CC BY
55
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯ
УДК 612.814.1.085: 615.831.4
© М.М. Бикбов, А.Р. Халимов, Г.М. Бикбова, Э.Л. Усубов, Н.Б. Зайнуллина, 2013
М.М. Бикбов, А.Р. Халимов, Г.М. Бикбова, Э.Л. Усубов, Н.Б. Зайнуллина ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ РИБОФЛАВИНА ВО ВЛАГЕ ПЕРЕДНЕЙ КАМЕРЫ ГЛАЗА КРОЛИКА ПРИ ТРАНСЭПИТЕЛИАЛЬНОМ НАСЫЩЕНИИ РОГОВИЦЫ
ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней», г. Уфа
Изучена динамика содержания рибофлавина во влаге передней камеры глаза кролика при трансэпителиальном насыщении роговицы с использованием электрофореза и фотосенсибилизаторов на основе декстрана и хитозана. Установлено, что при электрофоретическом насыщении недеэпителизированной роговицы водным раствором рибофлавина наблюдается его более быстрое проникновение в ткани глаза кролика относительно фотосенсибилизаторов с полимерами.
Ключевые слова: рибофлавин, фотосенсибилизатор, трансэпителиальный ультрафиолетовый кросслинкинг, электрофорез, декстран, хитозан.
M.M. Bikbov, A.R. Khalimov, ОМ. Bikbova, E.L. Usubov, N.B. Zainullina DYNAMICS OF RIBOFLAVIN AMOUNT IN AQUEOUS HUMOR OF ANTERIOR CHAMBER OF RABBIT EYE AT TRANSEPITHELIAL SATURATION OF THE CORNEA
The dynamics of riboflavin amount in aqueous humor of anterior chamber of rabbit eye at transepithelial saturation of the cornea using of electrophoresis and photosensitizers based on dextran and chitosan has been studied. It was found out that at electro-phoretic saturation with aqueous solution of riboflavin of nonepithelialized cornea, it penetrates into the eye tissues of rabbits more rapidly than photosensitizers with polymers.
Key words: riboflavin, photosensitizer, transepithelial UV crosslinking, electrophoresis, dextran, chitosan.
В настоящее время во многих офтальмологических клиниках успешно применяется оригинальный способ лечения кератоэктазий-ультрафиолетовый кросслинкинг (УФ-кросслинкинг, ЦУ- сго88Ппк^), при котором укрепляющий эффект роговицы возникает посредством перекрестного связывания ее коллагеновых фибрилл за счет образования новых химических связей под действием фотосенсибилизатора и свободнорадикальных процессов, активируемых УФ-излучением. [2,4,6,9,10,12].
В качестве фотосенсибилизатора изначально использовали 0,1 % водный раствор рибофлавина, а в последние годы - 0,1% раствор рибофлавина с 20% декстраном [3].
При ультрафиолетовом облучении рибофлавина длиной волны 370 нм происходит образование активных форм кислорода, инициирующих процесс фотополимеризации коллагена роговицы [3,4].
При выполнении процедуры кросслин-кинга источник облучения размещают на расстоянии 2 см от поверхности роговицы глаза. За счет светорассеяния (принцип Колера) УФ-излучение не повреждает сетчатку, так как в глубжележащие структуры глаза, находящиеся по ходу лучей (эндотелий роговицы, хрусталик и сетчатка), поступает незначительная часть энергии излучения, недостаточная для их лучевого поражения [11].
В настоящее время исследователями по-прежнему предпринимаются попытки улучшить эффективность процедуры путем ее усовершенствования и расширения показаний.
Так, был предложен модифицированный (трансэпителиальный) метод кросслин-кинга без деэпителизации роговицы, который выполняется в два этапа: первый этап -насыщение стромы роговицы посредством использования электрофореза с раствором 0,1% рибофлавина, второй - ультрафиолетовое облучение длиной волны 370 нм с ин-стилляциями рибофлавина. Преимущество данного метода - отсутствие послеоперационного болевого синдрома, вызванного де-эпителизацией, и возможность проведения кросслинкинга у пациентов с толщиной роговицы менее 400 мкм.
Для более широкого внедрения нового трансэпителиального метода в клиническую практику необходимо проведение углубленных исследований, в частности определение динамики пенетрации рибофлавина через недеэпителизированную роговицу и внедрение различных фотосенсибилизаторов.
Цель - изучить динамику содержания рибофлавина во влаге передней камеры глаз кроликов при трансэпителиальном насыщении роговицы с использованием фотосенсибилизаторов на различной основе.
Материал и методы
Исследования выполняли в соответствии с правилами для экспериментальных и иных научных целей, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Кролики находились на обычном рационе питания в стандартных условиях вивария.
