности у пациенток с привычным выкидышем представлено на рис. 3-5. Не обнаружено различий в содержании ИК-клеток с фенотипом С03-Сй5б,1б+ между группами в разные сроки обследования. Содержание общей популяции ИК-клеток с фенотипом Сй5б,1б+ в группе без предгестационной подготовки было значимо выше, чем в группе с подготовкой в 34 нед беременности (рис. 3).
Содержание ИК-клеток с фенотипом Сй1б+ в группе без прегравидарной подготовки в 8-9 нед беременности было значимо выше, чем в контроле, а содержание ИК-клеток с фенотипом Сй3С01б+ в этой группе в 20 нед беременности было значимо ниже, чем в группах с подготовкой и контрольной (рис. 4).
Содержание ИК-клеток с фенотипом Сй5б+ в сроки гестации 5-б и 8 9 нед в группе с прегравидарной подготовкой было ниже, чем в группе без подготовки и в контроле, в 12, 1б и 20 нед беременности различия между группами не выявлялись, а в 25 и 34 нед содержание субпопуляции Сй5б+ в группе БПП было выше, чем в контроле (рис. 5).
Резюмируя исследования субпопуляционного состава периферической крови беременных с ПВ, получавших терапию в прегравидарной подготовке с включением процедуры аллоиммунизации, и пациенток без предгра-видарной аллоиммунизации, следует отметить, что, начиная с 12 нед беременности, т.е. через 3-4 недели после 2-й процедуры аллоиммунизации в I триместре, различий в содержании исследованных субпопуляций в группе
8 т
6 -
СПП -■- БПП —А—Контроль
15 1-
12-+ 9 f 6 5
о
6 ■-
5-6 8-9 12 16 20 25 30 34 37-38 Сроки беременности, нед
-•- СПП -■- БПП -А-Контроль
-+-
5-6 8-9 12 16 20 25 30 34 Сроки беременности, нед
37-38
Рис. 2. Содержание NKT-клеток в периферической крови пациенток с привычным выкидышем в течение беременности, развивающейся на фоне аллоиммунизации в I триместре
20 т
15 ■-
СПП -■- БПП -А-Контроль
0 -1-
Ч-1-1-1-1-1-1-1-
25 -20 -
vQ
+ 15 -
vH CD
5
Q 10--
5-6 8-9 12 16 20 25 30 34 37-38 Сроки беременности, нед
-•- СПП -■ БПП -А-Контроль
ч-
ч-
ч-
ч-
ч-
ч-
ч-
5-6 8-9 12 16 20 25 30 Сроки беременности, нед
34 37-38
Рис. 3. Содержание NK-клеток с фенотипом CD3-CD56,16+ и CD56,16+ в периферической крови пациенток с привычным выкидышем в течение беременности, развивающейся на фоне аллоиммунизации в I триместре
8 4 --
S 10
2 -
5 ■-
0
3 .-
5 .-
0
0
с подготовкой и контрольной не выявлено. Наибольшее число отклонений в исследованных иммунологических показателях во II и в III триместрах беременности выявлено в группе пациенток, не получавших предгестацион-ную подготовку.
Например, в группе БПП в 37-38 нед выявлено высокое содержание Трег-клеток (в группе БПП - 10,4+0,7; в контроле - 7,3+0,4, р=0,014, в группе СПП 7,8+0,7, р=0,017).
