CC BY
13УДК:616.72-002.77-053.2+341.735-616.8-009.1-085.851.8
Е.М. Соболева, Н.Н. Каладзе
ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ, СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ИЗМЕНЕНИЯ В СИСТЕМЕ RANKL/OPG У БОЛЬНЫХ ЮВЕНИЛЬНЫМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ ПОД ВЛИЯНИЕМ САНАТОРНО-КУРОРТНОГО
ЛЕЧЕНИЯ
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, г. Симферополь, Россия
РЕЗЮМЕ
Цель. Изучить состояние и динамику цитокинового статуса, маркеров стволовых клеток и показателей системы RANKL/OPG у больных ювенильным ревматоидным артритом на санаторно-курортном этапе реабилитации.
Пациенты и методы. На санаторно-курортном этапе обследовано 30 больных ювенильным ревматоидным артритом. Контрольную группу (КГ) составили 10 практически здоровых сверстников. Определение количественной концентрации в сыворотке крови показателей цитокинового статуса (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10), RANKL и остеопротегерина проводили методом «двухступенчатого» иммуноферментного анализа (ELISA). Исследование маркера стволовых клеток СД34, проводилось методом постановки непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции. Полученные данные обрабатывались методом математической статистики с использованием сертифицированного компьютерного пакета обработки данных «STATISTICA-6».
Результаты. Выявлено повышение концентрации как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов, увеличение в системном кровотоке числа стволовых клеток (CD34). Снижение противовоспалительного потенциала ассоциировалось с более высокой активностью заболевания и степенью функциональной недостаточности. Изменения в системе RANKL/OPG свидетельствовали о снижении интенсивности ремоделирования костной ткани, с превалированием процесса костной резорбции.
Заключение. Выявлено положительное влияние санаторно-курортного лечения на динамику исследуемых параметров, однако незначительная выраженность данных изменений диктует необходимость пролонгирования длительности реабилитации и модификации стандартных комплексов санаторно-курортного лечения. Ключевые слова: ювенильный ревматоидный артрит, дети, цитокины, санаторно-курортное лечение.
SUMMARY
The objective. To study status and dynamics of the cytokines, stem cell markers and indicators of RANKL / OPG in patients with juvenile rheumatoid arthritis at a sanatorium stage of rehabilitation.
Patients and methods. At the sanatorium stage examined 30 patients with juvenile rheumatoid arthritis. The control group (CG) consisted of 10 healthy children. Quantitative determination of serum concentrations of the cytokine status indicators (TNF-а, IL-1, IL-6, IL-4, IL-10), and osteoprotegerin/ RANKL was performed by the "two-step" linked immunosorbent assay (ELISA). The study of stem cell marker CD34, was conducted by setting the indirect immunofluorescence reaction surface. The data were processed by mathematical statistics using certified computer packet processing «STATISTICA-6."
Results. Revealed increasing concentrations of both proinflammatory and anti-inflammatory cytokines, an increase in the systemic circulation of stem cells (CD34). Reducing anti-inflammatory potential associated with higher disease activity and the degree of functional impairment. Changes in the RANKL / OPG system showed decrease in the intensity of the remodeling of bone tissue, with a predominance of bone resorption.
Conclusion. A positive effect of spa treatment on the dynamics of the studied parameters it was found, but a small expression of these changes calls for prolonging the duration of the rehabilitation and modification of the standard range of spa treatments.. Key words: juvenile rheumatoid arthritis, children, cytokines, sanatorium treatment.
Патогенез ювенильного ревматоидного артрита (ЮРА) до сих пор остается одной из наиболее сложных и интенсивно изучаемых проблем. Учитывая, что ЮРА является потенциально инвалиди-зирующим заболеванием, в основном по состоянию опорно-двигательного аппарата, дальнейшее изучение факторов, влияющих на процессы костного ремоделирования, является актуальной задачей педиатрической ревматологии.
Причины нарушений костного метаболизма при ЮРА многочисленны и до конца не установлены. Однако в основе развития воспалительного процесса при ЮРА лежат механизмы, связанные с дисбалансом образования воспалительных и противовоспалительных цитокинов. Костное ремоде-лирование - сложно регулируемый процесс, основанный на взаимодействии двух клеточных линий: остеобластов, обеспечивающих костеобразование, и остеокластов, разрушающих костную ткань [1].
