Динамика скорости движения планарий Dugesia tigrina, регенерирующих в условиях электромагнитного экранирования в различные сезоны года Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Физика живого, Т. 17, N0 1, 2009. С.112-118.

© Темурьянц Н.А., Демцун Н.А, Баранова М.М.

УДК591.169.1: 595.123:537.868

ДИНАМИКА СКОРОСТИ ДВИЖЕНИЯ ПЛАНАРИЙ БиСЕ81А ТЮКША, РЕГЕНЕРИРУЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ЭКРАНИРОВАНИЯ В РАЗЛИЧНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА

Темурьянц Н.А., Демцун Н.А, Баранова М.М.

Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского Поступила в редакцию 05.04.2009

На основе компьютерных технологий анализа изображения разработан способ определения скорости движения планарий. Выявлена высокая положительная корреляция между изменениями этого показателя и индексом регенерации. Показано, что при длительном электромагнитном экранировании стимулируется регенерация червей, причем скорость движения планарий возрастает больше, чем индекс регенерации. Степень этих изменений зависит от сезона года, она больше осенью, чем летом.

Ключевые слова: электромагнитное экранирование, Б^е51а tigrina, регенерация, скорость движения, сезон года.

ВВЕДЕНИЕ

Ранее нами было показано, что электромагнитное экранирование (ЭМЭ) планарий Dugesia tigrina стимулирует их регенерацию, степень стимуляции различна в летний и зимний сезоны года [1]. Эти данные были получены на основе анализа таких показателей как индекс регенерации, скорость индекса регенерации, времени появления пигментированных участков на месте будущих глаз и появления сформированных глаз. Для уточнения и расширения этих данных необходимы исследования в переходные сезоны года с использованием и других параметров

регенерации.

Регенерация планарий характеризуется не только структурными, биохимическими и т.д. перестройками, но и изменением поведенческих реакций, которые изучены совершенно

недостаточно. Адекватной характеристикой поведенческих реакций являются локомоторная активность, скорость движения. Способ

определения скорости движения у планарий не разработан. В связи с изложенным, целью работы явилось исследование изменений скорости

движения планарий Dugesia tigrina,

регенерирующих в условиях электромагнитного экранирования и сопоставление их изменений в летний и осенний сезоны года.

Задачи работы:

1) разработка способа регистрации и определение скорости движения интактных и регенерирующих планарий;

2) исследование влияния ЭМЭ на скорость движения регенерирующих планарий в летний и осенний сезоны;

3) сопоставление изменений индекса регенерации и скорости движения планарий, регенерирующих в различных условиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использована лабораторная бесполая раса планарий Dugesia tigrina, культура которой успешно культивируется в Таврическом национальном университете им. В.И. Вернадского (ТНУ). Планарии содержатся в пластиковых аквариумах объемом по пять литров в воде, представляющей собой смесь дистиллированной и водопроводной воды в пропорции 1:1. Аквариумы находятся в затемненных условиях, температура воды в них поддерживается от 19-21°. Кормление животных осуществляется один раз в неделю личинками двукрылых (мотылем). Кормление прекращается за семь дней до эксперимента. Условия содержания планарий подробно описаны нами ранее [1], они полностью соответствуют таковым в Институте биофизики клетки РАН, откуда животные были завезены в ТНУ.

Для изучения регенерации планарий и скорости их движения применялась их прижизненная морфометрия, использующая компьютерные технологии анализа изображений.

Стандартные изображения регенерирующих планарий получались на установке, подробно описанной ранее [2]. С ее помощью возможно вычисление основных геометрических

характеристик тела планарий, бластемы, и в

частности индекса регенерации К=8]/82, где 81 -площадь бластемы, 82 - площадь всего тела регенерата в данный момент времени. Этот показатель, предложенный И.М. Шейман [3], широко используется для изучения регенерации планарий в различных условиях. В настоящей работе проводилось вычисление этого индекса.

Для разработки способа определения скорости движения планарий важное значение имеет их способность к достаточно длительному однонаправленному движению в горизонтальной плоскости, осуществляемому за счет мерцания ресничек. Такое движение преобладает у животных небольших размеров. Движение, осуществляемое за счет мускулатуры, имеет другой характер и характерно для более крупных животных [3].

