2023 Т. 53 № 3 / Техника и технология пищевых производств / Food Processing: Techniques and Technology
ISSN 2074-9414 (Print) ISSN 2313-1748 (Online)
https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-3-2456 https://elibrary.ru/SOJITN
Оригинальная статья https://fptt.ru
Динамика изменения бактериального состава молочной основы в процессе ферментации
М. В. Грязнова1 , И. Ю. Буракова1 , Ю. Д. Смирнова1 , Д) Б. Ю. Нестерова12 , Н. С. Родионова1 , Б. С. Попов1 ,
М. Ю. Сыромятников12* , В. Н. Попов1'2
1 Воронежский государственный университет инженерных технологий**-*1, Воронеж, Россия 2 Воронежский государственный университет^^, Воронеж, Россия
*М. Ю. Сыромятников: [email protected], https://orcid.org/0000-0001-9028-0613 М. В. Грязнова: https://orcid.org/0000-0003-2076-3868 И. Ю. Буракова: https://orcid.org/0000-0002-5881-0845 Ю. Д. Смирнова: https://orcid.org/0000-0002-5820-1804 Е. Ю. Нестерова: https://orcid.org/0000-0003-0918-3547 Н. С. Родионова: https://orcid.org/0000-0002-6940-7998 Е. С. Попов: https://orcid.org/0000-0003-3303-3434 В. Н. Попов: https://orcid.org/0000-0003-1294-8686
© М. В. Грязнова, И. Ю. Буракова, Ю. Д. Смирнова, Е. Ю. Нестерова, Н. С. Родионова, Е. С. Попов, М. Ю. Сыромятников, В. Н. Попов, 2023
Аннотация.
Пробиотическая закваска - это биопрепарат на основе молочнокислых бактерий. Метаболические характеристики заквасок имеют значение для свойств ферментированных продуктов и определения потенциальной активности микроорганизмов. Цель исследования заключалась в оценке бактериального состава заквасочной культуры в различные промежутки времени в процессе ферментации при приготовлении пробиотического кисломолочного продукта. В исследовании использовали закваску для приготовления пробиотического кисломолочного продукта, включающую Streptococcus salivarius ssp. thermophiles, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobactreium animalis ssp. lactis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus и Lacticaseibacillus casei. Объектом ферментации являлось пастеризованное молоко. Отбор проб проводили на протяжении всего процесса ферментации (0, 3, 6, 9, 12, 15 и 18 ч). Для определения бактериального состава использовали метод секвенирования нового поколения, направленный на исследование V3 участка гена 16S рРНК.
В процессе ферментации выявлено снижение Bifidobacterium и преобладание Lactobacillus. Пик их обильности в исследуемом субстрате составил 97,5 % на 15 ч ферментации. В каждой контрольной точке ферментации наблюдалось снижение численности Streptococcus. Род Lactobacillus заместил все другие роды бактерий, включая Bifidobacterium, что объясняется снижением pH в процессе ферментации. Для ферментации продолжительностью 18 ч были достигнуты оптимальные значения для увеличения численности рода Lactobacillus (рН = 4,2-4,4), но они оказались низкими для продуктивного роста Bifidobacterium.
Проведенное исследование продемонстрировало динамику изменения бактериального состава молочной основы в процессе ферментации. Высокопроизводительное секвенирование является хорошим инструментом для контроля процессов ферментации пробиотиков.
Ключевые слова. Микробиом, пробиотический кисломолочный продукт, ферментация, заквасочная бактериальная культура, Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, секвенирование 16S рРНК, индекс Шеннона, величина pH
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Минобрнауки России)"0" в рамках национального проекта «Наука» (проект FZGW-2020-0001, уникальный номер реестра государственных заданий 075001X39782002) и Российского научного фонда (РНФ)"011 (проект № 21-74-00065) в части исследования биоразнообразия бактерий в закваске и продуктах ферментации.
Для цитирования: Динамика изменения бактериального состава молочной основы в процессе ферментации / М. В. Грязнова [и др.] // Техника и технология пищевых производств. 2023. Т. 53. № 3. С. 554-564. https://doi.org/ 10.21603/2074-9414-2023-3-2456
Поступила в редакцию: 27.02.2023 Принята после рецензирования: 03.05.2023 Принята к публикации: 06.06.2023
https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-3-2456 Original article
https://elibrary.ru/SOJITN Available online at https://fptt.ru/en
Bacterial Composition of Dairy Base during Fermentation
®
Mariya V. Gryaznova1 , Inna Yu. Burakova1 , Yuliya D. Smirnova1 , Bkaterina Yu. Nesterova1'2 ,
Natalia S. Rodionova1 , Bvgeniy S. Popov1 , Mikhail Yu. Syromyatnikov1-2'* , Vasily N. Popov1-2
1 Voronezh State University of Engineering Technologies^**, Voronezh, Russia 2 Voronezh State University1^, Voronezh, Russia
*Mikhail Yu. Syromyatnikov: [email protected], https://orcid.org/0000-0001-9028-0613 Mariya V. Gryaznova: https://orcid.org/0000-0003-2076-3868 Inna Yu. Burakova: https://orcid.org/0000-0002-5881-0845 Yuliya D. Smirnova: https://orcid.org/0000-0002-5820-1804 Ekaterina Yu. Nesterova: https://orcid.org/0000-0003-0918-3547 Natalia S. Rodionova: https://orcid.org/0000-0002-6940-7998 Evgeniy S. Popov: https://orcid.org/0000-0003-3303-3434 Vasily N. Popov: https://orcid.org/0000-0003-1294-8686
© M.V. Gryaznova, I.Yu. Burakova, Yu.D. Smirnova, E.Yu. Nesterova, N.S. Rodionova, E.S. Popov, M.Yu. Syromyatnikov, V.N. Popov, 2023
Abstract.
