CC BY
4
Original article
ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ И ГИГИЕНИЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ
https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-1-83-86
PREVENTIVE TOXICOLOGY AND HYGIENIC STANDARTIZATION
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Читать онлайн
Каримов Д.О., Мухаммадиева Г.Ф., Бакиров А.Б., Зиатдинова М.М., Валова Я.В., Кудояров Э.Р., Хуснутдинова Н.Ю., Якупова Т.Г.
Динамика экспрессии гена супероксиддисмутазы-1 при разных видах лекарственной коррекции токсических нарушений в печени
ФБУН «Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека», 450106, Уфа, Россия
Введение. Для предотвращения развития токсических повреждений печени необходимы лекарственные средства, препятствующие окислительному стрессу. Актуальным и перспективным является использование анализа изменения экспрессии генов под влиянием препаратов для оценки эффективности их применения, а также для выявления молекулярно-генетических механизмов развития гепатотоксичности.
Цель исследования — изучение изменения экспрессии гена Sodl в паренхиме печени крыс при интоксикации тетрахлорметаном с последующей терапией с помощью гепатопротекторов оксиметилурацил (ОМУ), «Мексидол» и «Гептор».
Материалы и методы. Эксперимент поставлен на 70 особях беспородных белых крыс мужского пола. Контрольная группа получала подкожно оливковое масло; 1-я опытная группа — подкожно тетрахлорметан (ТХМ); 2-я опытная группа — ТХМи внутрибрюшинно «Гептор»; 3-я опытная группа — ТХМ и подкожно «Мексидол»; 4-я опытная группа — ТХМ и перорально ОМУ. Забор материала проводили в два временных промежутка: 24 и 72 ч. Анализ экспрессии изучаемого гена проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Результаты. Применение всех трёх препаратов через 72 ч приводило к снижению уровня экспрессии гена Sodl при окислительном стрессе, вызванном ТХМ. Наибольшее влияние на транскрипционную активность гена Sodl оказывал ОМУ.
Ограничения исследования обусловлены методологией проводимого анализа: поскольку экспрессия оценивалась методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, мы оценивали транскрипционную активность гена без учёта дальнейшей посттранскрипционной регуляции экспрессии. Заключение. Результаты исследования свидетельствуют о способности изученных гепатопротекторов подавлять экспрессию гена Sodl в печени крыс при воздействии ТХМ. Можно предположить, что изученные препараты через изменение экспрессии гена Sodl могут участвовать в регуляции свободнорадикальных процессов при патологии печени.
Ключевые слова: токсические поражения печени; гепатопротекторы; тетрахлорметан; экспрессия; ген Sodl
Соблюдение этических стандартов. Исследование одобрено биоэтической комиссией ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека», проведено в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123), директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/EC от 22.09.2010 г. о защите животных, использующихся в научных целях.
Для цитирования: Каримов Д.О., Мухаммадиева Г.Ф., Бакиров А.Б., Зиатдинова М.М., Валова Я.В., Кудояров Э.Р., Хуснутдинова Н.Ю., Якупова Т.Г. Динамика экспрессии гена супероксиддисмутазы-1 при разных видах лекарственной коррекции токсических нарушений в печени. Гигиена и санитария. 2022; 101(1): 83-86. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-1-83-86
Для корреспонденции: Каримов Денис Олегович, канд. мед. наук, зав. отд. токсикологии и генетики с экспериментальной клиникой лабораторных животных ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека», 450106, Уфа. E-mail: [email protected]
Участие авторов: Каримов Д.О., Мухаммадиева Г.Ф. — концепция и дизайн исследования, написание текста; Бакиров А.Б. — концепция и дизайн исследования, редактирование; Зиатдинова М.М., Кудояров Э.Р., Хуснутдинова Н.Ю., Якупова Т.Г. — сбор и обработка материала; Валова Я.В. — статистическая обработка данных. Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Поступила: 01.09.2021 / Принята к печати: 25.11.2021 / Опубликована: 09.02.2022
Denis O. Karimov, Guzel F. Mukhammadiyeva, Akhat B. Bakirov, Munira M. Ziatdinova, Yana V. Valova, Eldar R. Kudoyarov, Nadezhda Yu. Khusnutdinova, Tatyana G. Yakupova
Dynamics of superoxide dismutase-1 gene expression in different types of drug correction of toxic disorders in the liver
Ufa Research Institute of Occupational Health and Human Ecology, Ufa, 450106, Russia
Introduction. Drugs are needed to counteract oxidative stress to prevent toxic liver damage. Relevant and promising is the use of analysis of changes in gene expression under the influence of drugs to assess the effectiveness of their use and identify the molecular genetic mechanisms of the development of hepatotoxicity. The purpose of this study was to examine the effect of the drugs "Heptor", "Mexidol", and "Oxymethyluracil" (OMU) on the level of expression of the Sodl gene in the liver of rats with carbon tetrachloride lesion of the liver.