В 25 и 30 нед беременности содержание CD200+-клеток было ниже, чем в контроле и в группе СПП (25 нед: в группе БПП - 4,8+0,8, в контроле - 8,0+0,4, р=0,0004,
СПП -■- БПП -А-Контроль
20 --
+ 15
10 -
5 --
30 у 25 -20 -15 ■10 ■5 ■-
0
5-6 8-9 12 16 20 25 30 34 37-38 Сроки беременности, нед
-•- СПП -■ БПП -А-Контроль
-+-
-+-
-+-
-+-
-+-
-+-
5-6 8-9 12 16 20 25 30 34 37-38 Сроки беременности, нед
Рис. 4. Содержание NK-клеток с фенотипом CD3-CD16+ и CD16+ в периферической крови пациенток с привычным выкидышем в течение беременности, развивающейся на фоне аллоиммунизации в I триместре
5-6 8-9 12 16 20 25 30 Сроки беременности, нед
34 37-38
Рис. 5. Содержание NK-клеток с фенотипом CD56+ в периферической крови пациенток с привычным выкидышем в течение беременности, развивающейся на фоне аллоиммунизации в I триместре
в группе СПП - 8,6+0,3, р=0,002; 30 нед: в группе БПП -4,9+0,3, в контроле - 6,6+0,5, р=0,010, в группе СПП -8,0+1,2, р=0,015).
В группе БПП содержание NK-клеток с фенотипом CD56,16+ в 34 нед было выше, чем в группе СПП (соответственно 15,1+1,0 и 10,7+1,3, р=0,05), с фенотипом CD56+-клеток в 25 и 34 нед было выше, чем в контроле (25 нед: соответственно 18,3+2,0 и 13,8+1,8, р=0,048; 34 нед: соответственно 17,7+1,8 и 12,9+1,6, р=0,041), а с фенотипом CD3-CD16+ в сроке 20 нед гестации было ниже, чем в группах СПП и контрольной (в группе БПП - 3,4+1,3, в контроле - 12,2+1,6, р=0,0004, в группе СПП - 11,1+2,0, р=0,002).
Обобщая полученные результаты, можно утверждать, что различий в субпопуляционном составе лимфоцитов пациенток с ПВ из группы СПП и женщин контрольной группы с 12 нед гестации в отличие от пациенток с ПВ БПП, не обнаружено. Можно предположить, что для нормализации состояния иммунной системы пациенток с привычным невынашиванием двух процедур аллоиммунизации в I триместре недостаточно, и предгестационная аллоиммунизация необходима для подготовки пациенток с ПВ к беременности.
Ретроспективный анализ иммунологических параметров в зависимости от исходов беременности у пациенток с привычным выкидышем
По исходам настоящей беременности были выделены 2 подгруппы пациенток ПВ: с осложнениями ранних сроков беременности (1-я подгруппа, n=17) и с осложнениями поздних сроков беременности (2-я подгруппа, n=16).
В 1-й подгруппе у 15 пациенток выкидыш состоялся до 11 нед гестации и у 2 пациенток - до 16 нед гестации.
Во 2-й подгруппе - у 1 пациентки в 28-29 нед развилась тяжелая преэклампсия, потребовавшая досрочного родоразрешения. В связи с прогрессированием плацентарной недостаточности и ухудшением состояния плода проведено родоразрешение в 29-30 нед беременности. В связи с преждевременным излитием околоплодных вод при дихориальной диамниотической двойне в 2 случаях проведено кесарево сечение в 35-36 нед, также при преждевременном излитием околоплодных вод в 2 случаях проведено кесарево сечение в связи с конизацией шейки матки. В 1 случае родоразрешение проведено ввиду начала родовой деятельности и угрозы разрыва матки по рубцу. В 33-34 нед в 1 случае произошла антенатальная гибель плода. У 4 пациенток было проведено экстренное кесарево сечение в связи с нарастающей гипоксией плода в 35-36 нед. В остальных случаях развилась регулярная родовая деятельность в 34-36 нед беременности.
На рис. 6 отражены результаты ретроспективного анализа исследованных иммунологических показателей в 5-6 нед (до аллоиммунизации в I триместре) в 1-й подгруппе с целью выявления предикторов ранних потерь беременности.