Остеобласт - мононуклеарная клетка, обеспечивающая процесс остеогенеза, характеризуется развитыми субклеточными структурами, отвечающими за биосинтетические процессы, и оби-
лием митохондрий. Предшественницей данного вида клеток является мезенхимальная стволовая клетка. В последующем остеобласт трансформируется в остеоцит.
Остеокласт - гигантская многоядерная клетка, осуществляющая резорбцию, т.е. рассасывание костной ткани, действуя только на минерализованную кость. Данные клетки отличаются высокой концентрацией лизосом, содержащих набор кислых гидролаз, участвующих в расщеплении макромолекул остеоида, характеризуются высокой активностью Н+-АТФ-азы, карбоангидразы, а также способностью выделять в среду изофермент кислой фосфатазы, не ингибирующейся при действии тартрата. Предшественницей остекластов является гемопоэтическая стволовая клетка (СД 34).
В 1990-х годах идентифицирована молекулярная триада, которая регулирует костное ремоделирова-ние: активатор рецептора нуклеарного фактора капа-Р лиганда (ИЛККЬ)/активатор рецептора ци-токиновой системы нуклеарного фактора (ИЛКК)/остеопротегерин (ОРО). Данной системе
отводится ключевую роль в формировании, диф-ференцировке и активности остеокластов, обеспечении баланса между процессами деминерализации и реминерализации костной ткани [2].
RANKL-гликопротеин, который продуцируется клетками остеобластного ряда и активированными Т-лимфоцитами, является основным стимулом для созревания остекластов. RANKL, экспрессирован-ный на поверхности остеобластов, связывается с RANK.
RANK - рецептор, расположенный на плазматической мембране предшественников остеокластов. Он, приводя к внутриклеточным каскадным механизмам, воздействует на ядерный фактор каппа-B (NF-kB). NF-kB с помощью рецептора TRAF 6 поступает из цитоплазмы в ядро и повышает экспрессию протеина NFATd, являющийся специфическим триггером, запускающим процесс транскрипции внутриклеточных генов, формирующих процесс остекластогенеза [3,4]. Остеобласты и стволовые мезенхимальные клетки костного мозга одновременно синтезируют макрофагально-колонийстимулирующий фактор (M-CSF), который, связываясь со своим высоко аффинным трансмембранным рецептором (c-fms), активирует внутриклеточную тирозинкиназу, также стимулирующую процесс пролиферации и дифференциации клеток-предшественниц остеокластов [5].
OPG - остеопротегерин - растворимый рецептор для RANKL, синтезируется клетками остеобласт-ного фенотипа, а также ß-лимфоцитами, клетками стромы и эндотелия сосудов. OPG является блока-тором взаимодействия RANKL с RANK и, как следствие, угнетает формирование остеокластов и резорбцию костной ткани [4,5].
Уровень основного провоспалительного цитокина ФНО-а составил 74,73±3,7 пг/мл (в группе контроля 2,28±0,72 пг/мл), уровень ИЛ-1 составил 12,43±1,81 пг/мл (в группе контроля 4,26±1,02 пг/мл), а уровень ИЛ-6 - 16,76±2,39 пг/мл (в группе контроля 5,45±1,36 пг/мл). Содержание противовоспалительных цитокинов также было достоверно выше чем у здоровых сверстников. Так уровень ИЛ-10 составил 20,87±6,71 пг/мл (в группе контроля 9,12±2,58 пг/мл), а содержание ИЛ-4 составило 50,1±4,8 пг/мл (в группе контроля 6,66±2,16 пг/мл) .
Внутрисистемный корреляционный анализ, выявил следующие корреляционные пары: ФНО-а -ИЛ-1 (г=0,43; р<0,05); ИЛ-1-ИЛ-6 (г=0,61; р<0,05).
Цель исследования - изучить состояние и динамику цитокинового статуса, маркеров стволовых клеток и показателей системы RANKL/OPG у больных ювенильным ревматоидным артритом на санаторно-курортном этапе реабилитации.
Материалы и методы.
Исследования проводились на базе ГУДССКС «Здравница» (г. Евпатория). Было обследовано 30 больных ЮРА, в возрасте от 7 до 16 лет (средний возраст 12,30 + 0,22). Суставно-висцеральную форму заболевания диагностировали у 6 детей, преимущественно суставную — у 24 больных. На период обследования у 6 пациентов преобладала умеренная степень активности процесса, у 16 -минимальная и 8 детей находились в стадии ремиссии. По длительности заболевания больные распределились следующим образом: у 12 детей стаж болезни составил от 1 до 3 лет, у 8 — от 3 до 6 лет и у 10 — более 6 лет.