Material and methods. The experiment was performed on 70 male outbred white rats. The control group received olive oil subcutaneously; first experimental group — subcutaneous carbon tetrachloride (CTC); second experimental group — CTC and intraperitoneal "Heptor"; third experimental — CTC and subcutaneous "Mexidol"; fourth experimental — CTC and oral OMU. The material was collected at two-time intervals, 24 and 72 hours. To analyze the expression of the studied gene, quantitative RT-PCR in real-time mode was carried.
Results. The use of all three drugs after 72 h resulted in a decrease in the Sodl gene expression level under oxidative stress induced by CTC. OMU exerted the most significant influence on the transcriptional activity of the Sodl gene.
Limitations. The limitations of the study are due to the methodology of the analysis: since expression was evaluated by quantitative RT-PCR in real time, we evaluated the transcriptional activity of the gene without taking into account further post-transcriptional regulation of expression.
Оригинальная статья
Conclusion. The study results indicate the ability of the studied hepatoprotectors to suppress the expression of the Sod1 gene in rat liver when exposed to CTC. It can be assumed that the studied drugs, through a change in the expression of the Sod1 gene, can participate in the regulation offree radical processes in liver damage.
Keywords: toxic liver damage; hepatoprotectors; carbon tetrachloride; expression; gene Sod1
The conclusion of the committee on biomedical ethics: the study was approved by the bioethical commission of the Ufa Research Institute of Occupational Medicine and Human Ecology, conducted under the European Convention for the Protection ofVertebrate Animals Used for Experiments or Other Scientific Purposes (ETS N 123), Directive of the European Parliament and Council of the European Union 2010/63/EU of 22.09.2010 on the protection of animals used for scientific purposes.
For citation: Karimov D.O., Mukhammadiyeva G.F., Bakirov A.B., Ziatdinova M.M., Valova Ya.V., Kudoyarov E.R., Khusnutdinova N.Yu., Yakupova T.G. Dynamics of superoxide dismutase-1 gene expression in different types of drug correction of toxic disorders in the liver. Gigiena i Sanitariya (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2022; 101(1): 83-86. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-1-83-86 (In Russian)
For correspondence: Denis O. Karimov, MD, PhD, Head of the Department for Toxicology and Genetics with The Experimental Clinics for Laboratory Animals, Ufa Research Institute of Occupational Health and Human Ecology, Ufa, 450106, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Information about the authors:
Karimov D.O., https://orcid.org/0000-0003-0039-6757 Mukhammadiyeva G.F., https://orcid.org/0000-0002-7456-4787 Bakirov A.B., https://orcid.org/0000-0003-3510-2595 Ziatdinova M.M., https://orcid.org/0000-0002-1848-7959 Valova Ya.V., https://orcid.org/0000-0001-6605-9994 Kudoyarov E.R., https://orcid.org/0000-0002-2092-1021
Yakupova T.G., https://orcid.org/0000-0002-1236-8246 Khusnutdinova N.Yu., https://orcid.org/0000-0001-5596-8180
Contribution: Karimov D.O., Mukhammadiyeva G.F. — research concept and design, writing the text. Bakirov A.B. — research concept and design, editing. Ziatdinova M.M.,
Kudoyarov E.R., Khusnutdinova N.Yu., Yakupova T.G. — collection and processing of material. Valova Ya.V. — statistical data processing. All co-authors — approval of the final
version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article.