Probiotic starters are a biological product based on lactic acid bacteria. Their metabolic characteristics determine the properties of the final products. This study evaluated the bacterial composition of a starter culture at various time intervals during the fermentation of a probiotic dairy product.
The starter consisted of Streptococcus salivarius ssp. thermophiles, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobactreium animalis ssp. lactis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, and Lacticaseibacillus casei. Pasteurized milk served as the object of fermentation. The starter culture was activated in sterilized skimmed milk. Sampling occurred throughout the entire fermentation process (0, 3, 6, 9, 12, 15, and 18 h). To determine the microbiome of the substrates, the authors used the next-generation high-throughput sequencing that targeted V3 of 16S rRNA gene. The fermentation resulted in a decrease in Bifidobacterium and an increase in Lactobacillus, which peaked (97.5%) after 15 h of fermentation. Each sampling showed that the count of Streptococcus went down. Eventually, Lactobacillus replaced all other genera, including Bifidobacterium, probably, as a result of pH going down during fermentation. The optimal values for the proliferation of Lactobacillus (pH = 4.2-4.4), which were registered after 18 h, turned out to be too low for the productive growth of Bifidobacterium.
The research demonstrated the changes in the bacterial composition of the dairy base during fermentation. The high-throughput sequencing proved to be an efficient tool in controlling probiotic fermentation processes.
Keywords. Bacterial composition, probiotic dairy product, fermentation, starter bacterial culture, Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, 16S rRNA sequencing, Shannon index, pH value
Funding. The research was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (Minobrnauki)ROR as part of the national project "Science" (FZGW-2020-0001, register no. 075001X39782002) and by the Russian Science Foundation (RSF)"0" (project no. 21-74-00065) as part of studies of biodiversity of bacterial starter culture and fermentation products.
For citation: Gryaznova MV, Burakova IYu, Smirnova YuD, Nesterova EYu, Rodionova NS, Popov ES, et al. Bacterial Composition of Dairy Base during Fermentation. Food Processing: Techniques and Technology. 2023;53(3):554-564. (In Russ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-3-2456
Received: 27.02.2023 Revised: 03.05.2023 Accepted: 06.06.2023
Введение
Ферментация - это биотехнологический метод, возникший из-за необходимости сохранения пищевых продуктов [1]. Закваска представляет собой
сложный микробный биопрепарат, основу которого составляют представители молочнокислых бактерий. Их ферментация придает готовому продукту такие характерные черты, как вкус и высокие
органонолептические качества. Молочнокислые бактерии представляют интерес для пищевой промышленности, т. к. производят молочную кислоту в процессе брожения [2, 3]. Это соединение может инги-бировать развитие патогенных микроорганизмов и микроорганизмов, вызывающих порчу продукции и способных снизить качество готового продукта, что способствует увеличению срока годности ферментированных пищевых продуктов [1]. Метаболические характеристики заквасок являются ключевыми для конечных свойств ферментированных продуктов [4, 5].
В состав закваски для приготовления пробиоти-ков входят такие бактерии, как Streptococcus saliva-rius ssp. thermophilus и Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Бактерии должны быть жизнеспособными, а общая нагрузка двух видов должна составлять 107 КОЕ/г [6]. Хотя эти два вида являются основными для производства кисломолочных продуктов, могут встречаться и другие виды молочнокислых бактерий [7].
Использование в закваске бактерий для ускорения процесса ферментации, таких как S. salivarius ssp. thermophilus и L. delbrueckii ssp. bulgaricus, обладает преимуществом, т. к. эти два рода находятся в симбиотических отношениях при производстве йогурта [8]. Однако из-за образования ингибирую-щих соединений и/или конкуренции за питательные вещества S. salivarius ssp. thermophilus и L. delbrueckii ssp. bulgaricus при производстве йогурта могут снижать жизнеспособность пробиотических штаммов, добавленных в эти продукты [9, 10].
В пищевой промышленности наибольшее количество продуктов и напитков с пробиотиками производится с использованием молочной основы из-за того, что молочные продукты являются хорошим материалом для доставки пробиотиков человеку [11]. Пробиотики на основе лактобактерий обладают такими важными свойствами, как высокая толерантность к кислоте и желчи, способность фиксироваться на поверхности кишечника, нечувствительность к низким значениям рН и желудочному соку, антимикробная активность, нечувствительность к антибиотикам, удаление холестерина и продукции экзо-полисахаридов в организме [12].