Из данных, представленных на рис. 6, у пациенток с ПВ содержание субпопуляций NK-клеток было значимо ниже, чем у женщин с физиологически протекающей беременностью. Для показателей, значимо отличающихся
0
CD3+CD16+
*р=0,017
Рис. 6. Характеристика субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови в 5-6 нед гестации у пациенток с привычным выкидышем, потерявших беременность в I триместре
По осям представлены отношения средних значений показателей в 5-6 нед гестации у пациенток с привычным выкидышем к показателям в контрольной группе. Пунктирная линия соответствует уровню равенства значений. * - показатель, достоверно отличающийся от контрольных значений.
от контрольных значений, проведена оценка диагностической значимости тестов, представленная в табл. 1.
Как следует из табл. 1, специфичность определения исследованных субпопуляций ИК-клеток одинакова (100%). Это означает, что при снижении содержания указанных показателей ниже критериальных значений будут выявляться все пациентки с угрозой потери беременности в I триместре, поскольку специфичность теста - вероятность того, что тест будет отрицательным, если пациент здоров. Чувствительность тестов высокая, но максимальной чувствительностью обладает тест определения содержания субпопуляции Сй3-Сй5б,1б+ (91,7%). Величина данного параметра означает, что примерно у 8,3% пациенток с ПВ потери беременности в I триместре может не быть.
На рис. 7 отражены результаты ретроспективного анализа исследованных иммунологических показателей в 12 нед беременности (через 3-4 нед после 2-кратной аллоиммунизации лимфоцитами партнеров в I триместре) во 2-й подгруппе с целью выявления предикторов позд-
Таблица 1. Диагностическая значимость определения субпопуляционного состава ЫК-клеток периферической крови женщин с привычным выкидышем в 5-6 нед беременности для прогноза потери в I триместре
Показатель Специфичность Чувствительность Критериальное значение
CD56+, % 100,0 75,0 <10,6%
CD16+, % 100,0 72,7 <10,1%
CD56,16+, % 100,0 83,3 <11,8%
CD3-CD56,16+, % 100,0 91,7 <9,6%
CD3+CD16+
Рис. 7. Характеристика субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови в 12 нед гестации у пациенток с привычным выкидышем и поздними осложнениями гестации
По осям представлены отношения средних значений показателей в 12 нед гестации у пациенток с ПВ к показателям в контрольной группе. Пунктирная линия соответствует уровню равенства значений. * - показатель, достоверно отличающийся от контрольных значений.
них осложнений беременности, которые могут потребовать досрочного элективного родоразрешения.
Как следует из данных, представленных на рис. 7, различия обнаружены только в содержании Трег-клеток, которые в подгруппе с преждевременным родоразреше-нием оказались ниже, чем в контроле (6,0+0,5 и 8,0+0,5 соответственно, р=0,010). Проведенный расчет диагностической значимости определения Трег-клеток для прогноза развития беременности показал, что при содержании в периферической крови пациенток с ПВ Трег<7,5% в 12 нед беременности после проведенной аллоиммуни-зации в I триместре с чувствительностью 100% и специфичностью 61,5% можно прогнозировать развитие осложнений беременности, которые могут потребовать досрочного родоразрешения. Это означает, что у всех женщин с осложнениями, приводящими к досрочному родоразрешению, содержание Трег-клеток в периферической крови будет ниже 7,5%, но примерно у 38,5% беременных с содержанием Трег-клеток ниже порогового значения такого исхода беременности можно не ожидать.
ОБСУЖДЕНИЕ
Использование иммуномодулирующей терапии для лечения ПВ аллоиммунного генеза не вызывает сомнений, и ее различные варианты насчитывают более чем 30-летнюю историю. В данной работе оценивали динамику субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови в течение всего гестационного периода.
По мнению многих авторов, в формировании толерантности матери по отношению к плоду Трег-клетки являются важным участником, и их дефицит связывают с раз-
витием ПВ [21]. Последние исследования показали, что Трег-клетки увеличены во время физиологической беременности, показана связь между снижением количества Трег-клетки и иммунологическим отторжением плода [22].