[Л

Поэтому для эксперимента отбирали червей, длина которых составила ~ 10 ± 1 мм.

Для определения скорости движения червей видеоизображения движущихся в воде планарий регистрировались с частотой 30 кадров в одну секунду. Скорость движения планарий вычислялась отношением пройденного ею пути ко времени в одну секунду. Путь измерялся наложением двух участков одного видеоряда с соответствующей разницей во времени. Контрастирование проводилось при помощи стандартной операции «вычитания» для двух изображений (рис. 1).

Было определено, что скорость движения интактных планарий колеблется от 1,83 мм/сек до 2,15 мм/сек (1,99±0,16 мм/сек).

■ Ии

£ИЗ В О - !' п с з. а -и ьс -н * В -4.. ■ ив Н д в_Й

\

-

\

1« о*»х " -1 ейг 131 ** 1>*7> С

1 1.1Э.* *- 21

г ;

С - ‘ ЧмИгу

• !•]•]•« И Ч

1 •- 1..1 -И А|

г мм: *11 и* I «г I

• м_о> ** 1 л* мге

1 |

-

I •*» I I I

и» <■«:« * ямм.^опж;

*1мш ||»аи« Ш

Рис. 1. Пример вычисления скорости движения планарии. (А, Б - участки видеоряда с разницей в одну секунду; В -результат наложения этих видеорядов при помощи покадрового вычитания изображений).

Для реализации поставленных задач было проведено две серии экспериментов первая серия в летнее время (июнь 2008 г.), вторая - в осеннее (октябрь-ноябрь 2008 г.).

Регенерация вызывалась ампутацией 1/5 части головного конца тела планарий, содержащей головной ганглий, выше фаринкса (разрез Мария Антуанетта). Декапитация проводилась под бинокулярным микроскопом глазным скальпелем в нестерильных условиях.

В каждой серии экспериментов декапитированные планарии делились на две

группы по 30 особей каждая и помещались в стеклянные стаканы, содержащие по 50 мл воды.

Животные первой группы служили биологическим контролем, то есть регенерация у них протекала без каких-либо дополнительных воздействий.

Вторую группу содержали в экранирующей камере по 23 часа в сутки в течение 16 дней. Ежедневно в течение одного часа (всегда в одно и тоже время с 10 до 11 час.) проводили контроль регенерационных процессов, измерение температуры воды и т. д.

Для животных всех групп в течении всего эксперимента поддерживался одинаковый режим освещенности, температуры воды.

Устройство экранирующей камеры было описано нами ранее [1].

Фиксация изображений осуществлялась у каждого животного ежедневно в течении 16 дней в одно и то же время суток.

Обработку экспериментальных данных проводили с помощью непараметрических методов. Вычислялась медиана (М), интерквантильный интервал между 25м и 75м процентилями, включающий 50% значений признака в выборке. Для изучения взаимосвязи изученных показателей использовали корреляционный анализ по Спирмену. Оценку достоверности наблюдаемых изменений проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни и Вилкоксона.

Расчеты и графическое оформление полученных в работе данных проводились с использованием программы Microsoft Excell, программного пакета «STATISTICA - 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что регенерация интактных планарий в летний и осенний сезоны года имеет определенные различия.

Осенью индекс регенерации интактных животных со вторых по 13 сутки эксперимента возрастал от 0,0105 до 0,1072 усл.ед. В динамике этого показателя отмечены периоды, когда он не изменялся. Так, на пятые и 11 сутки эксперимента данный показатель не возрастал относительно значений предыдущих четвертых и десятых суток соответственно (табл.1., рис. 2А). С 13 суток наблюдения рост индекса регенерации остановился. Кроме того к этому сроку наблюдения зафиксировано полное формирование глаз и «ушей» у всех животных данной группы, а также нулевые значения скорости индекса регенерации. Таким образом, регенерация интактных планарий осенью продолжается 13 суток.

Таблица 1.