Lactobacillus acidophilus и Lacticaseibacillus ca-sei (предыдущее название Lactobacillus casei) -грамположительные пробиотические бактерии, широко используемые в промышленности. Их способность увеличивать бактериальную нагрузку и сокращать время ферментации делает их выгодными для производителей [13].
Бактерии рода Bifidobacterium часто используют для производства пробиотических продуктов, т. к. они являются прототипом пробиотиков, в норме обитающих в желудочно-кишечном тракте человека, а также обладают разнообразными механизмами
резистентности к желчным кислотам, что важно для появления пробиотического действия [14, 15]. Bifidobacterium способны подавлять рост условно-патогенных бактерий, таких как Escherichia coli, Listeria monocytogenes и Bacillus subtilis [15]. Исследования пробиотических свойств бифидобак-терий, добавляемых в детское питание, продемонстрировали их положительное влияние на детей с аллергией, диареей и другими заболеваниями [16].
К преимуществам Bifidobacterium animalis subsp. lactis для здоровья человека относится способность снижать уровень холестерина в сыворотке крови, обеспечивать защиту от колоректального рака, регулировать время прохождения через кишечник и запоры, уменьшать воспаление кишечника за счет поддержания благоприятного баланса микро-биоты [17].
Bifidobacterium longum - это бифидобактерии, обладающие высоким потреблением фруктозы и скоростью разложения олигофруктозы, а также способные к частичному расщеплению инулина [18]. Этот род бактерий является одним из доминирующих для микробиоты желудочно-кишечного тракта человека, поэтому может иметь потенциал в качестве пробиотиков [19].
Изучение микробного состава закваски актуально для определения потенциальной активности микроорганизмов в ней [20]. Различные кислоты и ферменты, продуцируемые микробной культурой, влияют на вкус, консистенцию и срок годности готового продукта [21]. Микроорганизмы, используемые для производства продуктов молочной кислоты, в том числе добавленные в качестве пробиотиков, могут влиять на микробиом кишечника человека [22].
Однако зачастую неясно, в каких количествах остаются полезные бактерии после процесса ферментации в конечном кисломолочном продукте. Цель данного исследования заключалась в оценке бактериального состава пробиотического кисломолочного продукта в различные промежутки времени (0, 3, 6, 9, 12, 15 и 18 ч) ферментации с помощью высокопроизводительного секвенирования нового поколения.
Объекты и методы исследования
Объекты исследования. В состав закваски для приготовления пробиотического кисломолочного продукта входили следующие бактерии: Streptococcus salivarius ssp. thermophiles (106 КОЕ/г), Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (109 КОЕ/г), Bifidobacterium bifidum (109 КОЕ/г), Bifidobactreium animalis ssp. lactis (109 КОЕ/г), Bifidobacterium longum (109 КОЕ/г), Lactobacillus acidophilus (109 КОЕ/г) и Lacticaseibacillus casei (109 КОЕ/г). Культуры бактерий, используемых в качестве закваски, были ранее изолированы из кисломолочных продуктов и депонированы в микробиологическом музее Воро-
нежского государственного университета инженерных технологий (ВГУИТ). Бактерии предварительно были проверены на способность роста в питательной среде на основе обезжиренного молока.
Все этапы исследования были проведены на базе лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий ВГУИТ.
Ферментация. Закваску активировали в 100 мл стерилизованного (температура 121 ± 2 °С, выдержка 13 ± 2 мин) и охлажденного до температуры 39 ± 1 °С обезжиренного молока с последующим внесением 0,7 г сухой закваски. Для активации микробных клеток закваску тщательно перемешивали и выдерживали 4,0 ч при температуре 37 ± 1 °С. Через 1 и 2 ч после начала активации суспензию бактерий снова перемешивали (встряхиванием) для равномерного распределения бактериальных клеток по массе. Полученную активированную закваску (без образования сгустка) сразу после активации добавляли при перемешивании в пастеризованное (92 ± 2 °С, выдержка 2-8 мин) и охлажденное (37-42 °С) молоко в количестве не менее 0,5 мл/кг ферментированной смеси.
Отбор проб проводили на протяжении всего процесса ферментации. Контрольные точки: сразу после внесения бактериальной культуры в пастеризованное молоко (0 ч) и через 3, 6, 9, 12, 15 и 18 ч ферментации. Был проанализирован состав исходной закваски и молока, используемых для приготовления конечного продукта.
Конечный химический состав пробиотическо-го кисломолочного продукта: жиры - 1,2 г/100 г, белки - 2,8 г/100 г, углеводы - 10,5 г/100 г, энергетическая ценность - 64,0 ккал/100 г.
Секвенирование участка гена 16S рРНК. В начале работы по подготовке библиотек секвениро-вания из полученных образцов выделяли тотальную ДНК с помощью коммерческого набора QuickDNA Fungal/Bacterial Microprep Kit (Zymo Research, США) согласно протоколу.
Для метода секвенирования на платформе Ion Torrent PGM был выбран анализ гипервариабельной области V3 гена 16S рРНК.