Acknowledgements. The study had no sponsorship.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received: September 1, 2021 / Accepted: November 25, 2021 / Published: February 09, 2022
Введение
Печень, являясь важнейшим органом, обезвреживающим химические вещества, оказывается основной мишенью их токсического действия. С каждым годом отмечается рост числа токсических поражений печени различной этиологии [1, 2]. Одна из ключевых ролей в патогенезе данных патологий отведена оксидативному стрессу с формированием избытка свободных радикалов, приводящих к повреждению и гибели гепатоцитов [3]. Для изучения механизмов гепатотоксично-сти и поиска новых гепатопротекторов используется большое число экспериментальных моделей на животных. Однако тетрахлорметановая модель токсического поражения печени является одной из наиболее распространённых [4]. Гепатотоксичность тетрахлорметана (ТХМ) в значительной степени обусловлена его промежуточными продуктами метаболизма, такими как трихлорметильный (СС13) и трихлор-метилпероксильный (СС1300) свободные радикалы [5]. Эти радикалы могут связываться с белками и липидами клеточной мембраны и запускать перекисное окисление липидов, которое вызывает повреждение печени [6].
К одному из ключевых элементов защиты организма от окислительного стресса относятся супероксиддисмута-зы — семейство металлсодержащих белков, метаболизиру-ющих супероксидные радикалы. Фермент купроэнзим ци-тозоля Си/7и-супероксиддисмутаза (СОД1), кодируемый геном Sod1, участвует в антиоксидантной защите тканей, нейтрализуя активные формы кислорода. Он содержится в основном в цитоплазме клеток, но был найден также в межмембранном пространстве митохондрий печени крыс [7]. Известно, что истощение антиоксидантных ферментов при воздействии ТХМ не только вызывает окислительный стресс, но также вызывает нарушение структуры и функции ферментов [8]. Многочисленные исследования указывают на всё больший интерес к использованию антиоксидантов в качестве терапевтических средств для снижения повышенного окислительного стресса при различных заболеваниях и патофизиологических расстройствах [9]. Свободнорадикальная концепция поражения печени обосновывает использование в гепатологии многих препаратов с антиоксидантной активностью. Вместе с тем для лучшего понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе поражения печени, а также для оценки эффективности применения лекарственных средств необходимо проводить анализ экспрессии генов, вовлечённых в антиоксидантную защиту.
Цель работы — изучение изменения экспрессии гена Sod1 в паренхиме печени крыс при интоксикации тетрахлормета-ном с последующей терапией с помощью гепатопротекторов оксиметилурацил (ОМУ), «Мексидол» и «Гептор».
Материалы и методы
Экспериментальная работа была проведена на 70 особях белых беспородных крыс мужского пола, с массой тела от 170 до 200 г. Крысы содержались в виварии в стандартных условиях. Все животные были поделены на 5 экспериментальных групп по 14 особей. Контрольной группе вводили подкожно оливковое масло. Группе положительного контроля вводили подкожно 50% ТХМ в оливковом масле в дозе 2 г/кг массы тела. В группе лечения препаратом «Гептор» крысам вводили подкожно 50% ТХМ в оливковом масле в дозе 2 г/кг массы тела и внутрибрюшинно «Гептор» в дозе 72 мг/кг массы тела. В группе лечения препаратом «Мексидол» крысам вводили подкожно 50% ТХМ в оливковом масле в дозе 2 г/кг массы тела и подкожно «Мексидол» в дозе 50 мг/кг массы тела. В группе лечения препаратом ОМУ крысам вводили подкожно 50% ТХМ в оливковом масле в дозе 2 г/кг массы тела и перорально ОМУ в дозе 50 мг/кг массы тела. Все лекарственные препараты вводили предварительно за 1 ч до введения токсиканта. Забор материала проводили после декапитации под наркозом с углекислым газом через 24 и 72 ч после введения токсикантов. При содержании и забое крыс соблюдались все правила и нормы по этическому и гуманному отношению к животным.