Динамика индекса регенерации (усл.ед) и скорости движения (мм/сек.) интактных планарий в осенней и

Сутки эксперимента Исследуемые показатели

Индекс регенерации Скорость движения

Сезоны года

Осень (1) Лето (2) ь н) 8 a Ос Лето (4)

2 0,0105 0,0214 Pu<0,001 1,0336 1,0382

3 0,0162 0,0338 Pi,2<0,001 0,9621 1,2216 P3,4<0,05

4 0,0321 0,0514 P1,2<0,001 0,9658 1,4683 P3,4<0,001

5 0,0341 0,0636 P1,2<0,001 1,0256 1,4249 P3,4<0,001

6 0,0491 0,0736 P1,2<0,001 1,2063 1,5000 P34<0,05

7 0,0541 0,0775 P1,2<0,001 1,3769 1,3268

8 0,0594 0,0938 P1,2<0,001 1,3866 1,3730

9 0,0731 0,1117 P1,2<0,001 1,4634 1,6063

10 0,0738 0,1162 P1,2<0,001 1,4635 1,9791 P3,4<0,001

11 0,0873 0,1181 P12<0,001 1,6513 2,0150 P3,4<0,001

12 0,0881 0,1180 P1,2<0,001 1,8294 2,0850 P34<0,05

13 0,0984 0,1162 P1,2<0,001 1,6374 2,1674 P3,4<0,001

14 0,1088 0,1163 P1,2<0,001 1,9217 2,2971 P34<0,05

15 0,1072 0,1162 P1,2<0,001 1,9320 2,3471 P34<0,05

16 0,1074 0,1162 P1,2<0,001 2,0341 2,2971

Вместе с возрастанием индекса регенерации планарий контрольной группы прогрессивно нарастала и скорость их движения (табл.1, рис 2Б). Со вторых по десятые сутки она увеличивалась в 1,4 раза, а с десятых по 12 сутки имело место

возрастание этого показателя на 25% относительно десятых суток. В эти сроки значения данного показателя достигли 1,8 мм/сек, однако к 13 суткам он снизился на 10,5%. Своего максимального значения скорость движения животных интактной

группы достигала к 14 суткам эксперимента, когда она составила 1,9 мм/сек и практически не изменялась в последующие дни наблюдения. Эти значения соответствуют скорости движения интактных планарий, измеренной до отсечения головы.

В летней серии экспериментов индекс регенерации интактных животных был во все сроки наблюдения выше таковых осенней серии. Так на вторые сутки эксперимента он был выше в два раза (р<0,05), а с третьих суток значения индекса регенерации в различные сутки летом отличались от таковых осенью на 26 - 52% (р<0,05) (рис. 4А, табл.1.).

Со вторых по шестые сутки индекс регенерации в летней серии сутки возрастает в 2,5 раза, а в последующие седьмые сутки роста данного показателя не зафиксировано относительно предыдущих суток наблюдения (табл.1, рис 4Б). В последующем рост индекса регенерации возобновился и своего максимального значения достиг к 11 суткам (0,1181 усл.ед). Начиная с 11-х суток индекс регенерации не изменялся, что может свидетельствовать об остановке роста бластемы. Таким образом, летом регенерация интактных планарий протекает быстрее (11 суток).

Скорость движения интактных планарий летней серии экспериментов нарастала со вторых по 14 сутки эксперимента в 2,22 раза, т.е. в 1,19 раза более значительно, чем осенью (табл. 1). Однако, на седьмые сутки отмечено падение данного показателя относительно предыдущих шестых суток на 11%. Во все сроки, кроме седьмых суток, скорость движения планарий была выше таковой осенней серии на 9-52% (р<0,05).

Скорость движения планарий в обоих сериях экспериментов стабилизируется позже, чем индекс регенерации, что может свидетельствовать о том, что совершенствование функциональных возможностей регенерирующих планарий продолжается и после остановки роста бластемы.

Прогрессирующее возрастание скорости движения при регенерации головного конца планарий может быть связано с несколькими причинами, как-то: развитием головного мозга, аппарата движения, т. е ресничек, а так же усовершенствованием сенсорных систем.