Амплификацию этого участка проводили с использованием универсальных праймеров (337F 5'-GACTCCTACGGGAGGCWGCAG-3' и 518R 5'-GTAT-TACCGCGGCTGCTGG-3') и набора 5X Screen Mix-HS Master Mix (Евроген, Россия). ПЦР-анализ проводили в следующих условиях: денатурация при 94 °С в течение 4 мин; 35 циклов денатурации при 94 °С в течение 30 с; отжиг праймера при 53 °С в течение 30 с и удлинение при 72 °С в течение 30 с. Затем продукты ПЦР очищали с использованием магнитных частиц AMPureXP (BeckmanCoulter, США).
Из очищенных продуктов ПЦР готовили библиотеки секвенирования с использованием набора NEB Next Fast DNA (New England Biolabs, США) на
основе протокола производителя. Библиотеки штрих-кодировали с помощью набора NEXT flex (Ion Torrent; Perkin Elmer, Inc., США), а затем готовые библиотеки дополнительно очищали с использованием магнитных частиц AMPure XP.
Для секвенирования участка V3 гена 16S рРНК на платформе Ion Torrent PGM использовали чип Ion 318™ Chipv2 BC и коммерческие наборы Ion PGM Hi-Q View OT2 Kit и Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, США).
Обработка и статистический анализ данных сек-венирования. Для базового вызова и выравнивания полученных чтений использовалось базовое программное обеспечение TorrentSuite. Чтения BAM были преобразованы в формат FASTQ с помощью FileExporter для последующего анализа с помощью языка программирования R. Необработанные данные секвенирования доступны в базе данных NCBI BioProject (BioProjectID: PRJNA900167).
Последующий биоинформатический анализ был выполнен в RStudio (RStudioInc, США). Чтения низкого качества были отфильтрованы с использованием максимального порога ожидаемой ошибки 1,0 (пакет DADA2). На следующем этапе качественные риды были унифицированы по длине и демультиплексированы. Затем при дерепликации все идентичные чтения были объединены в уникальные последовательности (ASV). Алгоритм UNOISE2 использовался для формирования оперативных таксономических единиц (OTU).
Общая идентификация таксономического состава микроорганизмов проведена на основании базы данных SILVA версии 132 (https://www.arb-silva.de, по состоянию на 29 сентября 2022 г.). Мы исключили агенты контаминации из проб с помощью пакета decontam R.
Чтобы сравнить относительную численность между группами лечения, использовали метод обобщенного линейного моделирования (GLM), реализованный в пакете DeSEQ2 R. P-значения для каждой OTU были получены с использованием теста Вальда с применением коррекции множественного вывода Бенджамини-Хохберга. Альфа-разнообразие для каждой группы рассчитывали с использованием индекса Шеннона. Был использован тест Тьюки для оценки различий в показателях альфа-разнообразия между группами.
Результаты и их обсуждение
Проанализировали изменения бактериального состава в процессе ферментации. Были получены данные о бактериальном составе исходной бактериальной закваски, стерилизованного молока и их смеси до начала брожения (0 ч) и в процессе брожения (3, 6, 9, 12, 15 и 18 ч). В ходе секвенирования было получено 150 972 прочтения, что соответствует 10 бактериальным типам и 132 родам.
Обилие типов Patescibacteria, Campilobacterota, Cyanobacteria, Fusobacteriota и Bdellovibrionota составляло менее 0,010 для каждого субстрата и точки времени ферментации, поэтому их сгруппировали в «Другие» (рис. 1).
Тип Firmicutes оказался самым многочисленным среди всех выборок. Для молока его концентрация составила 0,4634, для закваски - 0,5303, для временных интервалов ферментации смеси - 0,9050. В закваске вторым по численности типом был Acti-nobacteriota - 0,4618, численность остальных типов составила менее 0,01. В молоке, помимо Firmicutes,
в значимых количествах были представлены типы Deinococcota - 0,2816, Proteobacteria - 0,1448, Bacteroidota - 0,0817 и Actinobacteriota - 0,0251.
Статистически значимые различия между изучаемыми субстратами на уровне типа определяли с помощью DeSeq2, реализующего критерий Вальда с поправкой множественного вывода по умолчанию -Бенджамини-Хохберга (рис. 2). Результаты были выражены как Log2FoldChange, характеризующие размер эффекта и скорректированное значение p.
Согласно анализу статистически значимые различия наблюдались между 6 и 0 ч ферментации для
100
о я н CD
218 Молоко Закваска
Ac tinobacteriota
Время ферментации, ч tBacteroidota UDcinocaccota Firmirutes ■ Protoobcctcria Другие
н s о о я
H
CD
Рисунок 1. Соотношение бактериальных типов в исследуемых субстратах Figure 1. Proportion of different bacterial in substrates
Firmicutes Deinococcota
Время ферментации, ч
0ч 13ч И6ч U9ч
12ч ■15ч
18 ч
Рисунок 2. Статистически значимые различия в микробиомном составе на уровне типа во время ферментации
(*p < 0,05, ***p < 0,001)
Figure 2. Statistically significant differences in microbiome composition for each during fermentation (*p < 0.05, ***p < 0.001)
типов Deinococcota - 1,9740 (p = 0,0129) и Firmi-tes - 2,1110 (p = 0,0129). По сравнению с 0 ч на 12 ч стадии ферментации разница для типа Firmicutes составила 3,1633 (p = 0,0001), для Deinococcota -2,6248 (p = 0,0001); на 15 ч стадии ферментации 3,1130 (р = 0,0001) и -2,9482 (р = 0,0001) для Firmicutes и Deinococcota соответственно; на 18 ч стадии ферментации разница составила -2,6647 (p = 0,0002) для Deinococcota. На 15 ч стадии ферментации, по сравнению с 3 ч, разница составила -2,1461 (р = 0,0414) для Deinococcota.