Образцы печени растирали в жидком азоте. Затем заливали ExtractRNA («Евроген», Россия), после чего выделяли РНК, согласно инструкции производителя. На полученной РНК синтезировали кДНК с помощью MMLV Rt kit («Евроген», Россия), согласно инструкции. Анализ экспрессии изучаемого гена Sod1, а также референтного гена Gapdh проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия).
Проверку данных на нормальность распределения проводили с использованием критерия Колмогорова—Смирнова. При статистической обработке результатов применяли од-нофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), ¿-критерий Стьюдента. Пороговое значение уровня значимости принимали равным 0,05. Расчёты проводили с использованием пакета программ Statistics 21.0 (IBM, США).
https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-1-83-86
PREVENTIVE TOXICOLOGY AND HYGIENIC STANDARTIZATION
Original article
Результаты
Мы сравнили действие трёх препаратов — «Гептор», «Мексидол» и ОМУ — на транскрипционную активность гена Боё1 в печени крыс. Статистические данные, полученные в результате эксперимента, представлены на рис. 1 и 2 в виде кратности изменения экспрессии исследуемого гена. Данные по эксперименту спустя 24 ч показаны на рис. 1. Представленные данные свидетельствуют о том, что через 24 ч введение ТХМ сопровождалось значимым снижением кратности экспрессии гена Боё1 до —1,18 ± 0,18 по сравнению с контролем (р = 0,003). В группах, получавших препараты гепатопротекторов, через 24 ч происходило незначительное повышение экспрессии относительно группы положительного контроля (р > 0,05). Уровень экспрессии практически не отличался в разных группах, получавших гепатопротекто-ры; кратность экспрессии в группах, получавших «Гептор»,
«Мексидол» и ОМУ, составила -0,87 ± 0,17; -0,80 ± 0,21 и -0,74 ± 0,25 соответственно.
Вместе с тем несколько иным был профиль экспрессии гена Боё1 в печени крыс через более продолжительный период времени (72 ч) после воздействия ТХМ (см. рис. 2). Так, наблюдалось некоторое возрастание уровня транскрипции гена Боё1 до -0,63 ± 0,16 по сравнению с 24-часовым показателем (-1,18 ± 0,18), однако он оставался сниженным относительно показателя у животных контрольной группы, не достигнув при этом уровня статистической значимости (р = 0,060) (см. рис. 2). Наряду с этим применение всех трёх гепатопротек-торных препаратов через 72 ч сопровождалось уменьшением транскрипционной активности гена Боё1, однако в разной степени. Следует отметить, что наибольшее снижение уровня экспрессии по отношению к аналогичному показателю у крыс, получавших только ТХМ, отмечалось при использовании ОМУ, кратность экспрессии составила -1,24 ± 0,13 (р = 0,043).
о
1 N о m
$ s
5f
™ £ _d 2 н о
a ^
ra x a. <u ü x <u
(U
-2
Контроль ТХМ ТХМ + «Гептор» ТХМ + «Мексидол» ТХМ + ОМУ
Control Carbon Carbon Carbon tetrachloride + Carbon
tetraChloride tetrachloride + «Mexidol» tetrachloride +
«Heptor» oxymethyluracil
Рис. 1. Кратность экспрессии гена Sod1 при интоксикации ТХМ под влиянием гепатопротекторов через 24 ч. Fig. 1. The multiplicity of the Sod1 gene expression during carbon tetrachloride (CTC) intoxication under the influence of hepatoprotectors after 24 hours.