Эксперименты проведены на 30 кроликах-самцах породы шиншилла массой 2,0-2,5 кг, которые разделены на 3 группы (по 10 кроликов, 20 глаз в каждой). Изучали проницаемость трех фотосенсибилизаторов при трансэпителиальном насыщении роговицы. В 1-й группе применяли 0,1% раствор водного рибофлавина мононуклеотида, во 2-й - протектор роговицы «Декстралинк», содержащий 0,1% рибофлавин-мононуклеотид и 20% декс-тран с молекулярной массой 450-550 кЛа (рег. удостоверение №ФСР 2010/09071) [1], в 3-й -«Хитолинк», содержащий 0,1% рибофлавина-мононуклеотида и 10% хитозана (степень де-ацетилирования 94-98%, вязкость 1% раствора 30 сантиСтокс (сСт).
Для анестезиологического пособия применялся препарат «Ксилазин» 2% внутримышечно в дозе 0,2 мл/кг в сочетании с местной анестезией 0,4% раствором оксибупрока-ина («Инокаин»).
Во всех группах насыщение роговицы фотосенсибилизаторами производили посредством ванночкового электрофореза с силой тока 1,0 мА с использованием гальванизатора (ГЭ-50-2 «Поток-1», Россия) в течение 10 мин, после чего каждые 5 мин в течение 25 мин осуществляли забор влаги передней камеры (ВПК) через парацентез с помощью ин-
сулинового шприца 30Ga.
Средняя толщина роговиц глаз кроликов в исследуемых группах составила 434±22 мкм.
Определение содержания рибофлавина в образцах влаги передней камеры глаз кроликов проводили иммуноферментным методом. Учет результатов осуществляли с использованием иммуноферментного анализатора «Multiscan» при длине волны 610 нм с помощью монотестов «ID-Vit» фирмы «Immundiagnostik» (Германия).
Статистическую обработку полученных результатов производили с использованием программы Statistica 6,0.
Результаты и обсуждение
Динамика содержания рибофлавина во влаге передней камеры глаз кроликов при трансэпителиальном способе с использованием 0,1% водного раствора (1-я группа) характеризуется фазами роста и падения концентрации фотомедиатора с максимумом (404,6±16,2 мкг/мл) через 15 мин после завершения электрофореза (см. таблицу). Сопоставление этой динамической точки наблюдений 1-й группы с более низкими значениями 2- и 3-й групп, очевидно, указывает о высокой биодоступности водного раствора и его активном электрофоретическом транспорте в тканях глаза.
Изменение уровня рибофлавина в ВПК с использованием электрофореза и протектора роговицы «Декстралинк» (2-я группа) носит характер аналогичный водному раствору фотосенсибилизатора, - максимум насыщения средством «Декстралинк» наблюдается также через 15 мин (см. рисунок).
Таблица
Концентрация рибофлавина во влаге передней камеры глаз кроликов при трансэпителиальном насыщении роговицы растворами фотосенсибилизаторов, (М±т, мкг/мл)
Период наблюдения, мин Группы животных
1-я 2-я 3-я
0,1 % рибофлавин «Декстралинк» «Хитолинк»
5 33,2±3,1 100,0±6,7 55,3±4,8
10 332,8±12,6 283,1±14,6 252,55±4,7*
15 404,6±16,2 311,0±8,9* 257,5± 9,1*
20 301,2±10,8 275,0±5,1 349,9±12,6
25 123,8±10,6 218,9±6,4* 432,8±15,2*
* Различие с 1-й группой статистически значимо, р<0,05.
Полимер в составе средства «Декстра-линк» вносит свой вклад в развитие динамического эффекта в исследуемом промежутке времени. Так, во 2-й группе насыщаемость рибофлавином ВПК ниже, чем при использовании водного фотосенсибилизатора. Однако высокая вязкость раствора за счет содержания декстрана позволяет поддерживать концен-
трацию витамина В2 более продолжительное время (25 мин).
Хитозан с рибофлавином в составе «Хитолинка» (3-я группа) при трансэпителиальном насыщении роговицы имеет стабильно нарастающую динамику концентрации в ВПК, что в полной мере связано с влиянием полимера на физико-химические свойства данного раствора. Кроме того, нельзя исклю-
минимальной толщины роговицы до процедуры и концентрацией рибофлавина [2].
Добавим к этому, что сокращение времени УФ-воздействия при увеличении мощности излучения не позволяет получить аналогичную степень кросслинкинга, поскольку ткань роговицы проявляет биохимическую активность, направленную против действия свободных радикалов. При этом повышение концентрации рибофлавина в роговице обратно пропорционально степени связывания волокон коллагена [11].
