DOI: 10.23868/201707027
динамика экспрессии компонентов серотонинергической системы в клетках гранулезы развивающегося овариального фолликула и при лютеинизации
Д.А. Никишин12, Н.М. Алешина 2, МЛ. Семенова 2, Ю.Б. Шмуклер 1
1 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия
2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Expression dynamics of the serotonergic system components in granulosa cells of the developing ovarian follicle and after luteinization
DA. Nikishin 12, N.M. Alyoshina 2, ML. Semenova 2, Y.B. Shmukler1 1N.K. Koltzov Institute of Developmental Biology of the RAS, Moscow, Russia 2 M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
Регуляция процессов роста и развития женских половых клеток является одной из консервативных функций серото-нина, но конкретные механизмы реализации этих функций пока остаются нераскрытыми.
Цель работы — методами ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени провести молекулярно-генетическое исследование наличия мРНК всех компонентов серотонинергической системы и динамики их экспрессии в клетках гранулезы на разных стадиях фолликулогенеза и в желтых телах. мРНК генов ферментов триптофангидроксилазы Tph1, декарбоксилазы ароматических аминокислот Ddc и моно-аминоксидазы Maoa, мембранного транспортера Sert и везикулярного транспортера Vmat2, а также рецепторов серо-тонина Htrlb, Htrld, Htr2a, Htr2b, Htr5b и Htr7 выявлялась в исследуемых пробах. Количественное исследование показало, что экспрессия генов Vmat2, Htr1b, и Htr7 более выражена на ранних стадиях фолликулогенеза, тогда как экспрессия Vmat1 растет в ходе развития фолликула. При лютеинизации происходит увеличение количества мРНК генов Ddc, Maoa, Vmat1 и Htr1b, тогда как экспрессия генов Vmat2 и Htr7, наоборот, падает. Наличие экспрессии ключевых компонентов серотонинергической системы и ее динамика позволяют полагать, что они вовлечены в серо-тонинергическую регуляцию процессов фолликулогенеза, а также лютеинизации.
Ключевые слова: фолликулогенез, лютеинизация, гранулеза, желтое тело, мышь, ПЦР в реальном времени, серотонин.
Regulation of the growth and development of female sex cells is one of the conservative functions of serotonin, but their specific mechanisms remain undisclosed yet. Molecular-genetic study of the presence of all components of the serotonergic system and dynamics of their expression in granulosa cells at different stages of folliculogenesis and in corpus luteum was carried out by reverse transcription with PCR and real-time PCR. Transcripts of enzymes tryptophan hydroxylase Tph1, aromatic amino acids decarboxylase Ddc and monoamine oxidase Maoa, membrane serotonin transporter Sert and vesicular monoamine transporter Vmat2, as well as serotonin receptors Htr1b, Htr1d, Htr2a, Htr2b, Htr5b and Htr7 are detected in probes investigated. A quantitative study revealed that the expression of Vmat2, Htr1b, and Htr7 genes is greater in the early stages of folliculogenesis, whereas the expression of the Vmat1 gene grows by the late stages of follicular development. The relative quantity of the mRNA of the Ddc, Maoa, Vmat1 and Htr1b genes increases during luteinization, while the expression of the Vmat2 and Htr7 genes, on the contrary, decreases. The presence of expression of key components of the serotonergic system and its dynamics allow as to suggest that they are involved in serotonergic regulation of folliculogenesis, as well as luteinization.
Keywords: folliculogenesis, luteinization, granulosa, corpus luteum, mouse, real-time PCR, serotonin.
