CC BY
41
ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
УДК 591.176:597.812:591.52+535.24 ББК Е 664.7+Е 693.33
В. В. Джапова
аспирантка, Московский государственный университет (Москва, Россия), e-mail: dzhapova@list.ru С. М. Стародубов
кандидат биологических наук, Московский государственный университет (Москва, Россия), e-mail: smstarodubov@gmail.com
В. А. Голиченков
доктор биологических наук, профессор, Московский государственный университет
(Москва, Россия), e-mail: burlakovao@mail.ru
Динамика численности дермальных меланофоров у личинок Xenopus laevis на ранних стадиях развития
Личинок Xenopus laevis содержали в контейнерах объёмом 0,4 л на разных фонах (белый, серый и черный). Контейнеры находились в закрытом боксе с искусственным освещением белым светом продолжительностью 12 часов в сутки при температуре 24 оС. Наблюдения проводили ежедневно, определяли численность пигментных клеток на боковом участке туловища животных. Выделено два периода в развитии пигментных клеток на ранних стадиях развития, первый - с момента вылупления по 45 стадию включительно, в этот период происходят только диффе-ренцировки меланофоров из меланобластов, второй период начинается с 47 стадии, когда отмечаются отдельные митозы. Оценен вклад митозов и дифференцировок в динамику численности дермальных меланофоров у животных, содержавшихся на разных фонах. Впервые выявлено влияние фона на морфологическую реакцию пигментных клеток на ранних стадиях развития X. laevis.
Ключевые слова: Xenopus laevis, дифференцировка, митоз, дермальные ме-ланофоры.
V. V. Dzhapova
graduate student, Moscow State University (Moscow, Russia),
e-mail: dzhapova@list.ru
S. M. Starodubov
Candidate of Biology, Moscow State University (Moscow, Russia),
e-mail: smstarodubov@gmail.com V. A. Golichenkov
Doctor of Biology, professor, Moscow State University (Moscow, Russia),
e-mail: burlakovao@mail.ru
Number Dynamics of Dermal Melanophores in Xenopus laevis larvae at the Early Stages of Development
Xenopus laevis larvae were kept in containers of 0,4 liters on different backgrounds (white, gray and black). The containers were kept in a closed box with artificial white light for 12 hours a day at 24 0C. Observations were carried out daily with a focus on pigmentary cells number on a lateral part of the animals’ trunk. The authors differentiate two periods in pigmentary cells development at the early stages. The first one lasts from the moment of hatching up to 45 th stage. During this period there are only differentiations of melanophores from melanoblastes. The second period begins at 47th stage when separate mitoses take place. The study assesses the role of mitoses and differentiations for dermal melanophores number dynamics of animals that were kept on different backgrounds. For the first time, the authors reveal the influence of a background on the morphological reaction of pigmentary cells at the early stages of X. laevis development.
Keywords: Xenopus laevis, differentiation, mitosis, dermal melanophores.
© В. В. Джапова, С. М. Стародубов, В. А. Голиченков, 2012
Пигментная система бесхвостых амфибий и её основной структурный элемент -дермальный меланофор - удобная и наглядная модель онтогенеза. Меланофор способен митотически делиться, дифференцироваться, накапливая меланин, и перераспределять его в диспергированное или агрегированное состояние, адаптивно меняя окраску всего животного [1].
Адаптивные реакции пигментной систем делятся на физиологические и морфологические [10]. Физиологические реакции длятся от десятков секунд до 1-2 ч и происходят благодаря перераспределению пигмента внутри пигментных клеток: если пигментные гранулы концентрируются в середине клеток, занимая при этом небольшую площадь, то животные светлеют, а если пигмент распределяется по всей площади клеток, то животные темнеют. Морфологические реакции более длительные (дни и недели) и являются результатом изменения числа пигментных клеток и количества пигмента в них. Способность к делению и перераспределению пигмента связаны таким образом, что в состоянии дисперсии клетка может митотически делиться, а в состоянии агрегации нет. В свою очередь, распределение пигмента зависит от условий освещения, создаваемых падающим и отражённым светом.
Недифференцированные пигментные клетки - меланобласты ещё не способны синтезировать меланин. Начало их дифференцировки связано с синтезом меланина.
Головастики Xenopus laevis предоставляют возможность прижизненно in situ регистрировать как деление дермальных меланофоров, так и их дифференцировку из мелано-бластов. Прозрачная кожа личинок X. laevis позволяет проводить наблюдения за судьбой отдельных пигментных клеток в составе целого организма.
Наблюдения за развитием пигментных клеток в личиночный период развития X. laevis впервые проведены Ф. Пелеманном [8; 9]. Автор провёл сравнение еженедельных микрофотографий кожи туловища личинок на 52-59 стадиях развития. Согласно его данным за обозначенный период развития личинок основной прирост дермальных мела-нофоров произошел за счёт делений пигментных клеток. Ф. Пелеманн установил, что за 3 недели число меланофоров на выбранном участке увеличилось в 2,7 раза, причём около 70 % новых меланофоров возникло за счет митозов, а 30 % - за счёт дифференцировок из непигментированных меланобластов.