По концентрации рибофлавина во влаге передней камеры глаза можно опосредованно судить о его содержании в роговице при выполнении перекрестного сшивания коллагена. Максимальное насыщение влаги передней камеры и, соответственно, роговицы рибофлавином посредством электрофореза растворами водного рибофлавина и «Декстралинка» осуществляется примерно за 15 мин, а «Хито-линка» за 25, что необходимо учитывать при проведении кросслинкинга роговичного коллагена.
Выводы
1. Электрофорез с использованием фотосенсибилизатора на полимерной основе по сравнению с его водным раствором позволяет сохранять на более продолжительное время высокую концентрацию рибофлавина во ВПК.
2. Хитозан в составе фотосенсибили-введения в его состав вспомогательных со- затора при электрофоретическом насыщении единений, в частности полимеров. роговицы способствует стабильному росту
По мнению F. Hafezi и соавт., успешное концентрации фоточувствительного рибофла-лечение методом коллагенового кросслинкин- вина во влаге передней камеры глаза кролика га определяется двумя факторами: величиной в течение 25 мин.
Сведения об авторах статьи: Бикбов Мухаррам Мухтарамович - д. м. н., профессор, директор ГБУ ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней». Адрес: 450077, г. Уфа, ул. Пушкина, 90.
Халимов Азат Рашидович - к.б.н., заведующий научно-производственным отделом ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней». Адрес: 450077, г. Уфа, ул. Пушкина, 90. Тел.: 8 (347) 272-08-52. E-mail: azrakhal@yandex.ru.
Бикбова Гузель Мухаррамовна - к.м.н., врач-офтальмолог 1-го микрохирургического отделения ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней». Адрес: 450077, г. Уфа, ул. Пушкина, 90.
Усубов Эмин Логман оглы - к.м.н., ведущий научный сотрудник отделения хирургии роговицы и хрусталика ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней». Адрес: 450077, г. Уфа, ул. Пушкина, 90.
Зайнуллина Нелли Булатовна - научный сотрудник отделения хирургии роговицы и хрусталика ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней». Адрес: 450077, г. Уфа, ул. Пушкина, 90. E-mail: NelliChka555@yandex.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бикбов, М.М. Офтальмологическое средство для кросслинкинга / А.Р.Халимов, Г.М.Бикбова // Патент РФ № 2412707. 27.02.2011.
2. Corneal collagen crosslinking with riboflavin and ultraviolet A to treat induced keratectasia after laser in situ keratomileusis / F. Hafezi [et al.] // J. Cataract&Refract. Surg. - 2007. - Vol. 33. - P. 2035-40.
3. Collagen crosslinking with ultraviolet-A and hypoosmolar riboflavin solution in thin corneas / F. Hafezi [et al.] // J. of Cataract and Refractive Surgery. - 2009. - Vol. 35, № 4. - P. 621-624.
4. Koller, T. Therapeutic cross-linking of the cornea using riboflavin/UVA. / T. Koller, T. Seiler // Klin. Monatsbl. Augenheilkd. - 2007. -Vol. 224. - Р. 700-6.
5. Pinelli, R. C3-R treatment opens new frontiers for keratoconus and corneal ectasia / R. Pinelli // - Eyeworld. - 2007. - Vol. 34. - P. 3639.
6. Seiler, T. Corneal cross-linking-induced stromal demarcation line / T. Seiler, F. Hafezi // Cornea. - 2006. - Vol. 25. - P. 1057-9.
7. Spoerl, E. Induction of cross-links in corneal tissue / E. Spoerl, M. Huhle, T. Seiler // Experimental Eye Research. - 1998. - Vol. 66, № 1. - Р. 97-103.
чать факт влияния на этот процесс электрического поля при проведении электрофореза. Отметим, что хитозан пролонгирует и усиливает действие медикаментозных средств. Кроме того, этот полимер в составе лекарственных субстанций привносит дополнительные биологические свойства (антибактериальное, иммуномодулирующее, антиокси-дантное, противовоспалительное, регенерирующее) в общую картину фармакологических эффектов препарата.
мкг/мл
-,00
500, 450,00 400,00 350,00 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00
0,1 % рибофл..
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Рис. Содержание рибофлавина во влаге передней камеры глаз кроликов при трансэпителиальном насыщении роговицы растворами фотосенсибилизаторов, мкг\мл
Анализ кинетических кривых рибофлавина во влаге передней камеры свидетельствуют о том, что для повышения или уменьшения уровня фотосенсибилизатора необязательно изменять содержание действующего вещества. Этого можно добиться посредством
8. Spoerl, E. Techniques for stiffening the cornea // E. Spoerl, T. Seiler // J. of Refractive Surgery. - 1999. -Vol. 15, № 6. - P. 711-713.
9. Spoerl, E. Increased resistance of crosslinked cornea agaist enzymatic difestion / E. Spoerl, G. Wollensak, T. Seiler // Curr. Eye Res. -2004. - Vol. 29. - P. 35-40.