введение
Являясь одним из классических нейротранс-миттеров, серотонин обладает целым спектром регуляторных функций вне нервной системы, как в эмбриональном развитии, так и во взрослом организме [1]. В частности, для многих животных, в том числе млекопитающих [2—4], показано участие серотонина в регуляции процессов роста и созревания женских половых клеток. Серотонин в физиологических концентрациях определяется в яичниках млекопитающих, в изолированных ооци-тах и клетках кумулюса [5], а также в фолликулярной жидкости [6]. На различных моделях показано, что серотонин обладает активирующим действием на функционирование фолликулярных клеток. У хомячков и крыс серотонин стимулирует синтез эстради-ола в преовуляторных фолликулах, культивируемых in vitro, а специфические антагонисты серотони-новых рецепторов устраняют этот эффект [2, 3]. Активирующий эффект серотонина наблюдается и на клетках гранулезы человека [7, 8]. У мышей
e-mail: denisnikishin@gmail.com
с нокаутом гена транспортера серотонина Sert угнетена экспрессия ароматазы Cyp19a1 и, как следствие, уменьшается содержание эстрадиола в крови. Аналогичный эффект вызывает специфический ингибитор обратного захвата серотонина пароксетин [9]. Сходные результаты получены и на других модельных объектах, например, у самок костистой рыбы Danio rerio ингибитор обратного захвата серотонина флуоксетин приводит к уменьшению количества икры и содержания эстрадиола в яичниках, а также к снижению уровня экспрессии мРНК овариальной ароматазы и рецепторов к гонадотропным гормонам [10].
Конкретные механизмы функционирования серо-тонинергической сигнальной системы в компонентах овариальных фолликулов описаны в литературе далеко не полно. Данных о динамике экспрессии компонентов серотонинергической системы в развивающемся овариальном фолликуле фактически нет, так как большая часть работ выполнена на фолликулярных клетках, выделенных из преовуляторных фолликулов, или ооцит-кумулюсных комплексах [5, 11].
С целью решения этих вопросов, и для устранения имеющихся пробелов нами был выполнена полная оценка экспрессии мРНК всех компонентов серото-нинергической системы в фолликулярных клетках, исследована динамика их экспрессии в ходе фолли-кулогенеза, а также при лютеинизации.
Материал и методы
В работе использовали 30 самок мышей-гибридов Р1 линий С57В1_/Би и СВА/и в возрасте 2 мес. Содержание животных в одинаковых стандартных условиях вивария и проведение экспериментов осуществлялись в соответствии с международными правилами гуманного обращения с лабораторными животными [12]. Получение материала проводили с применением стандартных методик [13], отдельной пробой являлись клетки, полученные из яичников одной самки. Яичники препарировали в среде 1_-15 (81дта-А!СпсЬ, США) под контролем стереомикроскопа. Первичные многослойные фолликулы размером 100-175 мкм изолировали механически двумя острыми иглами и диссоциировали на клетки в растворе 1 мг/мл коллагена-зы I (81дта-А!СпсЬ, США) и 100 мкг/мл ДНКазы I (81дта-А!СпсЬ, США) в течение 30 мин. при 37°С и 5% С02. Клетки гранулезы из антральных и пре-овуляторных фолликулов размером 200—250 мкм и 400—450 мкм, соответственно, получали посредством пункции тонкой иглой. Желтые тела выделяли микрохирургически из яичников беремен-
ных (5,5 сут.) самок. Положительным контролем служила РНК, выделенная из целого плода на 18 день эмбрионального развития.
Тотальную РНК из полученных проб выделяли с использованием TRI Reagent (Sigma-Aldrich, США) и обрабатывали ДНКазой I (Fermentas, США), согласно протоколам фирм-производителей. Библиотеки кДНК синтезировали с помощью набора реактивов «MMLV RT kit» (Евроген, Россия), используя рандомные гексаолигонуклеотиды и 2 мкг РНК в качестве матрицы. ПЦР проводили на амплифика-торе T100 (BIO RAD, США) с применением готовой смеси для ПЦР «ScreenMix-HS» (Евроген, Россия). Продукты ПЦР анализировали с помощью агарозно-го гель-электрофореза и системы видеорегистрации «Взгляд» (Хеликон, Россия). ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием коммерческой смеси qPCR-HS SYBR + LowROX (Евроген, Россия) и программного обеспечения 7500 Software (Applied Biosystems, США). Относительную экспрессию генов рассчитывали методом dCt [14], контрольный ген — Hprt. Специфические олигону-клеотиды для проведения ПЦР (табл.) подбирали с помощью сервиса NCBI Primer-BLAST с учетом эк-зон-интронной структуры генов.