Корреляционный анализ выявил высокий коэффициент корреляции между скоростью движения и индексом регенерации в обоих сериях эксперимента. Осенью значение коэффициента корреляции равно 0,9582 (р<0,001), летом - 0,9293 (р<0,001). На основании этих данных, можно утверждать, что динамика скорости движения планарий адекватно характеризует процесс регенерации планарий.

« рвмл я Ы гадзагл |ст«0

I мш каС тс дм * и а (с^т* л)

Рис. 2. Динамика индекса регенерации (А) и скорости движения (Б) планарий контрольной группы и группы животных подвергнутых длительному

электромагнитному экранированию в осенней серии экспериментов.

Таким образом, летом зафиксированы более высокие значения индекса регенерации и скорости движения интактных планарий, чем осенью. Полное формирование головы у животных летом происходило на двое суток раньше, чем осенью, т.е летом регенерация планарий протекает быстрее. Сравнивая полученные данные с результатами исследования в зимний период следует отметить, что зимой индексы регенерации еще ниже, чем осенью [1].

Длительное электромагнитное экранирование стимулирует регенерацию планарий (рис. 2А). Так, у животных, находившихся в экранирующей камере по 23 часа в сутки, осенью начиная с третьих суток эксперимента индекс регенерации был выше относительно такового контрольной группы. Максимальные различия индексов регенерации были зафиксированы на шестые сутки эксперимента, когда они различались на 29% (р<0,01) , в остальные сроки эти различия были

менее значительными и составили 4 - 18%. С 12-х суток рост данного показателя прекратился. Таким образом, продолжительность регенерации,

протекающей в условиях длительного экранирования, осенью сокращалась на одни сутки по сравнению с контрольной группой животных (рис 2А). В динамике индекса регенерации планарий, подвергавшихся длительному

электромагнитному экранированию, более выражена периодическая составляющая (рис 3).

Рис. 3. Динамика скорости движения планарий у животных, подвергнутых длительному

электромагнитному экранированию в процентах относительно контрольных значений в различные сезоны года.

В летней серии экспериментов значения индекса регенерации планарий, подвергнутых длительному экранированию возрастали с 0,0245 усл.ед до 1,1287 усл.ед. Так же как и осенью была отмечена стимуляция регенераторных процессов планарий данной группы относительно интактных животных. Однако, летом это возрастание было выражено гораздо меньше: только на четвертые, седьмые и восьмые сутки индекс регенерации был достоверно на 18, 20 и 21% соответственно выше контрольных данных, в другие сроки наблюдалась лишь тенденция к его возрастанию (рис. 1). Однако, летом значения индекса регенерации на вторые -четвертые сутки у животных этой группы была выше таковых осенней серии в 2 - 2,5 раза, а начиная с пятых суток эксперимента данные различия составили 17 - 65 % (рис.4А), и эти различия нарастали с увеличением сроков наблюдения.

Скорость движения планарий, регенерирующих в условиях длительного электромагнитного экранирования летом, возрастала уже на третьи сутки эксперимента на 43% (р<0,01) и на четвертые - девятые сутки превышала данные контрольной группы ~ 20% (р<0,01). Начиная с десятых суток этот показатель в условиях длительного электромагнитного экранирование изменялась (рис. 3, 4Б). Таким образом, летом скорость

движения возрастает раньше и значительней, чем осенью, но это превышение данных контрольной группы отличается в более короткий период времени (девять суток), чем осенью (11 суток).

Рис. 4. Динамика индекса регенерации и скорости движения планарий контрольной группы и группы животных, подвергнутых длительному

электромагнитному экранированию в летней серии экспериментов.

Продолжительность регенерации в условиях длительного электромагнитного экранирования летом сокращается на одни сутки.

Коэффициент корреляции индекса регенерации и скорости движения животных данной группы незначительно ниже такового остальных групп (г = 0,7473, р<0,01).