Контрольную группу (КГ) составили 10 практически здоровых сверстников.
Определение количественной концентрации в сыворотке крови показателей цитокинового статуса (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10), RANKL и остеопротегерина проводили методом «двухступенчатого» иммуноферментного анализа (ELISA). Использовались следующие тест-систем: остепротегерин («eBioscience», Австрия), RANKL («Biomedica», Германия), интерлейкины ("Вектор-Бест", Россия).
Исследование маркера стволовых клеток СД34, проводилось методом постановки непрямой реакции поверхностной иммунофлуорес-ценции (РИФ) с моноклональными антителами. Использовались реагенты (НПК «Препарат», Нижний Новгород, Россия).
Полученные данные обрабатывались методом математической статистики с использованием сертифицированного компьютерного пакета обработки данных «STATISTICA-6». Проверка гипотез о равенстве двух средних производилась с использованием непараметрических методов статистики. Для оценки степени взаимосвязей проводился корреляционный анализ с вычислением парных коэффициентов корреляции (r) Спирмена.
Полученные результаты.
Проведенное нами исследование показало, что у пациентов с ЮРА значения как провоспалитель-ных (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6), так и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов достоверно (р<0,01) превышают показатели группы контроля (табл.1).
Согласно литературным данным [6], провоспали-тельные цитокины ИЛ-1 , ИЛ-6 и ФНО-а тесно взаимосвязаны по своим функциям и эффектам. Известно, что ИЛ-1 активирует воспалительный процесс посредством различных механизмов, в том числе за счет повышения синтеза ИЛ-6. Интерлей-кин-6 оказывает плейотропное действие и запускает системное воспаление (стимулирует в печени синтез белков острой фазы воспаления), влияя на ге-мопоэз (приводит к развитию тромбоцитоза и анемии) и многие типы клеток иммунной системы.
В отношении противовоспалительного потенциала была выявлена достоверная прямая корреляционная связь средней силы (г=0,59; р<0,05)
Динамика исследуемых показателей у больных ЮРА в процессе санаторно-курортного лечения
Показатели Здоровые дети (n=10) Дети с ЮРА (до лечения) (n=40) Р2-1 Дети с ЮРА (после лечения) (n=40) Р3-1 Р2-3
1 2 3
ИЛ-1 (пг/мл) 4,26±1,02 12,43 ± 1,81 р<0,01 8,02 ± 1,34 р>0,05 р<0,05
ИЛ-6 (пг/мл) 5,45±1,36 16,76 ± 2,39 р<0,01 16,38 ± 6,18 р<0,01 р>0,05
ИЛ-4 (пг/мл) 6,66±2,16 50,10 ± 4,80 р<0,01 31,95 ± 4,22 р<0,01 р>0,05
ИЛ-10 (пг/мл) 9,12±2,58 20,87 ± 6,71 р<0,01 28,68 ± 9,29 р<0,01 р>0,05
ФНО-а(пг/мл) 2,28±0,72 74,73 ± 3,70 р<0,01 61,22 ± 4,41 р<0,01 р<0,05
СД34 (%) 5,90±0,43 9,14±0,44 р<0,01 8,76±0,28 р<0,05 р>0,05
RANKL (нг/мл) 0,31± 0,06 0,28 ± 0,05 р>0,05 0,35 ± 0,09 р>0,05 р>0,05
OPG (нг/мл) 10,65 ± 2,34 7,69 ± 2,46 р>0,05 8,97 ± 2,06 р>0,05 р>0,05
OPG/ RANKL 34,35± 2,13 27,46± 1,26 р<0,05 25,63± 1,08 р>0,05 р<0,05
между уровнями ИЛ-4 и ИЛ-10. Так же были выявлены корреляции между степенью активности заболевания и содержанием ИЛ-4 (г=-0,46; р<0,05), уровнем ИЛ-10 и проявлениями функциональной недостаточности (г=-0,43; р<0,05), что подтверждает факт снижения противовоспалительного потенциала, ассоциированного с увеличением степени активности заболевания и, как следствие, прогрессированием функциональной недостаточности у пациентов данной группы.
Ремоделирование протекает при непосредственном участии клеточного компонента костной ткани и начинается с инициации мобилизации предшественников остеокластов. Клетка-родоначальница остеокластов — колониеобразующая единица для гранулоцитов и моноцитов (СБИ-ОМ), образующаяся из гемопоэтической стволовой клетки (общий маркер стволовых гемопоэтических клеток -СД34) [7].