Каждый эксперимент был проведен в пяти по-вторностях. Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Graphpad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., США) с применением IJ-критерия Манна — Уитни.
Таблица. Специфические олигонуклеотиды для проведения ПЦР. Температура отжига для всех праймеров 60^
Название гена NCBI GeneID Последовательности прямых (f) и обратных (r) праймеров (5->3) Длина продукта ПЦР, пн
Tph1 f TGCGACATCAGCCGAGAACAGT 162
21990 r GGCGCAGAAGTCCAGGTCAGA
Tph2 f CATGGCTCCGACCCCCTCTACA 219
216343 r ATACGCCCGCAGTTGACCCTCTT
Ddc f TCCCCACGGCTAGCTCATACCC 133
13195 r TTCCCCAGCCAGTCCATCATCA
Sert (Slc6a4) f GGGAGACCTGGGGCAAGAAG 182
15567 r CAGGGCGAGCTCCATGTAGAAGA
Vmat1 (Slc18a1) f AGAGGCCCACGAAGGAGTT 180
110877 r TGCCCAGAGGAGAGGAAAGT
Vmat2 (Slc18a2) f CCACTGTCCAGCTCCTCACCAACC 149
214084 r GGCGATCAGCAGGAAGGCATAGC
Maoa f GCTGAGGAATGGGACAAGATAACC 166
17161 r TACCTCCACACTGCCTCACATACC
Htr1a f TGCCCAGCGAATCAGGAG 374
15550 r GCCAAAGACCGAGCCAATAA
Htr1b f GACCCGAGCCCAGTTGATA 170
15551 r TAGCGGCCATGAGTTTCTTC
Htr1d f ACCCGCACCTGGAACTTT 188
15552 r CAGACGGCCGCAATCAT
Htr1f f CCAAGGAACTAGCCGTGATGATGA 396
15557 r AGGGTAGTGGCTGCTTTGCGTTCT
Htr2a f GAAAATCATTGCGGTGTGGAC 168
15558 r ATGATGGTTAGGGGGATGAAAAA
Окончание таблицы.
Название гена NCBI GenelD Последовательности прямых (f) и обратных (r) праймеров (5->3) Длина продукта ПЦР, пн
Htr2b f GAGGGACAGGGGCATACAGT 401
15559 r CAATCGGCATCACAAACAATC
Htr2c f GTGCTATTTTCAACTGCGTCCATC 200
15560 r AACACTTTGCTTTCGTCCCTCAG
Htr3a f TGGCGATCACCGGAAGAAGT 200
15561 r AGGAAGATACTGGGCAGCAAGAGG
Htr4 f TACCACAGCATCGATCTTTCACCT 132
15562 r ACCCAGCAGCCTCCCAACATT
Htr5a f GCAAGCGTGTCTCCAATGTGATGA 276
15563 r GGGTACGGGGGAGACGCTGTT
Htr5b f CCTCTGGCGGTGGTGCTCTTC 157
15564 r CTCGGCGACGGGCTGTGA
Htr6 f AACTGGGCAAAGCTCGAACATCTG 192
15565 r CCGTAGCCGTGCCCGTGGTGAG
Htr7 f TCCCGTCTAGGCTTTGTGGTA 161
15566 r TGTTCGCTGATGACTGGTTTCT
Hprt f GCTGAGGCGGCGAGGGAGAG 148
15452 r GCTAATCACGACGCTGGGACTGC
Результаты
В результате ОТ-ПЦР исследования экспрессии всех основных компонентов серотонинергиче-ской сигнальной системы было обнаружено, что в клетках гранулезы преовуляторных фолликулов и желтых телах экспрессируется мРНК ферментов триптофангидроксилазы Tph1, декарбоксилазы ароматических аминокислот Ddc и моноаминокси-дазы Maoa, транспортеров Sert, Vmat1 и Vmat2,
рецепторов серотонина Htг1Ь, Htr1d, Htr2a, ^г2Ь, ^г5Ь и ^г7 (рис. 1). мРНК генов Tph2, Htr1a, Htr1f, , Htr3a, Htг4, Htr5a и Htr6 не детек-
тировалась в исследуемых пробах. Для выявления динамики экспрессии мРНК генов серотонинерги-ческой системы в ходе фолликулогенеза и оценки изменения их экспрессии при лютеинизации был проведен количественный анализ методом ПЦР в реальном времени (рис. 2).