Все роды бактерий, численность которых в каждой группе была менее 0,0100, были объединены в «Другие». Таким образом, были выделены 14 родов бактерий, формирующих ядро микробиома исследуемых субстратов (рис. 3).
Наиболее распространенными родами бактерий были Lactobacillus, Bifidobacterium, Thermus, Lactococcus, Streptococcus, Acinetobacter, Chryseobac-terium, Pseudomonas, Anoxybacillus, Prevotella, Cuti-bacterium, Oscillospiraceae UCG-005 и Leuconostoc. Lactobacillus был преобладающим родом для закваски (0,5142), для каждой временной точки процесса ферментации среднее значение составило 0,8542. Помимо Lactobacillus, в закваске был обнаружен Bifidobacterium - 0,4628. Численность остальных родов, представленных на рисунке 3, была менее 0,01. В стерилизованном молоке преобладал род Thermus - 0,2899, следующим по численности были роды Lactococcus - 0,2474, Streptococcus - 0,1270, Acinetobacter - 0,0820, Chryseobacterium - 0,0621,
Pseudomonas - 0,0386, Anoxybacillus - 0,0364, Cuti-bacterium - 0,0184, Lactobacillus - 0,0166, Leuconostoc - 0,0107. Численность остальных идентифицированных родов была менее 0,01.
Был использован индекс Шеннона для расчета альфа-разнообразия для каждого изученного субстрата. Статистические различия в альфа-разнообразии между субстратами были выявлены с использованием теста Тьюки HSD (рис. 4).
Проведенный анализ показал наличие статистической разницы в бактериальном разнообразии между несколькими субстратами. Индекс Шеннона для стерилизованного молока составил 2,2259, что превышало индекс альфа-разнообразия в продукте ферментации через 6 ч (Н = 0,4397, р = 0,0022), 9 ч (Н = 0,4496, р = 0,0023), 12 ч (Н = 0,2435, р = 0,0005), 15 ч (Н = 0,1870, р = 0,0003) и 18 ч (Н = 0,4716, р = 0,0027). Кроме того, альфа-разнообразие смеси стерилизованного молока и закваски до начала ферментации (0 ч) составляло 1,6438 и превышало этот показатель через 12 ч (Н = 0,2435, р = 0,0320) и 15 ч (Н = 0,1870, р = 0,0221) ферментации смеси.
Различия между составом, в зависимости от времени ферментации смеси, определяли с помощью DeSeq2 (рис. 5). Результаты были выражены как Log2FoldChange, характеризующие размер эффекта и скорректированное значение p.
Несмотря на изменения бактериального состава субстрата при ферментации, для рода Lactobacil-lus выявлены статистически значимые изменения. Было обнаружено увеличение этого рода во время
100
18 Молоко Закваска
Времяферментации,ч
■ Acenetpeacter AnoxyeMcellps
■ BefidpeMcterePM
■ ChrysepeMcterePM
1 CptieMcteriPM iFaecaiieacterium ■ Lactpeacellps Lactococcus
I Lepcpnpstpc
Oscillpsperaceae UCG-005 I Prevptella I PsepdpMpnas
■ Streptpcpccps
■ TherMps Другие
Рисунок 3. Бактериальный составнауровнерода в исследуемых субстратах Figure 3. Bacterialcomposition
3
2 -
Д т
18 Закваска Молоко
о -
0 3 6 9 12 15
1_I
Время ферментации, ч
Рисунок 4. Альфа-разнообразие на уровне рода в исследуемых субстратах (*p < 0,05, **p <0 ,01, ***p < 0,001) Figure 4. Alpha diversity in the substrates (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)
£ (9
о о Я К
§
я л
5 S
О
о
в
о
Lactobacillus Bifidobacterium
Время ферментации, ч
0 ч 3 ч 6 ч 9 ч 12 ч 15 ч 18 ч
Рисунок 5. Различия в составе Lactobacillus и Bifidobacterium при ферментации (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001) Figure 5. Composition of Lactobacillus and Bifidobacterium during fermentation (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)
* * *
HI
* *
% * *
HI
ферментации: статистически значимое от 6 ч ферментации до 0 ч. Увеличение после 6 ч ферментации считается значительным. Однако через 15 ч брожения количество Lactobacillus уменьшается, что является статистически значимым. Хотя нет статистически значимой разницы между количеством би-фидобактерий во время ферментации, можно увидеть, что их количество уменьшается в процессе и замещается лактобациллами.