В основе реализации механизмов толерантности рассматривалось участие различных типов клеток, однако ведущая роль, по всей видимости, принадлежит Т-клеткам с фенотипом CD4+CD25+ и внутриклеточной экспрессией фактора Foхр3+ - Трег-клеткам [23, 24].
В ранее проведенных исследованиях было показано, что во время беременности увеличивается доля Трег-клеток среди CD4+-клеток периферической крови и де-цидуальной оболочки матки в течение I и II триместров и уменьшается в послеродовом периоде [25, 26].
По результатам нашего исследования содержание Трег-клеток в 8-9 нед беременности в обеих группах с привычным выкидышем значимо ниже, чем в контроле, а в 12 нед беременности значимо ниже только в крови беременных без предгестационной аллоиммунизации. Однако в 37-38 нед в группе без предгестационной подготовки содержание Трег-клеток оказалось значимо выше, чем в контроле и в группе женщин, прошедших прегра-видарную подготовку. Отличий в динамике Трег-клеток в группе с предгестационной подготовкой и в контрольной не отмечалось в течение всего периода наблюдения.
По результатам нашего исследования содержание Трег-клеток различия обнаружены у женщин с преждевременными родами, где содержание Трег-клеток оказалось значимо меньше, чем в контроле. Проведенный расчет диагностической значимости определения Трег-клеток для прогноза развития беременности показал, что при содержании в периферической крови пациенток с ПВ Трег <7,5% в 12 нед беременности после проведенной аллоиммунизации в I триместре с чувствительностью 100% и специфичностью 61,5% можно прогнозировать развитие осложнений беременности, которые могут потребовать досрочного элективного родоразрешения. Это означает, что у всех женщин с осложнениями, приводящими к досрочному родоразрешению, содержание Трег в периферической крови будет <7,5%, но примерно у 38,5% беременных с ПВ с содержанием Трег ниже порогового значения такого исхода беременности можно не ожидать. Следовательно, нельзя исключить, что иммунизация влияет на состояние активации лимфоцитов основных субпопуляций, что, в свою очередь, изменяет функциональные особенности Трег-клеток.
В нашем исследовании содержание CD200+-клеток в 5-6 нед (до аллоиммунизации в I триместре) в группе с предгестационной подготовкой было значимо выше, чем в группах без предгестационной подготовки и контрольной, а в 8-9 нед - значимо выше, чем в контроле. После 1-й процедуры аллоиммунизации исчезли различия в содержании CD200+-клеток в группе с предгестационной подготовкой и без нее.
В 25 и 30 нед беременности содержание CD200+-клеток в группе без предгестационной подготовки было значимо ниже, чем в контроле и в группе с предгестационной подготовкой. Различий в содержании CD200+-клеток
в эти и в другие сроки в контрольной группе пациенток и в группе с предгестационной подготовкой не выявлено.
По данным некоторых исследований предполагается, что в основе потерь беременности на ранних сроках лежит нарушение взаимодействия NK-клеток (CD56+, CD16+) и клеток адаптивного иммунитета. Однако, несмотря на довольно продолжительный период изучения NK-клеток периферической крови в этиологии ПВ, их значимость оценки для прогноза ранней беременности не выяснена [27, 28].
Клетки с естественной киллерной активностью (NK-клетки) и фенотипом CD56+, CD16+, CD3-CD56,16+, CD3-CD8+ являются клетками врожденного иммунитета, обладают цитотоксической функцией.
В нашем исследовании содержание NK-клеток с фенотипом CD3+CD16+, CD3+CD56,16+, CD3-CD56,16+ не отличалось от содержания данных клеток в группах на протяжении всего исследования по срокам беременности.