Наблюдения за динамикой терминальных дифференцировок и митотической активностью дермальных меланофоров проведены на 46-54 стадиях развития личинок шпорцевой лягушки [3]. Авторы проводили микросъемку личинок с промежутком в 2-3 дня в течение 25 суток. По их данным, темпы дифференцировки плавно возрастают с 46-47 до 51-52 стадий. Митотическая активность оказалась высокой на 49 стадии развития личинок в первой серии опытов и на 51-52 стадиях во второй серии опытов. При проведении экспериментов авторы содержали животных в прозрачных контейнерах на тёмном фоне (цвет дна), который создавался подложенной под контейнеры чёрной пленкой.
Мы решили восполнить имеющийся пробел в исследованиях пролиферации дер-мальных меланофоров, поставив целью настоящего исследования - выявление динамики развития меланофоров у личинокX. laevis на ранних стадиях развития - с 39 по 49. В эксперименте использовали личинок, содержавшихся на разных фонах, ежедневная микрофотосъемки кожи личинок в выбранном участке была начата сразу после вылупления личинок.
Материалы и методы. В опытах использовали личинок X. laevis, вылупившихся из икры, помещённой в контейнеры объемом 0,4 л, внутренним диаметром 7 см, заполнявшиеся водой на высоту 4 см. Животных содержали при температуре 24 0С в стеклянных контейнерах с белым, серым и чёрным фоном дна и стенок (3 варианта). Стенки и дно контейнеров окрашивали снаружи масляной краской в два слоя. Контейнеры находились в закрытом боксе с искусственным освещением белым светом продолжительностью 12 часов в сутки и интенсивностью 40 лк. Интенсивность освещения была подобрана таким образом, что на полностью сером фоне меланофорный индекс (mi) равнялся 3, на полностью белом mi = 1-2, на полностью чёрном mi = 4-5.
В каждом контейнере содержали по 3 животных. В качестве корма использовали молочную смесь «Малютка» (фирма «Нутриция») с добавлением пивных дрожжей (фирма «ЭККО ПЛЮС»).
Стадии развития личинок определяли по таблицам нормального развития Ньюкупа и Фабера [7].
С помощью цифрового фотоаппарата, смонтированного на окуляр стереомикроскопа, фотографировали животных. Фотографии общего вида использовали для определения стадий развития и определения морфометрических показателей, а фотографии бокового участка туловища - «щеки» - для подсчёта числа дермальных меланофоров (других пигментных клеток на этом участке нет).
Результаты и их обсуждение. Регулярное микроскопическое обследование животных и изучение фотоснимков показали, что сразу после вылупления личинок количество дермальных меланофоров в выбранной нами дорсолатеральной области туловища незначительно, клетки слабо пигментированы и располагаются неупорядоченно. Постепенно их число увеличивается.
Данные двух серий опытов оказались сходными. Анализ полученных нами данных для индивидуальных животных показал, что численность меланофоров к 49 стадии на разных фонах колеблется в пределах 45 ± 4 - 76 ± 7 клеток (рис. 1).
%
стадии развития
Рис. 1. Количество меланофоров на трех фонах
С 39 по 45 стадии происходит активное возрастание численности меланофоров, пик роста численности зарегистрирован на 45 стадии на всех трёх фонах. После 45 стадии прирост численности популяции меланофоров на «щеке» животных имеет особенности на разных фонах. На белом и сером фонах численность меланофоров незначительно возрастает до 47 стадии и сохраняется на одном уровне до 48-49 стадий. На черном фоне численность меланофоров продолжает увеличиваться до 48-49 стадий.
Увеличение числа меланофоров у личинок, развивавшихся на белом фоне, происходит только за счёт дифференцировок, митозы на ранних стадиях развития отсутствуют (рис. 2, 3). На сером фоне прирост пигментных клеток, также за счёт дифференцировок, с 47 по 48 стадии отмечена слабая митотическая активность. На чёрном фоне в прирост численности популяции меланофоров вносят вклад как дифференцировки, так и митозы на 47-49 стадиях.
шт,
стадии развития
Рис. 2. Процент дифференцировок на трех фонах
%
20,0 18,0 16,0
14.0
12.0 10,0
8,0 6,0
4.0
2.0 0,0
ОЦ')1ЛГ'«Г''Г'-ООООООООООС">
СП Г'' 00
ГО ^ •=?■
стадии развития
Рис. 3. Процент митозов на трёх фонах
К 49 стадии численность меланофоров на чёрном фоне на 35-40 % выше по сравнению с численностью на белом фоне и на 25-30 % - по сравнению с серым фоном. Превышение численности меланофоров на сером фоне относительно белого фона составило около 10 %.
Полученные данные по динамике численности меланофоров позволяют выделить два периода на ранних стадиях развития личинок.
Первый период длится около трёх дней, с момента вылупления по 45 стадию включительно, в этот период происходят только дифференцировки меланофоров из меланобла-стов. Второй период длится около десяти дней, с 47 по 49 стадию, характеризуется появлением первых митозов.