Изменение состава миробиоты в процессе ферментации пробиотика является естественным процессом. Изменяющиеся физико-химические свойства способствуют формированию стрессовых условий, трансформирующих микробное разнообразие. Активные качественные и количественные изменения микробиоты приводят к появлению в готовой продукции отдельных доминирующих таксонов [23, 24]. Например, метагеномный анализ образцов кумыса традиционного типа брожения показал снижение количества представителей рода Lactobacillus, в то время как содержание Streptococcus увеличивалось. Несмотря на это, основными преобладающими родами на всех стадиях ферментации кумыса оставались представители родов Lactococcus, Lac-tobacillus и Enterococcus, обеспечивающие формирование особого вкуса и питательности конечного продукта [25].
Анализ популярного в южноафриканских странах пробиотического продукта амаси показал, что в процессе ферментации регистрировалось повышение содержания бактерий семейств Lactobacilla-ceae и Streptococcaceae. Представители из семейства Prevotellaceae доминировали в сыром молоке, но с началом ферментации уменьшались [26]. Такие результаты связывают с низким значением рН, поскольку культуры, используемые в ферментации продуктов, активно функционируют в кислой среде [26].
В данном исследовании были изучены изменения состава микробиома ферментированного про-биотического кисломолочного продукта на основе молочной сыворотки на разных стадиях ферментации (от 0 до 18 ч, шаг 3 ч). Также исследовали бактериальный состав закваски и пастеризованного молока, которые использовались для получения конечного ферментированного продукта. В составе закваски по результатам секвенирования содержались следовые количества (менее 0,5 %) следующих бактерий: Thermus, Prevotella, Oscillospiraceae UCG-005 и Lactococcus. В молоке были идентифицированы различные роды бактерий. Так как молоко пастеризованное, то это ДНК мертвых бактерий, которые не повлияли на процесс брожения.
Некоторые штаммы Thermus и Lactococcus широко используются при приготовлении заквасок [27, 28]. Однако этого нельзя сказать о бактериях рода Prevotella. При анализе литературы не удалось найти данных о том, что эти бактерии могут использовать-
ся в производстве заквасок. Однако известно, что Prevotella copri является потенциальным кандидатом в пробиотические бактерии [29, 30]. Что касается Oscillospiraceae UCG-005, то обнаружение этой бактерии в закваске было неожиданным. Этот вид бактерий и его влияние на здоровье человека плохо изучены. Thermus и Lactococcus были доминирующими родами, обнаруженными в молоке. Они являются нормальными членами, содержащимися в молочных продуктах.
На протяжении всех стадий ферментации мы наблюдали, как постепенно род Lactobacillus вытесняет остальные роды бактерий, включая про-биотический род Bifidobacterium. В итоге пиковая концентрация представителей этого рода в исследуемом субстрате составила 97,5 % на 15 ч ферментации, после чего численность лактобацилл снизилась до 92,3 % на 18 ч ферментации. Это можно объяснить снижением рН на протяжении всего процесса брожения: в начале брожения отмечался рН 6,2-6,4, а в конце брожения - 4,2-4,4. Для роста бактерий рода Bifidobacterium оптимальный рН находится в диапазоне 6,5-7,0, тогда как лактобациллы не чувствительны к низким значениям рН [12, 31].
По результатам данного исследования в процессе ферментации в каждой контрольной точке наблюдалось снижение численности бактерий рода Streptococcus. Однако в предыдущих исследованиях сообщалось, что количество жизнеспособных клеток этого рода постепенно увеличивалось в процессе ферментации [32]. Эти результаты можно объяснить тем, что бактерии этого рода чувствительны к условиям культивирования, а для их роста в определенной среде необходимы углеводы, аминокислоты, витамины, нуклеотиды и минеральные вещества [33].
Одним из важнейших перспективных преимуществ процесса ферментации является способность снижать аллергенность тех или иных компонентов. Это осуществляется за счет ферментативного гидролиза аллергенных пептидов, входящих в состав продуктов [34-36].
Активное применение в пищевой промышленности заквасок обеспечивает формирование особых физико-химических характеристик, а также органо-лептических и питательных свойств у готового продукта [37]. Чтобы конечный результат не отличался от ожидаемого, бактериальный состав заквасок, применяемых в производстве ферментированных продуктов, должен соответствовать заявленному производителем. В связи с этим необходимо осуществлять контроль состава и качества заквасоч-ных культур в целях предотвращения негативного влияния на свойства готовой продукции. Как было показано нами ранее, быстро и эффективно с этим могут справиться молекулярно-генетические методы [38, 39].
Выводы
В процессе ферментации наблюдалось увеличение рода Lactobacillus до 97,5 % к 15 ч ферментации, после чего количество Lactobacillus начало снижаться. Род Lactobacillus заменяет все другие роды бактерий, включая пробиотический род Bifidobacterium. Это можно объяснить снижением pH на протяжении всего процесса ферментации. В процессе ферментации продолжительностью 18 ч были достигнуты оптимальные значения рН = 4,2-4,4 для увеличения численности рода Lactobacillus, но они оказались низкими для продуктивного роста бифидобактерий. Высокопроизводительное секвенирование является хорошим инструментом для контроля процессов ферментации пробиотических кисломолочных продуктов.
Критерии авторства
Авторы в равной степени участвовали в написании экспериментальной части рукописи и несут равную ответственность за плагиат.
Contribution
The authors were equally involved in the experimental part of the research and are equally responsible for any potential plagiarism.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this article.