Рис. 1. Экспрессия компонентов серотонинергической системы в клетках гранулезы (КГ) развивающегося овариального фолликула и желтом теле (ЖТ). Положительный контроль — эмбрион 18 дней внутриутробного развития (Е18), отрицательный контроль — ПЦР без матрицы (-). Контрольный ген домашнего хозяйства — гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза Hpгt
Рис. 2. Динамика экспрессии компонентов серотонинергической системы (светло-серые) и маркеров функциональной активности фолликулярных клеток (темно-серые) в клетках гранулезы в ходе фолликулогенеза и при лютеинизации: ПМФ — первичные многослойные фолликулы, АФ — антральные фолликулы, ПОФ — преовуляторные фолликулы, ЖТ — желтое тело. Относительная экспрессия (RQ) генов нормирована по гену домашнего хозяйства Hprt. Статистическая значимость различий: * p<0,1; ** p<0,05
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ряд генов серотонинергической системы: Tph1, Ddc, Maoa, Sert, Htrld, Htr2a, Htr2b - не обладают выраженной динамикой экспрессии в ходе фолликулярного роста. Это справедливо и для генов рецептора фолликулостимулирующего гормона Fshr и гена Star. При этом для мРНК гена Vmatl наблюдается тенденция к увеличению количества на поздних стадиях, что характерно для таких маркеров функционального состояния фолликулярных клеток, как рецептор лютеинизирующего гормона Lhcgr и ключевые ферменты синтеза стероидных гормонов Cyp11a1 и Cyp19a1. В то же время, относительное количество мРНК генов Vmat2, Htr1b и Htr7 уменьшается в ходе фолликулогенеза. Такая же динамика прослеживается для маркера пролиферации Mki67. В желтых телах, по сравнению с клетками гранулезы преовуляторного фолликула, экспрессия генов Tph1, Sert, Htr1d, Htr2a и Htr2b значимо не изменяется, а для генов Htr1b, Maoa, Vmat1, Ddc наблюдается увеличение относительной экспрессии, как и в случае классических маркеров лютеинизации Lhcgr, Star, Cyp11a1. Количество мРНК генов Htr7, Vmat2, так же, как и маркеров функционального состояния фолликулярных клеток Mki67, Cyp19a1 и Fshr, уменьшается при лютеинизации.
обсуждение
В фолликулярных клетках развивающегося ова-риального фолликула экспрессируется целый ряд компонентов серотонинергической системы, которые могут составить функционально полноценную сигнальную систему. Ранее показана экспрессия отдельных компонентов серотонинергической системы для клеток кумулюса, выделенных из ооцит-кумулюсных комплексов, и культур клеток гранулезы [15]. В нашей работе мы подтвердили литературные данные и провели полную проверку экспрессии всех компонентов серотонинергической системы, результаты которой позволяют полагать, что в фолликулярных клетках активны системы мембранного и везикулярного транспорта, деградации и рецепции серотонина, а в желтых телах, возможно, появляется синтез трансмиттера.