В I триместре беременности в 5-6 и 8-9 нед после первой ИЦТ содержание NK-клеток с фенотипом CD56+ в группе с предгестационной подготовкой было ниже, чем в группе без предгестационной подготовки и в группе контроля. Содержание NK-клеток с фенотипом CD16+ в 8-9 нед в группе без предгестационной подготовки наблюдалось выше, чем в группе контроля. В 12 нед содержание CD56,16+ было выше в группе без предгестационной подготовки, чем в группе с предгестационной подготовкой.
Во II триместре в 20 нед беременности содержание NK-клеток с фенотипом CD3 CD16 в группе без предгестационной подготовки было значимо ниже, также в 25 нед содержание CD56+ в группе без предгестационной подготовки было выше, чем в группе контроля. Данные показатели могут быть связаны с клинически диагностированной в данные сроки истмико-цервикальной недостаточностью, а также с результатами бактериологического и данных исследований с помощью полимераз-ной цепной реакции, по которым определялись воспалительные изменения. Проведена оценка диагностической значимости определения субпопуляцонного состава NK-клеток периферической крови женщин с ПВ в 5-6 нед. Как следует из проведенной оценки, специфичность определения исследованных субпопуляций NK-клеток одинакова (100%). Чувствительность тестов высокая, но максимальной чувствительностью обладает тест определения содержания субпопуляции CD3-CD56,16+ (91,7%). Величина данного параметра означает, что примерно у 8,3% пациенток с ПВ потери беременности в I триместре может не быть.
В III триместре беременности в сроке 34-35 нед беременности содержание NK-клеток с фенотипом CD56,16+ в группе женщин, не прошедших предгестационную подготовку было выше, чем у женщин с предгестационной подготовкой. Содержание NK-клеток с фенотипом CD56+ в данной группе женщин было выше, чем в группе контроля.
Таким образом, субпопуляции клеток врожденного иммунитета с естественной киллерной активностью выше у женщин основной группы, чем в группе контроля.
Таким образом, по результатам данного исследования можно выделить несколько наиболее информативных NK-клеток с фенотипом CD56,16+, CD16+, CD3 CD16, CD56+. Данные маркеры по результатам исследования показали наиболее динамические изменения в течении беременности по исследуемым срокам. По-видимому, указанные популяции NK-клеток, играют роль в иммунорегуляции беременности. Надо отметить, что избыточная киллер-ная активность, связанная с увеличением содержания NK-клеток, могла быть компенсирована в присутствии Трег-клеток, оказывающих супрессивное воздействие на NK-клетки [29].
Указанные изменения могут свидетельствовать о достижении сбалансированного состояния иммунной системы, которое способствовало вынашиванию данной беременности.
Обобщая результаты исследования субпопуляционного состава периферической крови беременных с ПВ, которые получали терапию в предгестационной подготовке с включением процедуры аллоиммунизации, и пациенток без предгестационной аллоиммунизации, можно отметить, что начиная со срока 12 нед беременности, т.е. через 3-4 нед после 2-й процедуры аллоиммунизации в I триместре, различий в содержании исследованных субпопу-
ляций в группе предгестационной подготовкой и контрольной не выявлено. Достоверно наибольшее число отклонений в исследованных иммунологических показателях во II и в III триместрах беременности выявлено в группе пациенток без предгестационной подготовки.
В нашей работе исследована эффективность методики иммуноцитотерапии аллогеными лимфоцитами на протяжении всего гестационного периода. Установлено, что у женщин основной группы своевременные роды произошли в 63,5% случаев, преждевременные роды -у 16,7% наблюдаемых женщин. В 15,6% наблюдений имели место ранние потери беременности до 12 нед, из 15 прервавшихся беременностей 5 были обусловлены аномальным кариотипом, что и стало основной причиной прерывания, в 2,1% произошли выкидыши с 12-й по 22-ю неделю беременности, в 2,4% проведено прерывание беременности по медицинским показаниям.