Разницу в интенсивности дифференцировок у животных на разных фонах (рис. 2) можно объяснить тем, что фоновые реакции появляются у личинок шпорцевой лягушки практически сразу, так как уже в первый день после вылупления глаза личинок полностью функционируют [2].
Существование фоновых реакций обеспечивается благодаря наличию в сетчатке сформированного глаза двух фоторецепторных зон - центральной, воспринимающей падающий свет, и краевой, улавливающей отражённый свет [4; 6]. Величина фоновых реакций зависит от соотношения двух гормонов: мелатонина, который стимулирует агрегацию пигмента в пигментных клетках, и меланоцитстимулирующего гормона (МСГ), способствующего дисперсии их пигмента [5]. При этом полагают, что концентрация МСГ в крови постоянная или меняется незначительно, а различное состояние пигмента в меланофорах обеспечивается разным количеством мелатонина. При адаптации личинок к белому фону отражённый рассеянный свет попадает на краевую зону сетчатки, что приводит к выделению глазом такого количества мелатонина, которое перекрывает действие МСГ и приводит к полной агрегации пигмента. На чёрном фоне отраженный свет отсутствует, поэтому в организме выделяется меньше мелатонина, но больше МСГ, что в итоге способствует полной дисперсии пигмента. При адаптации к серому фону отражённый свет имеется, но его интенсивность меньше, чем на белом фоне, поэтому мелатонина в организме выделяется меньше по сравнению с белым фоном, и в результате пигмент занимает промежуточное положение между полной агрегацией и полной дисперсией.
Различие в количестве меланофоров у личинок, которых содержали на разных фонах, объясняется зависимостью морфологических реакций от физиологических реакций, то есть от состояния пигмента в пигментных клетках. Согласно Е. Бабаку [5], дисперсия пигмента способствует, а агрегация препятствует морфологической реакции. Такая закономерность является результатом различий в относительной концентрации мелатонина и МСГ [1]. Чем выше диспергированность пигмента (выше меланофорный индекс), тем выше относительная концентрация МСГ и тем больше количество меланофоров при длительной адаптации, так как этот гормон стимулирует деление и дифференцировку пигментных клеток [11].
Полученные нами данные впервые показывают, что морфологическая фоновая реакция - увеличение числа клеток - проявляется уже на второй день после вылупления личинок X. laevis.
Заключение. Полученные нами данные позволяют выделить в формировании пигментной системы личинок Xenopus laevis на ранних стадиях развития два периода: первый -с момента вылупления по 45 стадию включительно, в этот период происходят только диф-ференцировки меланофоров из меланобластов, второй период начинается с 47 стадии, когда отмечаются отдельные митозы.
На ранних стадиях развития на интенсивность дифференцировок пигментных клеток из меланобластов и митотическую активность меланофоров в значительной степени влияет фон контейнеров. К 49 стадии развития численность меланофоров у личинок, выросших на черном фоне на 35-40 % выше по сравнению с численностью меланофоров у личинок, выросших на белом фоне.
Список литературы
1. Голиченков В. А. Биология меланофоров амфибий // Основы современной биологии. 1979. Т. 87. Вып. 3. С. 442-458.
2. Захарова Л. А. Влияние световых условий на развитие меланиновой пигментации в онтогенезе амфибий : автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1983. 22 с.
3. Стародубов С. М., Вассиф Э. Т., Голиченков В. А. Пролиферативная активность дер-мальных меланофоров в лииночном развитии шпорцевой лягушки // Особенности морфофункцио-
нальных характеристик в нормальном развитии и экстремальных условиях : докл. МОИП (Общая биология). М. : Наука, 1989. С. 65-66.
4. Хогбен Л. Хроматическая функция у низших позвоночных // Усп. совр. биол. 1936. Т. 5. № 2. С. 224-260.
5. Babak E. Zur chromatishen Hautfunktion der Amphibien // Arch. Ges. Physiol. 1910. Bd. 131. N 1. S. 87-118.
6. Hogben L., Slome D. The pigmentary effector system. The dual receptive mechanism of the amphibian blackground response // Proc. Roy. Soc. B. 1936. Vol.120. N 1. P. 158-173.
7. Nieuwkoop P. D., Faber J. Normal table of Xenopus laevis Daudin. Amsterdam: Horth-Hol-land Publ. Co., 1956. 243 p.
8. Pehlemann F. W. Der morphologische Farbwechsel von Xenopus laevis larvae //Z. Zellforsch. Anat., 1967. Bd. 78. N 4. S. 484-510.
9. Pehlemann F. W. Regulation of differentiation and cell division of melanophores in Xenopus laevis larvae // Pigmentation: its genetic and biological control. N. Y. : Appleton-Century-Crofts, 1973. P. 295-305.
10. Secerov S. Farbweckselversuche an der Bardgrundel (Nemachilksborbatus) // Roux' Arch. Entwiclungsmech. Organismen. 1909. Bd. 28. N 5. S. 629-660.
11. Smith-Gill S. J. Morphogenesis of the pigmentary pattern in wild-type and mutant Rana pipi-ens // Developmental biology. 1974. N37. P. 153-170.
Рукопись поступила в редакцию 30.11.2011