Гемопоэтические столовые клетки (СБ 34) являются предшественниками Т-лимфоцитов, про-дуцируясь в костном мозге, они, под воздействием различных стимулов, поступают в тимус и дают начало развитию субпопуляций Т-лимфоцитов.
В процессе обследования, был выявлен достоверно (р<0,01) более высокий уровень СБ34, по сравнению с КГ. Данная тенденция являлась устойчивой и не зависела от пола, формы, активности и длительности заболевания. Однако, необходимо отметить, что повышение активности воспалительного процесса сопровождалось максимальным увеличением количества стволовых клеток крови. Так, наиболее высокие показатели (практически в 2 раза (5,90±0,43%) выше показателей здоровых детей) отмечались при 1 (9,16±0,38%) и 2 (11,12±0,24%) степенях активности. Более низкие цифры СБ34 отмечались при 0 (8,85±0,73%) степени активности.
Вероятно, данный факт связан с повышенной продукцией провоспалительных цитокинов, определяющих миграцию стволовых клеток в тимус. Данный факт может быть обусловлен избыточной продукцией и поступлением стволовых клеток в системный кровоток, под воздействием различных факторов, как гормональной, так и цитокиновой природы. В свою очередь, имеет место нарушение хоуминга данной субпопуляции в тимус и костный мозг [8]. Это может приводить к накоплению в системном кровотоке малодифференцированных клеток, способных приобретать аутоантигенные свойства, тем самым провоцируя и поддерживая аутоиммунный процесс, имеющий место при ЮРА- с одной стороны. С другой стороны - увеличение в системном кровотоке числа стволовых клеток, являющихся предшественниками различных клеток, в том числе и остеокластов, может способствовать как остеокластогенезу, так и может быть рассмотрено как косвенный признак снижения хоуминга предшественников остеокластов в костный мозг, и, следовательно, дисбаланса между остеобластами и остеокластами.
До начала санаторно-курортного лечения у больных ЮРА были выявлены более низкие значения ИЛККЬ и остеопротегерина, а также, уменьшение соотношения ОРО / ЯЛККЬ достоверно (р<0,05) отличающееся от показателей КГ. Так если у здо-
ровых детей соотношения ОРО / ЯЛККЬ составило 34,35± 2,13, то у больных ЮРА оно был достоверно (р<0,05) ниже (27,46± 1,26), что свидетельствует об усиление костной резорбции при данном заболевании.
Межсистемный корреляционный анализ, выявил у пациентов с ЮРА достоверную прямую корреляционную связь, между активностью воспалительного процесса и ИЛЖЬ (г=0,34; р<0,05).
Проведенное санаторно-курортное лечение приводило к достоверному снижению таких показателей как ФНО-а, ИЛ-1 (р<0,05), отражающих состояние воспалительной активности и росту противовоспалительного потенциала в основном за счет ИЛ-10, который участвует в регуляции активности ТЬ-клеток за счет подавления синтеза и секреции провоспалительных цитокинов ТЫ-лимфоцитами, активированными моноцитами и КК-клетками. При этом, практически не изменился уровень ИЛ-6, основного цитокина связанного с системными проявлениями заболевания. Учитывая, что ИЛ-6 потенцирует остеокластогенез, можно заключить, что санаторно-курортное лечение не приводило к усилению костной резорбции.
Отмечалось снижение уровня СБ34 независимо от активности заболевания (при 0 степени активности с 8,85±0,73% до 8,83±0,30%, при 1 степени с 9,16±0,38% до 8,50±0,50%, при 2 степени с 11,12±0,24% до 10,06±0,18%)
Показатели ЯЛККЬ и ОРО, а также соотношение ОРО/ ЯЛККЬ достоверно не изменились, но была отмечена тенденция к росту ИЛККЬ и ОРО и незначительное снижение соотношения ОРО/ ЯЛККЬ, что косвенно отражает уменьшение интенсивности костного ремоделирования.
Выводы.
При ювенильном ревматоидном артрите имеет место повышение концентрации как провоспали-тельных, так и противовоспалительных цитокинов.
Снижение противовоспалительного потенциала ассоциируется с более высокой активностью заболевания и степенью функциональной недостаточности. При этом имеет место факт последовательной активации и взаимосвязи в системе провоспа-лительных цитокинов.