Все вышеизложенное позволяет определить наиболее информативные иммунологические маркеры для оценки эффективности ИЦТ и предупреждения ранних прерываний беременности, диагностики поздних ге-стационных осложнений, что позволит оптимизировать ведение беременности для предотвращения преждевременных родов.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва:
Тетруашвили Нана Картлосовна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая 2-м акушерским отделением
патологии беременности
E-mail: n_tetruashvili@oparina4.ru
Кречетова Любовь Валентиновна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, заведующая лабораторией клинической иммунологии E-mail: k_l_v_@mail.ru
Сарибегова Виктория Александровна - аспирант 2-го акушерского отделения патологии беременности E-mail: saribegova_v@rambler.ru
Вторушина Валентина Валентиновна - кандидат медицинских наук, врач клинической лабораторной диагностики E-mail: vtorushina@inbox.ru
Голубева Елена Львовна - кандидат медицинских наук, врач-лаборант лаборатории клинической иммунологии E-mail: e_golubeva@oparina4.ru
Хачатрян Нелли Артуровна - аспирант 2-го акушерского отделения патологии беременности
Агаджанова Анна Арамовна - ведущий научный сотрудник 2-го акушерского отделения патологии беременности
E-mail: aagadjanova@mail.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Recurrent Pregnancy Loss: Causes, Controversies and Treatment/ ed. Carp Howard J.A. Informa UK Ltd.; 2007. 290 p.
2. Chong P.J., Matzner W.L., Ching W.T. Benefit of leukocyte immunizations? // Fertil. Steril. 1993. Vol. 59, N 1. P. 247-249.
3. Chong P.J., Matzner W.L., Ching W.T. Controversy about immunotherapy // Fertil. Steril. 1993. Vol. 59, N 5. P. 1138-1139.
4. Saraswat L., Bhattacharya S., Maheshwari A., Bhattacharya S. Maternal and perinatal outcome in women with threatened miscarriage in the first trimester: a systematic review // BJOG. 2010. Vol. 117, N 3. P. 245-257.
5. van Oppenraaij R.H., Jauniaux E., Christiansen O.B., Horcajadas J.A. et al.; ESHRE Special Interest Group for Early Pregnancy (SIGEP). Predicting adverse obstetric outcome
after early pregnancy events and complications: a review // Hum. Reprod. Update. 2009. Vol. 15, N 4. P. 409-421.
6. Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Невынашивание беременности : руководство для практикующих врачей. М. : Медицинское информационное агентство, 2011. 516 с.
7. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Иммунология беременности. М. : Изд-во РАМН;, 2003. 400 с.
8. Посиссева Л.В., Малышкина А.И., Бойко Е.Л., Сотникова Н.Ю. и др. Реабилитация репродуктивного здоровья супружеских пар с невынашиванием беременности. Иваново : Иваново, 2008. 240 с.
9. Петросян Л.А. Оптимизация лимфоцитоиммунотерапии в лечении привычной потери беременности первого триместра : автореф. дис. ... канд. мед наук. М., 2009. 24 с.
10. Khonina N.A., Broitman E.V., Shevela E.Y., Pasman N.M. et al. Mixed lymphocyte reaction blocking factors (MLR-Bf) as potential biomarker for indication and efficacy of paternal lymphocyte immunization in recurrent spontaneous abortion // Arch. Gynecol. Obstet. 2013. Vol. 288, N 4. P. 933-937.
11. Taro Nonaka, Koichi Takakuwa, Izumi Ooki, Mami Akashi et al. Results of Immunotherapy for Patients with Unexplained Primary Recurrent Abortions - Prospective Non-Randomized Cohort Study // Am. J. Reprod. Immunol. 2007. Vol. 58. P. 530-536.
12. Recurrent Miscarriage Immunotherapy Trialists Group. Worldwide collaborative observational study and metaanalysis on allogenic leukocyte immunotherapy for recurrent spontaneous abortion // Am. J. Reprod. Immunol. 1994. Vol. 32, N 3. P. 255.