Таким образом, в условиях длительного электромагнитного экранирования обнаружена стимуляция регенерации планарий, о чем свидетельствует возрастание индекса регенерации и скорости движения по сравнению с интактными животными. Однако динамика и выраженность этого процесса зависит от сезона года. Летом скорость движения и индекс регенерации возрастает раньше, чем осенью (скорость движения на пять суток, индекс регенерации на трое суток) и в более короткий период превышает данные контрольной группы, чем осенью.

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что ЭМЭ

стимулирует регенерацию планарий. Эти данные согласуются с результатами исследований, в которых обнаружено благоприятное влияние гипомагнитного поля на регенерацию костей, регенерацию головастиков [5], ускоряет пролиферацию клеток [6, 7].

Степень стимуляции регенерации планарий при ЭМЭ зависит от исходного уровня регенерации, определяемого, в частности, сезоном года. Летом регенерация червей протекает более интенсивно, чем осенью, о чем свидетельствует более высокие значения индексов регенерации и скорости движения планарий. Согласно закону начальных значений при более низком уровне регенерации отмеченном осенью, следует ожидать и более выраженной стимуляции в ответ на действие раздражителей различной природы. Действительно, в проведенных исследованиях обнаружена такая зависимость. Зимой интенсивность регенераторных процессов ниже, чем осенью и особенно летом [1]. И поэтому стимуляция регенераторных процессов при ЭМЭ выражена еще более ярко. Таким образом, регенерация планарий и их реакция на ЭМЭ обнаруживает ярко выраженный сезонный ритм, являющийся важным компонентом временной организации биологических систем [8, 9,10].

Обращает на себя внимание тот факт, что скорость движения планарий при экранировании возрастает гораздо больше, чем индекс регенерации. Так, осенью наблюдается возрастание индекса регенерации и скорости движения планарий при экранировании в 1, 2 и 1,4 раза соответственно больше чем летом.

На основании этих данных можно заключить, что скорость движения является более чувствительным показателем, характеризующим реакцию регенерирующих планарий на действие ЭМЭ, чем индекс и скорость индекса регенерации.

Учитывая то, что движение планарий, анализируемое нами, реализуется за счет мерцания ресничек, можно предположить, что ЭМЭ изменяет их функциональную активность. Это

предположение подтверждается данными экспериментов, проведенных как in vitro, так и in vivo. Так, было обнаружено ингибирование цилиарного аппарата эпендимоцитов у новорожденных крыс в условиях гипомагнитного поля [11]. В более поздних работах описано возрастание скорости движения и жизнеспособности человеческих сперматозоидов при их культивировании в нулевом магнитом поле [12].

Недавно было обнаружено, что в гипомагнитном поле изменяется структура тубулина - основного белка микротрубочек,

формирующих реснички и обеспечивающих их движение [13].

Таким образом, при электромагнитном экранировании скорость движения

регенерирующих планарий возрастает. Возможно, это связано с изменением функционального состояния ресничек. Полученные данные значительно расширяют представления о возможных механизмах действия ослабленных магнитных полей.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ определения скорости движения планарий.

2. Между индексом регенерации и скоростью

движения регенерирующих планарий существует высокая положительная

корреляционная связь.

3. Скорость движения планарий, как и индекс их регенерации, в условиях электромагнитного экранирования возрастают.

4. Скорость движения планарий при электромагнитном экранировании возрастает в 1,2 - 1,5 раза больше, чем индекс регенерации.

5. Стимуляция регенерации планарий при ЭМЭ зависит от сезона года, она более выражена осенью, чем летом.

Литература

1. Темурьянц Н.А., Демцун Н.А., Мартынюк В.С. Осебенности регенерации планарий Dugesia tigrina при их электромагнитном экранировании в различные сезоны года // Физика живого. - 2008. -Т.16. -№2.- С. 85-91.