Динамика экспрессии гена является важным показателем его функциональной активности. Выраженные изменения уровня экспрессии гена могут свидетельствовать о его функциональной активности на той или иной стадии. Так, в ходе фолликулярного роста наблюдается активация синтеза эстрогенов, которая сопровождается увеличением количества мРНК генов Cyp11a1 и Cyp19a1, кодирующих сте-роидогенные ферменты. Также увеличивается экспрессия гена рецептора лютеинизирующего гормона Lhcgr, играющего важную роль на поздних стадиях фолликулогенеза. Ген везикулярного транспортера моноаминов Vmat1 обладает такой же динамикой экспрессии, что может указывать на его роль в регуляции стероидогенной активности фолликулярных клеток на поздних стадиях фолликулогенеза. В то же время, для ранних стадий фолликулярного роста характерна повышенная способность фолликулярных клеток к пролиферации, которой сопутствует увеличенная экспрессия мРНК меркера Mki67. Везикулярный транспортер моноаминов Vmat2 и рецепторы
серотонина Htrlb и Htr7 экспрессируются на более высоком уровне в первичных фолликулах, что может говорить о возможной роли этих генов в регуляции пролиферативной активности клеток гранулезы на ранних стадиях фолликулогенеза. В пользу этого предположения говорит то, что серотонин является регулятором пролиферативной активности различных типов клеток, как в норме, так и при патологиях [16-18].
В норме после овуляции фолликулярные клетки достигают терминальной стадии дифференциров-ки и становятся большими клетками желтого тела. Преждевременная лютеинизация известна как одна из причин бесплодия [19] и считается негативным явлением при культивировании клеток гранулезы [20]. Процесс лютеинизации сопряжен с изменением уровня экспрессии ряда генов [21]. Активация усиленного синтеза прогестерона происходит на фоне увеличения экспрессии генов Cyp11a1 и Star, а также рецептора к лютеинизирующему гормону и хорионическому гонадотропину Lhcgr. В то же время в желтом теле увеличивается экспрессия таких компонентов серотонинергической ситемы, как Ddc, Vmatl, Maoa, Htrlb, которые, по всей вероятности, играют роль в функционировании желтого тела. В то же время экспрессия ряда генов, наоборот, падает при лютеинизации - это характерно для ароматазы Cyp19a1, рецептора Fshr и маркера пролиферации Mki67. Такую же картину мы видим для Vmat2 и Htr7. Именно эти гены можно считать возможными эффекторами серотонинергической регуляции функционального состояния фолликулярных клеток во время фолликулогенеза.
Полученные данные отражают динамику экспрессии мРНК, однако регуляция экспрессии и активности генов может происходить на последующих стадиях трансляции и посттрансляционных модификаций. Безусловно, активность генов серотонинергической системы на тех или иных стадиях фолликулогенеза в последующем необходимо подтвердить, используя методы выявления белка. Тем не менее, мы видим, что в ходе фолликулярного роста и при лютеиниза-ции экспрессируются гены ряда компонентов серо-тонинергической сигнальной системы. Отдельные ее компоненты, а именно Vmat1, Vmat2, Htr1b, Htr2b, Htr7, обладают выраженной динамикой экспрессии мРНК в ходе фолликулярного роста, что указывает на их возможную роль в качестве регуляторов функционального состояния фолликулярных клеток на той или иной стадии фолликулогенеза. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о перестройке серотонинергической системы, происходящей во время лютеинизации. Ряд генов, такие как Ddc, Maoa, Vmat1, Htr1b, можно считать количественными маркерами лютеинизации и использовать для контроля этого процесса в работах по культивированию фолликулярных клеток. При этом гены Vmat2 и Htr7, напротив, являются маркерами фолликулярной стадии.
Благодарности
Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП ИБР им. Н.К. Кольцова РАН, при финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-34-60250 мол_а_дк и гранта Президента Российской Федерации МК-1304.2017.4.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бузников Г.А. Донервные трансмиттеры как регуляторы эмбриогенеза. Современное состояние проблемы. Онтогенез 2007; 38(4): 262-70.
2. Terranova P.F., Uilenbroek J.T., Saville L. et al. Serotonin enhances oestradiol production by hamster preovulatory follicles in vitro: effects of experimentally induced atresia. J. Endocrinol. 1990; 125(3): 433-8.
3. Tanaka E., Baba N., Toshida K. et al. Serotonin stimulates steroidogenesis in rat preovulatory follicles: involvement of 5-HT2 receptor. Life Sci. 1993; 53(7): 563-70.