10. Safety of UVA-riboflavin cross-linking of the cornea / E. Spoerl [et al.] // Cornea. - 2007. - Vol. 26. - P. 385-9.
11. Spoerl, E. Boiphysicalische Grundlagen der Kollagenvernetzung / E. Spoerl, F. Raiscup-Wolf, L.E. Pilunat // Klin. Monatsbl. Augen-heilkd. - 2008. - Vol. 225. - P. 131-137.
12. Wollensak, G. Riboflavin/ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus / G.Wollensak, E. Spoerl, T. Seiler // Am. J. Ophthalmol. - 2003. -Vol. 135. - P. 620-7.
УДК 579.22;579.262
© Н.Б. Перунова, В.Г. Туйгунова, Е.В. Иванова, Ю.З. Габидуллин, 2013
Н.Б. Перунова1, В.Г. Туйгунова2, Е.В. Иванова1, Ю.З. Габидуллин2 ИЗМЕНЕНИЕ БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ И АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ CITROBACTER FREUNDII ПОД ДЕЙСТВИЕМ МЕТАБОЛИТОВ
КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ
1 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург 2ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Уфа
Экспериментально выявлено два типа направленности биокоммуникативой активности в ассоциации бактерий с Citrobacter spp. - синергидный и антагонистический. Ассоциативная микробиота, характерная для дисбиоза, инициировала биопленкообразование (БПО) и антилизоцимную активность (АЛА) C. freundii, и, напротив, доминанты (бифидобактерии) и лактозопозитивные негемолитические эшерихии, изолированные при эубиозе, ингибировали базовые физиологические функции адаптации Citrobacter spp.
Метаболиты C. freundii, предварительно соинкубированные с культурами бифидобактерий, индуцировали у доминан-тов усиление антагонистической активности, подавляя АЛА и БПО цитробактеров. Полученные данные свидетельствуют о «распознавании» доминантами C. freundii в качестве «чужеродного» микроорганизма, что может являться одним из механизмов защитного действия нормофлоры при эубиозе.
Ключевые слова: биокоммуникация, персистенция, Citrobacter, микробиота кишечника, микробное распознавание.
N.B. Perunova, V.G. Tuygunova, E.V. Ivanova, Y.Z. Gabidullin CHANGES IN BIOFILM FORMATION AND ANTILIZOZYME ACTIVITY OFCITROBACTER FREUNDII UNDER THE INFLUENCE OF THE HUNAN GUT MICROBIOTA METABOLITES
The experiments have revealed two types of orientation of biocommunication activity in association of bacteria with Citrobacter spp. - synergistic and antagonistic ones. Associative microbiota typical for dysbiosis, stimulated biofilm formation (BFF) and anti-lysozyme activity (ALA) C. freundii, and, on the contrary, the dominant (bifidobacteria) and lac-positive non-hemolytic Escherichia, isolated at eubiosis, inhibited the basic physiological functions of the adaptation of Citrobacter spp.
Metabolites C. freundii being pre-coincubated with cultures of Bifidobacteria induced antagonistic activity in dominant gain by inhibiting the ALA and BFF of Citrobacter. The findings suggest that dominants "recognize" C. freundii as a "foreign" microorganism, which may be one of the mechanisms of the protective effect of normal flora in eubiosis.
Key words: biocommunication, persistence, Citrobacter, microbiota of the bowel, microbiota recognition.
В настоящее время имеются работы, указывающие на рост инфекций, обусловленных оппортунистическими микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae, представителями которых являются бактерии рода Citrobacter. Цитробактеры часто являются этиологической причиной гнойно-
воспалительных и токсико-септических процессов, инфекций мочеполового тракта, острых кишечных, респираторных и внутриболь-ничных инфекций. При этом выделенные штаммы, как правило, проявляют в определенной степени факторы патогенности и мультирезистентности к широко применяемым антибактериальным препаратам [1, 2].
С позиции инфекционной симбиологии популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения - конкурентные или кооперативные - при заселении различных
биотопов макроорганизма формируют специфический микросимбиоценоз, являющийся одним из векторов ассоциативного симбиоза человека [3]. Исходя из данной концепции, патогенный потенциал бактерий рода Citrobacter, при формировании симбиотиче-ских взаимосвязей с микробиотой также подвержен изменениям, что может отражаться на гомеостазе организма человека. В ряде работ отмечены различия экспрессии вирулентных и некоторых персистентных (АЛА и АИА) свойств Citrobacter spp, изолированных при моно- и ассоциированой инфекциях [4, 5].
Однако отсутствуют данные об изменении персистентных свойств (антилизоцимная активность и биопленкообразование) бактерий рода Citrobacter в ассоциации с другими видами бактерий, представителями доминантной и ассоциативной микробиоты, что и