2. Вишневский В.Г., Махонина М.М., Демцун Н.А, Темурьянц Н.А. Установка для прижизненной морфометрии регенерации планарий // Ученые записки Таврического национального университета им.В.И. Вернадского. Серия «Биология. Химия» -2007. - Т.20 (59). -№4. - С.18-21

3. Тирас Х.П., Сахарова Н.Ю. Прижизненная морфометрия планарий // Онтогенез - 1984. -Т.15 (1). - С. 42-48

4. Шмидт-Ниельсен К. Физиология животных: приспособление и среда. - М: «Мир», 1982. -C.555 - 643

5. Нагорский П.М. Начальный этап развития гелиобиологии в России (штрихи к портрету П.М. Нагорского) // Сборник избранных трудов V Международного конгресса „Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии” Санкт-Петербург, Россия, (29 июня -3 июля 2009 г.) СПБ 2009. -С. 170-180.

6. Eremenko T., Esposito C., Pasquarelli A., Pasquali E., Volpe P. Ctll-cycle kinetics of Friend eiythroleukemia cells in a magnetically shielded room and a low-

frequency/low-intensity magnetic field // //

Bioelectromagnetics. - 1997.- Vol. 18.- P.58-66.

7. Eremenko T., Esposito C., Pasquali E., Volpe P. Incubator for cell cultures growing in a shelded roomwithout electrromagnetic fields or in a system producing electromagnetic fields, in Indian National Research Couneil Paterts // CNR Press, Rome. - 1993. -Р. 60-61. - f.n.A000848. - P. 1-14

8. Ашофф Ю. Биологические ритмы. - М: «Мир», Т.1. 1984. - 131 с.

9. Голиков А.П. Сезонные ритмы в физиологии и патологии. - М: «Медицина», 1973. - 156 с.

10. Владимирский Б.М., Сидякин В.Г., Темурьянц Н.А., Макеев В.Б., Самохвалов В.П. Космос и биологические ритмы. - Симферополь, 1995. - 206 с.

11. Sandodze V., Swnidze I.K., Didimona E.V. Effect of

hipomagnetic fields on motility of the ependimal cells in vivo // Radiats Biol.Radioecol.- 1995. -

Vol. 1. - P. 19-22.

12. Truta Z., Neamtu S., Morariu V. Zero magnetic field influence on in vitro human spermatozoa cells behavior // Romanian J. Biophys. - 2005. - Vol. 15. - P. 73-79.

13. Wang D.L., Wang X.S., Xigo R., Liu Y. Tubulin assembly is disordored in a hipogeomagnetic field // Biochem Biophys Res Commun. - 2008. - Nov. 14.376 (2) - P. 363-368

ДИНАМІКА ШВИДКОСТІ РУХУ ПЛАНАРІІ ВиаЕ8!Л ТЮМШ, РЕГЕНЕРУЮЧИХ В УМОВАХ ЕЛЕКРОМАГНИТНОГО ЕКРАНУВАННЯ У РІЗНІ ПОРИ РОКУ

Темур’янц Н.А,. Демцун Н.О., Баранова М.М.

Розроблена методика визначення швидкості руху планарій. Показано, що швидкість руху як і індекс регенерації в умовах електромагнітного екранування зростає. При тривалому електромагнітному екрануванні швидкість руху зростає більше, ніж індекс регенерації, ступень цих змін залежить від пори року, вона більша восені ніж в літку. Виявлена висока позитивна кореляція між даними показниками.

Ключові слова: електромагнітне екранування, Dugesia tigrina, регенерація, швидкість руху.

МOVEMENT DYNAMICS OF PLAN ARIA DUGESIA TIGRINA REGENERATING UNDER CONDITIONS OF ELECTROMAGNATIC SHIELDING IN DIFFERENT SEASONS OF THE YEAR

Temuryants N.A., Demtsun, N.A., Baranova M.M.

Based upon the techniques of computer image analysis we have developed a method of calculating the velocity of planaria movement. Correlation analysis revealed a strong positive correlation between these parameters in the intact animals. It was found that electromagnetic shielding stimulates regenerative processes, which is supported by the increase of the regeneration index and rate of increase of regeneration index, as well as by the movement velocity. However, it is worth noting the fact that under shielded conditions movement velocity increases to the extent greater than an increase of the regeneration index. The extent of these differences depends on the season, it is larger in autumn than in summer.

Key words: electromagnetic shielding, Dugesia tigrina, regeneration, movement velocity.