References/Список литературы
1. Leeuwendaal NK, Stanton C, O'Toole PW, Beresford TP. Fermented foods, health and the gut microbiome. Nutrients. 2022;14(7). https://doi.org/10.3390/nu14071527
2. Mathur H, Beresford TP, Cotter PD. Health benefits of lactic acid bacteria (LAB) fermentates. Nutrients. 2020;12(6). https://doi.org/10.3390/nu12061679
3. Krasnova IS, Ganina VI, Semenov GV. Fruit and vegetable purees as cryoprotectants for vacuum freeze-dried fermented milk products. Foods and Raw Materials. 2023;11(2):300-308. https://doi.org/10.21603/2308-4057-2023-2-578
4. Garcia-Diez J, Saraiva C. Use of starter cultures in foods from animal origin to improve their safety. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2021;18(5). https://doi.org/10.3390/ijerph18052544
5. Yang Q, Rutherfurd-Markwick K, Mutukumira AN. Identification of dominant lactic acid bacteria and yeast in rice sourdough produced in New Zealand. Current Research in Food Science. 2021;4:729-736. https://doi.org/10.1016/ j.crfs.2021.10.002
6. Freitas M. The benefits of yogurt, cultures, and fermentation. In: Floch MH, Ringel Y, Walker WA, editors. The microbiota in gastrointestinal pathophysiology. Implication human health, prebiotics, probiotics, dysbiosis. Academic Press; 2017. pp. 209-223. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-804024-9.00024-0
7. Ispirli H, Dertli E. Isolation and identification of exopolysaccharide producer lactic acid bacteria from Turkish yogurt. Journal of Food Processing and Preservation. 2018;42(8). https://doi.org/10.1111/jfpp.13351
8.Agustinah W, Warjoto RE, Canti M. Yogurt making as a tool to understand the food fermentation process for nonscience participants. Journal of Microbiology and Biology Education. 2019;20(1). https://doi.org/10.1128/jmbe.v20i1. 1662
9. Saarela M, Mogensen G, Fonden R, Matto J, Mattila-Sandholm T. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology. 2000;84(3):197-215. https://doi.org/10.1016/s0168-1656(00)00375-8
10. Viability of probiotic Lactobacillus casei in yoghurt: defining the best processing step to its addition [Internet]. [cited 2023 Jan 16]. Available from: https://www.alanrevista.org/ediciones/2013/1/art-8
11. Gao J, Li X, Zhang G, Sadiq FA, Simal-Gandara J, Xiao J, et al. Probiotics in the dairy industry - Advances and opportunities. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2021;20(4):3937-3982. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12755
12. Widyastuti Y, Febrisiantosa A, Tidona F. Health-promoting properties of lactobacilli in fermented dairy products. Frontiers in Microbiology. 2021;12. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.673890
13. Amanat S, Mazloomi SM, Asadimehr H, Sadeghi F, Shekouhi F, Mortazavi SMJ. Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei exposed to Wi-Fi radiofrequency electromagnetic radiation show enhanced growth and lactic acid production. Journal of Biomedical Physics and Engineering. 2020;10(6):745-750. https://doi.org/10.31661/JBPE.V0I0. 1056
14. Fijan S. Microorganisms with claimed probiotic properties: An overview of recent literature. International Journal of Environmental Research Public Health. 2014;11(5):4745-4767. https://doi.org/10.3390/ijerph110504745
15. Cai J, Bai J, Luo B, Nio Y, Tian E, Yan W. In vitro evaluation of probiotic properties and antioxidant activities of Bifidobacterium strains from infant feces in the Uyghur population of northwestern China. Annals of Microbiology. 2022;72. https://doi.org/10.1186/s13213-022-01670-y
16. O'Sullivan A, Farver M, Smilowitz JT. The influence of early infant-feeding practices on the intestinal microbiome and body composition in infants. Nutrition and Metabolic Insights. 2015;8(1). https://doi.org/10.4137/NMI. S29530
17. Cheng J, Laitila A, Ouwehand AC. Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 effects on gut health: A review. Frontiers in Nutrition. 2021;8. https://doi.org/10.3389/fnut.2021.790561
18. Parhi P, Song KP, Choo WS. Growth and survival of Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum in various sugar systems with fructooligosaccharide supplementation. Journal of Food Science and Technology. 2022;59:3775-3786. https://doi.org/10.1007/s13197-022-05361-z
19. Mills S, Yang B, Smith GJ, Stanton C, Ross RP. Efficacy of Bifidobacterium longum alone or in multi-strain probiotic formulations during early life and beyond. Gut Microbes. 2023;15(1). https://doi.org/10.1080/19490976.2023. 2186098
20. Salari A, Hashemi M, Afshari A. Functional properties of kefiran in the medical field and food Industry. Current Pharmaceutical Biotechnology. 2022;23(3):388-395. https://doi.org/10.2174/1389201022666210322121420
21. Landis EA, Oliverio AM, McKenney EA, Nichols LM, Kfoury N, Biango-Daniels, et al. The diversity and function of sourdough starter microbiomes. eLife. 2021;10. https://doi.org/10.7554/ELIFE.61644