13. Raghupathy R., Al-Mutawa E., Al-Azemi M., Makhseed M. et al. Progesterone-induced blocking factor (PIBF) modulates cytokine production by lymphocytes from women with recurrent miscarriage or preterm delivery // J. Reprod. Immunol. 2009. Vol. 80, N 1-2. P. 91-99.
14. Arck P., Hansen P.J., Mulac Jericevic B., Piccinni M.P. et al. Progesterone during pregnancy: endocrine-immune cross talk in mammalian species and the role of stress // Am. J. Reprod. Immunol. 2007. Vol. 58, N 3. P. 268-279.
15. Ku C.W., Allen J.C. Jr, Malhotra R., Chong H.C. et al. How can we better predict the risk of spontaneous miscarriage among women experiencing threatened miscarriage? // Gynecol. Endocrinol. 2015. Vol. 31, N 8. P. 647-651.
16. Hudic I., Stray-Pedersen B., Szekeres-Bartho J., Fatusic Z. et al. Maternal serum progesterone-induced blocking factor (PIBF) in the prediction of preterm birth // J. Reprod. Immunol. 2015. Vol. 109. P. 36-40.
17. Szekeres-Bartho J., Weill B.J., Mike G., Houssin D. et al. Progesterone receptors in lymphocytes of liver-transplanted and transfused patients // Immunol. Lett. 1989. Vol. 22. P. 259-261.
18. Сидельникова В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием : методические пособия и клинические рекомендации. М. : МЕДпресс-информ, 2011. 224 с.
19. Chaouat G. Inflammation, NK cells and implantation: friend and foe (the good, the bad and the ugly?): replacing
placental viviparity in an evolutionary perspective // J. Reprod. Immunol. 2013. Vol. 97, N 1. P. 2-13.
20. Nielsen H.S., Witvliet M.D., Steffensen R. et al. The presence of HLA-antibodies inrecurrent miscarriage patients is associated with a reduced chance of a live birth // J. Reprod. Immunol. 2010. Vol. 87, N 1-2. P. 67-73.
21. Saito S., Shima T., Nakashima A., Shiozaki A. et al. What is the role of regulatory T cells in the success of implantation and early pregnancy? // Assist. Reprod. Genet. 2007. Vol. 24. P. 379-386.
22. Somerset D.A., Zheng Y., Kilby M.D., Sansom D.M. et al. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+CD4+ regulatory T-cell subset // Immunology. 2004. Vol. 112. P. 38-43.
23. Zenclussen A.C., Gelof K., Zenclussen M.L., Ritter T. et al. Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+ CD25+ T regulatory cells prevents fetal rejection in a murine abortion model // Am. J. Pathol. 2005. Vol. 166. P. 811-822.
24. Shou Z., Xu Y., Xiao H., Zhou Q. et al. The effect of pregnancy on paternal skin allograft survival // Sci. China C. Life Sci. 2009. Vol. 52, N 11. P. 1011-1015.
25. Saito S., Sasaki Y., Sakai M. CD4+CD25+high regulatory T-cells in human pregnancy // J. Reprod. Immunol. 2005. Vol. 65, N 2. P. 111-120.
26. Somerset D.A., Zheng Y., Kilby M.D., Sansom D.M. et al. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+ CD4+ regulatory T-cell subset // Immunology. 2004. Vol. 112, N 1. P. 38-43.
27. Chaouat G. Inflammation, NK cells and implantation: friend and foe (the good, the bad and the ugly?): replacing placental viviparity in an evolutionary perspective // J. Reprod. Immunol. 2013. Vol. 97, N 1. P. 2-13.
28. Li T.C., Markis M., Tomsu M. et al. Recurrent miscarriage: aetiology, management and prognosis // Hum. Reprod. Update. 2002. Vol. 104. P. 784-788.
29. Azuma T., Takahashi T., Kunisato A., Kitamura T. et al. Human CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress NKT cell functions // Cancer Res. 2003. Vol. 63, N 15. P. 4516-4520.