Увеличение в системном кровотоке числа стволовых клеток (СБ34), являющихся предшественниками различных клеток, в том числе и остеокластов, может способствовать как остеокластогенезу, так и может быть рассмотрено как косвенный признак снижения хоуминга предшественников остеокластов в костный мозг, и, следовательно, дисбаланса между остеобластами и остеокластами.
Изменения в системе ИЛККЬ/ОРО свидетельствовали о снижении интенсивности ремоделирова-ния костной ткани, с превалированием процесса костной резорбции и усугублялись по мере возрастания активности воспалительного процесса.
Выявлено положительное влияние санаторно-курортного лечения на динамику исследуемых параметров, однако незначительная выраженность данных изменений диктует необходимость пролонгирования длительности реабилитации и модификации стандартных комплексов санаторно-курортного лечения.
Литература
1. Камилов Ф.Х., Фаршатова Е.Р., Еникеев Д.А. Клеточно-молекулярные механизмы ремоделирования костной ткани и ее регуляция. Фундаментальные исследования 2014;. 7 (4):836-842
2. Сагаловски С. Остеопороз: клеточно-молекулярные механизмы развития и молекулы-мишени для поиска новых средств лечения заболевания. Остеопороз и остеопатии 2012; 1: 15-28
3. Darnay B.D., Besse A., Poblenz A. et al. TRAFs in RANK signaling . Adv. Exp. Med. Biol. 2007; 1 (597):152-159
4. Sagalovsky S., Schonert M. RANKL-RANK-OPG system and bone remodeling: a new approach on the treatment of osteoporosis. Clin.. Explt. Pathol. 2011; 2(10):146-153
Лите
1. Kamilov F.Kh., Farshatova E.R., Enikeev D.A. Kletochno-molekulyarnye mekhanizmy remodelirovaniya kostnoy tkani i ee regulyatsiya. Fundamental'nye issledovaniya 2014;. 7 (4):836-842
2. Sagalovski S. Osteoporoz: kletochno-molekulyarnye mekhanizmy razvitiya i molekuly-misheni dlya poiska novykh sredstv lecheniya zabolevaniya. Osteoporoz i osteopatii 2012; 1: 15-28
3. Darnay B.D., Besse A., Poblenz A. et al. TRAFs in RANK signaling . Adv. Exp. Med. Biol. 2007; 1 (597):152-159
4. Sagalovsky S., Schonert M. RANKL-RANK-OPG system and bone remodeling: a new approach on the treatment of osteoporosis. Clin.. Explt. Pathol. 2011; 2(10):146-153
5. Jabbar S., Drury J., Nordham J.N. et al. Osteopretegerin RANKL and bone turnoval in postmenopausal osteoporosis. J. Clin. Pathol. 2011; 4(64): 354-357
6. Макарова Т.П. Ювенильный ревматоидный артрит: современные аспекты: Обзор. Казанский медицинский журнал 2004; 4: 291-297
7. Фриденштейн А.Я. Стволовые остеогенные клетки костного мозга. Онтогенез 1991; 2: 189-197
8. Tavassoli M., Hardy C.L., Aizawa S. et al. Molecular mechanism of hematopoietic stem cell binding to the supportive stroma. Prog. Clin. Biol. Res. 1990; 325-87.
тура
5. Jabbar S., Drury J., Nordham J.N. et al. Osteopretegerin RANKL and bone turnoval in postmenopausal osteoporosis. J. Clin. Pathol. 2011; 4(64): 354-357
6. Makarova T.P. Yuvenil'nyy revmatoidnyy artrit: sovremennye aspekty: Obzor. Kazanskiy meditsinskiy zhurnal 2004; 4: 291297
7. Fridenshteyn A.Ya. Stvolovye osteogennye kletki kostnogo mozga. Ontogenez 1991; 2: 189-197
8. Tavassoli M., Hardy C.L., Aizawa S. et al. Molecular mechanism of hematopoietic stem cell binding to the supportive stroma. Prog. Clin. Biol. Res. 1990; 325-87.
Сведения об авторах
Соболева Елена Михайловна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры педиатрии, физиотерапии и курортологии ФПМКВК и ДПО ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, 295051, Россия, Республика Крым, г.Симферополь, бульвар Ленина, 5/7, e-mail: alex_sobolev64@mail.ru
Каладзе Николай Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой педиатрии, физиотерапии и курортологии ФПМКВК и ДПО ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», Медицинская академия имени С.И. Георгиевского, 295051, Россия, Республика Крым, г.Симферополь, бульвар Ленина, 5/7, e-mail: evpediatr@rambler.ru