22. Savaiano DA, Hutkins RW. Yogurt, cultured fermented milk, and health: A systematic review. Nutrition Reviews. 2021;79(5):599-614. https://doi.org/10.1093/NUTRIT/NUAA013
23. Salazar JK, Gonsalves LJ, Fay M, Ramachandran P, Schill KM, Tortorello ML. Metataxonomic profiling of native and starter microbiota during ripening of gouda cheese made with Listeria monocytogenes-contaminated unpasteurized milk. Frontiers in Microbiology. 2021;12. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.642789
24. Chessa L, Paba A, Dupré I, Daga E, Fozzi MC, Comunian R. Strategy for the recovery of raw ewe's milk mic-robiodiversity to develop natural starter cultures for traditional foods. Microorganisms. 2023;11(4). https://doi.org/10.3390/ microorganisms11040823
25. Wu Y, Li Y, Gesudu Q, Zhang J, Sun Z, Halatu H, et al. Bacterial composition and function during fermentation of Mongolia koumiss. Food Science and Nutrition. 2021;9(8):4146-4155. https://doi.org/10.1002/fsn3.2377
26. Maleke M, Doorsamy W, Abrahams AM, Adefisoye MA, Masenya K, Adebo OA. Influence of fermentation conditions (temperature and time) on the physicochemical properties and bacteria microbiota of amasi. Fermentation. 2022;8(2). https://doi.org/10.3390/fermentation8020057
27. Zhu L, Hou Z, Hu X, Liu X, Dai T, Wang X, et al. Genomic and metabolic features of an unexpectedly predominant, thermophilic, assistant starter microorganism, Thermos thermophilus, in Chinese inner Mongolian cheese. Foods. 2021;10(12). https://doi.org/10.3390/foods10122962
28. Lee HW, Kim IS, Kil BJ, Seo E, Park H, Ham J-S, et al. Investigation of flavor-forming starter Lactococcus lactis subsp. lactis LDTM6802 and Lactococcus lactis subsp. cremoris LDTM6803 in miniature gouda-type cheeses. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2020;30(9):1404-1411. https://doi.org/10.4014/jmb.2004.04004
29. Huang F, Sardari RRR, Jasilionis A, Book O, Oste R, Rascón A, et al. Cultivation of the gut bacterium Prevotella copri DSM 18205T using glucose and xylose as carbon sources. MicrobiologyOpen. 2021;10(3). https://doi.org/10.1002/ MBO3.1213
30. Verbrugghe P, Brynjólfsson J, Jing X, Bjorck I, Hállenius F, Nilsson A. Evaluation of hypoglycemic effect, safety and immunomodulation of Prevotella copri in mice. Scientific Reports. 2021;11. https://doi.org/10.1038/s41598-021-96161-6
31. Shah NP. Bacteria, beneficial | Bifidobacterium spp.: Morphology and physiology. In: Fuquay JW, editor. Encyclopedia of dairy sciences. Academic Press; 2011. pp. 381-387. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-374407-4.00043-1
32. Song X, Hou C, Yang Y, Ai L, Xia Y, Wang G, et al. Effects of different carbon sources on metabolic profiles of carbohydrates in Streptococcus thermophilus during fermentation. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2022;102(11):4820-4829. https://doi.org/10.1002/jsfa.11845
33. Liu G, Qiao Y, Zhang Y, Leng C, Chen H, Sun J, et al. Metabolic profiles of carbohydrates in Streptococcus thermophilus during pH-controlled batch fermentation. Frontiers in Microbiology. 2020;11. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020. 01131
34. Pi X, Yang Y, Sun Y, Cui Q, Wan Y, Fu G, et al. Recent advances in alleviating food allergenicity through fermentation. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2022;62(26):7255-7268. https://doi.org/10.1080/10408398.202 1.1913093
35. Ye M, Xu Z, Tan H, Yang F, Yuan J, Wu Y, et al. Allergenicity reduction of cow milk treated by alkaline protease combined with Lactobacillusplantarum and Lactobacillus helveticus based on epitopes. Food Chemistry. 2023;421. https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.136180
36. Chen JM, Al KF, Craven LJ, Seney S, Coons M, McCormick H, et al. Nutritional, microbial, and allergenic changes during the fermentation of cashew "cheese" product using a quinoa-based rejuvelac starter culture. Nutrients. 2020;12(3). https://doi.org/10.3390/nu12030648
37. Gao J, Li X, Zhang G, Sadiq FA, Simal-Gandara J, Xiao J, et al. Probiotics in the dairy industry - Advances and opportunities. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2021;20(4):3937-3982. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12755
38. Syromyatnikov M, Nesterova E, Gladkikh M, Popov V. Probiotics analysis by high-throughput sequencing revealed multiple mismatches at bacteria genus level with the declared and actual composition. LWT. 2022;156. https://doi.org/10.1016/ j.lwt.2021.113055
39. Syromyatnikov MYu, Korneeva OS, Nesterova EYu, Gladkikh MI, Popov ES, Popov VN. High-throughput sequencing of the 16S rRNA gene for evaluation the composition of bacterial starter cultures used for the preparation of fermented milk products. Biotechnology in Russia. 2022;38(1):80-92. (In Russ.). https://doi.org/10.56304/S0234275822010082