4. Sheng Y., Wang L., Liu X.S.J. et al. A serotonin receptor antagonist induces oocyte maturation in both frogs and mice: evidence that the same G protein-coupled receptor is responsible for maintaining meiosis arrest in both species. J. Cell. Physiol. 2005; 202(3): 777-86.
5. Amireault P., Dubé F. Serotonin and its antidepressant-sensi-tive transport in mouse cumulus-oocyte complexes and early embryos. Biol. Reprod. 2005; 73(2): 358-65.
6. Bodis J., Bognàr Z., Hartmann G. et al. Measurement of nor-adrenaline, dopamine and serotonin contents in follicular fluid of human graafian follicles after superovulation treatment. Gynecol. Obstet. Invest. 1992; 33(3): 165-7.
7. Koppan M., Bodis J., Verzar Z. et al. Serotonin may alter the pattern of gonadotropin-induced progesterone release of human granulosa cells in superfusion system. Endocrine 2004; 24(2): 155-9.
8. Graveleau C., Paust H.J., Schmidt-Grimminger D. et al. Presence of a 5-HT7 receptor positively coupled to adenylate cyclase activation in human granulosa-lutein cells. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000; 85(3): 1277-86.
9. Zha W., Ho H.T.B., Hu T. et al. Serotonin transporter deficiency drives estrogen-dependent obesity and glucose intolerance. Sci. Rep. 2017; 7(1): 1137.
10. Lister A., Regan C., Van Zwol J. et al. Inhibition of egg production in zebrafish by fluoxetine and municipal effluents: A mechanistic evaluation. Aquat. Toxicol. 2009; 95(4): 320-9.
11. Amireault P., Dube F. Intracellular cAMP and calcium signaling by serotonin in mouse cumulus-oocyte complexes. Mol. Pharmacol. 2005; 68(6): 1678-87.
12. Европейская конвенция об охране позвоночных животных, используемых для экспериментов и в других научных целях (ETS №123). Страсбург, 18 марта 1986 года, http://conventions.coe.int / Treaty /EN/Treaties /PDF/123-Arev.pdf.
13. Дыбан А.П., Пучков В.Ф., Баранов В.С. и др. Лабораторные млекопитающие: мышь Mus musculus, крыса Rattus norvegicus, кролик Oryctolagus cuniculus, хомячок Cricetus griseous. В: Баку-лина Э.Д., Баранов В.С., Белорусов Л.В. и др., редакторы. Объекты биологии развития. М.: Наука; 1975. с. 505-66.
14. Bookout A.L., Cummins C.L., Mangelsdorf D.J. et al. High-throughput real-time quantitative reverse transcription PCR. In: Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. et al., editors. Current Protocols in Molecular Biology. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc.; 2006. Chapter 15: Unit 15.8.
15. Dube F., Amireault P. Local serotonergic signaling in mammalian follicles, oocytes and early embryos. Life Sci. 2007; 81(25-6): 1627-37.
16. Yavarone M.S., Shuey D.L., Tamir H. et al. Serotonin and cardiac morphogenesis in the mouse embryo. Teratology 1993; 47(6): 573-84.
17. Azmitia E.C. Modern views on an ancient chemical: serotonin effects on cell proliferation, maturation, and apoptosis. Brain Res. Bull. 2001; 56(5): 413-24.
18. Siddiqui E.J., Thompson C.S., Mikhailidis D.P. et al. The role of serotonin in tumour growth (review). Oncol. Rep. 2005; 14(6): 1593-7.
19. Van Kasteren Y.M., Schoemaker J. Premature ovarian failure: A systematic review on therapeutic interventions to restore ovarian function and achieve pregnancy. Hum. Reprod. Update 1999; 5(5): 483-92.
20. Myers M., van den Driesche S., McNeilly A.S. et al. Activin A reduces luteinisation of human luteinised granulosa cells and has opposing effects to human chorionic gonadotropin in vitro. J. Endocrinol. 2008; 199(2): 201-12.
21. Sugino N. Molecular mechanisms of luteinization. Obstet. Gynecol. Sci. 2014; 57(2): 93-101.
Поступила: 13.07.2017