0
ш ra ^
ей
^ о c
m J. о
л 2 й
h- О W
Ü Ц QJ
§ <D 9-
Контроль Control
ТХМ + «Гептор» ТХМ + «Мексидол» ТХМ + ОМУ
Carbon Carbon tetrachloride + Carbon
tetrachloride + «Mexidol» tetrachloride +
«Heptor» oxymethyluracil
Рис. 2. Кратность экспрессии гена Sod1 при интоксикации ТХМ под влиянием гепатопротекторов через 72 ч. Fig. 2. The multiplicity of the Sod1 gene expression during CTC intoxication under the influence of hepatoprotectors after 72 hours.
Обсуждение
В данном исследовании анализ экспрессии гена Боё1, кодирующего фермент антиоксидантной системы защиты организма, выявил снижение содержания транскриптов данного гена через 24 ч после введения ТХМ. Это, по-видимому, свидетельствует об истощении антиоксидантной системы в условиях окислительного стресса, вызванного интоксикацией ТХМ. Установленный в настоящей работе характер изменения профиля экспрессии гена Боё1 в печени крыс при воздействии ТХМ согласуется с данными других авторов [10, 11]. Изменение активности генов антиоксидантных ферментов и, как следствие, повышение их транскрипционной активности может способствовать усилению окислительного стресса, что приводит к дополнительному повреждению клеток [12]. Недавние исследования показали тесную связь между окислительным стрессом и уровнем антиоксидантных ферментов [13].
В нашей работе показана способность исследованных препаратов подавлять экспрессию гена Боё1 в условиях токсического поражения печени ТХМ. Через 72 ч снижение кратности экспрессии исследуемого гена при применении гепатопротекторов, вероятно, происходит благодаря анти-оксидантным свойствам действующих веществ, входящих в состав препаратов, которые, очевидно, уменьшают нагрузку на антиоксидантные ферменты. Уменьшение активности гена Боё1 у животных, получавших ОМУ наряду с введени-
Оригинальная статья
ем ТХМ в этом эксперименте, может быть связано с непосредственным влиянием производного пиримидина — окси-метилурацила (5-гидрокси-6-метилурацил) на радикальные процессы окисления [14], способствующим предотвращению процессов, ведущих к повреждению клеток печени, в условиях окислительного стресса. Вместе с тем указанный эффект ОМУ, видимо, усиливается при более длительном воздействии препарата.
Ограничения исследования обусловлены методологией проводимого анализа, поскольку экспрессия оценивалась методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, мы оценивали транскрипционную активность гена без учёта дальнейшей посттранскрипционной регуляции экспрессии.
Заключение
Таким образом, полученные нами результаты демонстрируют, что применение препаратов «Гептор», «Мексидол» и ОМУ приводит к подавлению экспрессии гена Боё1 при окислительном стрессе, вызванном ТХМ. Причём наибольшее влияние на транскрипционную активность гена Боё1 оказывает ОМУ. Можно предположить, что изученные препараты через изменение экспрессии гена Боё1 могут участвовать в регуляции свободнорадикальных процессов при патологии печени.
Литература
(п.п. 3-13 см. References)
1. Королева М.В. Экзогенно-токсический гепатит. Современный взгляд на этиологию, патогенез, клиническое течение. Лекарственный вестник. 2015; 9(2): 18-22.
2. Авдеева М.Г., Кулбужева М.И., Колодько Е.И., Черникова Н.В., Запаш-няя О.В. Проблемы лечения токсического гепатита на фоне хронического вирусного поражения печени ЫСУ-этиологии. Клинический
пример успешной терапии. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2018; 23(1): 50-6. https://doi.org/10.18821/1560-9529-2018-23-1-50-56 14. Мышкин В.А., Еникеев Д.А., Срубилин Д.В., Гимадиева А.Р. Экспериментальная оценка производных пиримидина на моделях токсического поражения печени: обзор. Научное обозрение. Медицинские науки. 2016; (3): 88-98.
References
Koroleva M.V. Exogenous-toxic hepatitis. Modern view on the etiology, 8. pathogenesis, clinical course. Lekarstvennyy vestnik. 2015; 9(2): 18—22. (in Russian)
Avdeeva M.G., Kulbuzheva M.I., Kolod'ko E.I., Chernikova N.V., Zapashnyaya O.V. Problems of treatment of toxic hepatitis on the background of chronic viral lesion of HCV-etiology. Klinicheskiy primer 9. uspeshnoy terapii. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. 2018; 23(1): 50 — 6. https://doi.org/10.18821/1560-9529-2018-23-1-50-56 (in Russian) Li S., Tan H.Y., Wang N., Zhang Z.J., Lao L., Wong C.W., et al. The role of oxidative stress and antioxidants in liver diseases. Int. J. Mol. Sci. 2015; 16(11): 10. 26087-124. https://doi.org/10.3390/ijms161125942
Ingawale D.K., Mandlik S.K., Naik S.R. Models of hepatotoxicity and the underlying cellular, biochemical and immunological mechanism(s): a critical discussion. Environ. Toxicol. Pharmacol. 2014; 37(1): 118-33. 11. https://doi.org/10.1016/j.etap.2013.08.015
Nada S.A., Omara E.A., Abdel-Salam O.M., Zahran H.G. Mushroom insoluble polysaccharides prevent carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rat. Food Chem. Toxicol. 2010; 48(11): 3184-8. 12. https://doi.org/10.1016/j.fct.2010.08.019
Debnath S., Ghosh S., Hazra B. Inhibitory effect of Nymphaea pubescens Willd. flower extract on carrageenan-induced inflammation and CCl4- 13. induced hepatotoxicity in rats. Food Chem Toxicol. 2013; 59: 485-91. https://doi.org/10.1016/j.fct.2013.06.036
Okado-Matsumoto A., Fridovich I. Subcellular distribution of superoxide 14. dismutases (SOD) in rat liver: Cu,Zn-SOD in mitochondria. J. Biol. Chem. 2001; 276(42): 38388-93. https://doi.org/10.1074/jbc.M105395200
Szymonik-Lesiuk S., Czechowska G., Stryjecka-Zimmer M., S-tomka M., Madro A., Celinski K., et al. Catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activities in various rat tissues after carbon tetrachloride intoxication. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 2003; 10(4): 309-15. https:// doi.org/10.1007/s00534-002-0824-5
Aggarwal B.B., Harikumar K.B. Potential therapeutic effects of curcumin, the anti-inflammatory agent, against neurodegenerative, cardiovascular, pulmonary, metabolic, autoimmune and neoplastic diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2009; 41(1): 40-59. https://doi.org/10.1016Zj.biocel.2008.06.010 Manubolu M., Goodla L., Ravilla S., Thanasekaran J., Dutta P., Malmlof K., et al. Protective effect of Actiniopteris radiata (Sw.) Link. against CCU induced oxidative stress in albino rats. J. Ethnopharmacol. 2014; 153(3): 744-52. https://doi.org/10.1016/jjep.2014.03.040
Goodla L., Manubolu M., Pathakoti K., Jayakumar T., Sheu J.R., Fraker M., et al. Protective effects of Ammannia baccifera against CCl4-induced oxidative stress in rats. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2019; 16(8): 1440. https://doi.org/10.3390/ijerph16081440
Lee J., Koo N., Min D.B. Reactive oxygen species, aging, and
antioxidative nutraceuticals. Compr. Rev. Food Sci. F. 2004; 3(1): 21-33.
https://doi.org/10.1111/j.1541-4337.2004.tb00058.x
Rahal A., Kumar A., Singh V., Yadav B., Tiwari R., Chakraborty S., et al.
Oxidative stress, prooxidants, and antioxidants: the interplay. Biomed. Res.
Int. 2014; 2014: 761264. https://doi.org/10.1155/2014/761264
Myshkin V.A., Enikeev D.A., Srubilin D.V., Gimadieva A.R. Experimental
evaluation of pyrimidine derivatives using models of the toxically damaged
liver: a review. Nauchnoe obozrenie. Meditsinskie nauki. 2016; (3): 88-98.
(in Russian)
2
3.
4.
5.
6
7.
