CC BY
6УДК 579.6+615.076
DOI: 10.24412/2308-7188-2023-1-53-60
Лаврский Алексей Юрьевич
кандидат биологических наук, доцент кафедры биологии и географии
ФГБОУ ВО «Пермский государственный гуманитарно-педагогический университет», Пермь, Россия 614990, г. Пермь, ул. Пушкина, 42, тел. (342)2151952, доб. 485 e-mail: Lavrsky@pspu.ru, 63798@pspu.ru
Пронина Мария Дмитриевна
студент 4-го курса естественнонаучного факультета
ФГБОУ ВО «Пермский государственный гуманитарно-педагогический университет», Пермь, Россия 614990, г. Пермь, ул. Пушкина, 42, тел. (342)2151952, доб. 485 e-mail: Lavrsky@pspu.ru, 63798@pspu.ru
ДИНАМИКА БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ESCHERICHIA COLI «ЭКОЛЮМ 8» ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Aleksei Y. Lavrskii
Candidate of Biological Sciences, Docent of Chair of Biology and Geography
Perm State Humanitarian Pedagogical University 42, Pushkina, 614990, Perm, Russia e-mail: Lavrsky@pspu.ru, 63798@pspu.ru
Maria D. Pronina
4 years student of Natural Science Faculty
Perm State Humanitarian Pedagogical University 42, Pushkina, 614990, Perm, Russia e-mail: Lavrsky@pspu.ru, 63798@pspu.ru
DYNAMICS OF BIOLUMINESCENCE OF THE RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAIN 'ECOLUM 8' UNDER VARIOUS CULTIVATION CONDITIONS
Аннотация. Представлены результаты исследования динамики интенсивности биолюминесценции рекомбинантного штамма Escherichia coli
© Лаврский А.Ю., Пронина М.Д., 2023
«Эколюм 8», культивируемого на агаризованной среде и в суспензионной культуре. Установлено влияние способа культивирования бактерий, а также концентрации селектирующего антибиотика и способа долговременного поддержания культуры на интенсивность регистрируемой биолюминесценции.
Ключевые слова: рекомбинантный штамм, Escherichia coli, динамика биолюминесценции, «Эколюм 8», lux-оперон.
Abstract. The article presents the results of the study of bioluminescence intensity dynamics of recombinant Escherichia coli strain 'Ecolum 8' cultured on agarized medium and in suspension culture. The influence of the method of bacterial cultivation, as well as the concentration of selective antibiotic and the method of long-term culture maintenance on the intensity of the registered bioluminescence was determined.
Key words: recombinant strain, Escherichia coli, dynamics of bioluminescence, 'Ecolum 8', lux-operon.
В арсенале современных исследовательских методов биологии, используемых для изучения биосистем различного уровня, хорошо зарекомендовали себя биолюминесцентные методы. Они широко используются для различных нужд, от оценки биологического загрязнения поверхностей и сред до изучения характера влияния токсикантов и физических факторов на живую клетку [3; 7; 9].
В первом случае биолюминесценция, регистрируемая прибором, является эффектом биохимической реакции, осуществляемой in vitro в бесклеточной среде. Примерами таких систем являются анализаторы модельного ряда HY-LiTE фирмы Merck KGaA (Германия). Подобные методы чувствительны и востребованны, но они имеют ряд недостатков, таких как узкая специализация, абсолютная «закрытость» методик и высокие цены на расходные материалы. Аналогичные биохимические методы также применимы для измерения концентраций метаболитов в экстрактах клеточных культур с помощью хемилюминометров.
Вторая группа методов куда более универсальна, поскольку основана на живых клетках (обычно бактериальных). Рекомбинантные штаммы бактерий, несущие lux-опероны, довольно удобно поддерживать в культурах, а хранение в виде лиофилизата не требует какого-либо дорогостоящего оборудования или сред. Динамика метаболических процессов в этом случае регистрируется непосредственно по свечению (микробиолюминесценции) живой клетки, в которую предварительно введены компоненты биолюминесцентных систем [3; 5].
Бактериальные lux-биосенсоры обладают высокой чувствительностью. Интенсивность биолюминесценции обычно обратно пропорциональна концентрации токсиканта в среде, что делает метод не только качественным, но и количественным. В настоящее время ведутся работы по созданию биосенсоров на различные вещества, в том числе антибиотики тетрациклинового и в-лактамного ряда, которые широко применяют в медицине, биотехнологиях и
ветеринарии из-за высокой антимикробной активности, наличия большого количества производных и низких цен [4; 6; 9].
Установление закономерностей роста lux+ бактериальных культур в различных условиях и динамики их биолюминесценции позволит разработать принципиально новые эффективные биологические тест-системы и определить оптимальные условия их применения.
Цель работы: построение динамики биолюминесценции рекомбинантного штамма Escherichia coli «Эколюм-8» при различных условиях культивирования.
Задачи:
1. Оценить динамику микробиолюминесценции исследуемого штамма при инкубации на агаризованной среде и в суспензионной культуре.
2. Оценить влияние концентрации селектирующего антибиотика (АБП), а также атмосферного кислорода на интенсивность и продолжительность биолюминесценции.
3. Сравнить динамику и максимальный уровень светимости свежей культуры, восстановленной из лиофилизата, и культуры, продолжительно поддерживаемой на агаризованной среде.
В качестве модельной культуры использовался штамм Escherichia coli «Эколюм-8», несущий полный lux-оперон биолюминесцентной бактерии Photorhabdus luminescence [1; 5]. Данный распространенный lux-биосенсор представляет собой клетку кишечной палочки E. coli, в которой содержатся гибридные плазмиды, несущие два основных элемента: регуляторный участок (промотор и оператор) и ген (гены) репортер. В качестве генов-репортеров используются гены luxCDABE, изолированные из геномов, светящихся бактерий и кодирующие люциферазу и редуктазу, обеспечивающие свечение бактериальной клетки [2; 7; 8].
Исследуемый штамм был ресуспендирован в среде SOC и инкубировался на шейкере 25 мин, а затем высевался в ГРМ-бульон и на ГРМ-агар. В работе использовались классические общие питательные среды производства г. Оболенска: «ГРМ-агар» (ТУ 9398-020-78095326-2006), «ГРМ-бульон» (ТУ 9398-021-78095326-2006).
Агар и бульон разливались по пробиркам Флоринского по 1,4 мл, а также по пробиркам типа «эппендорф» вместимостью 5 мл по 1,4 мл. В каждую пробирку вносилось по 10 мкл бактериальной суспензии автоматическим дозатором. Выбор пробирок малого объема связан с невозможностью поместить в люминометр стандартную биологическую пробирку.
В исследовании применялась разная концентрация АБП, так как он, вероятно, постепенно разрушается при контакте с компонентами питательной среды и воздухом, а также самими бактериями.
При разрушении антибиотика снижается давление селектирующего фактора, это приводит к появлению клеток, утративших ген устойчивости и lux-оперон. Такие клетки, по всей видимости, получают преимущество в скорости размножения, так как не несут дополнительной метаболической нагрузки. Со
временем это может отрицательно повлиять на интенсивность светимости культуры, вплоть до полного ее прекращения.
Были использованы агаризованная питательная среда и жидкий питательный бульон аналогичного состава. Суспензии удобны возможностью вносить жидкие тестируемые вещества, кроме того, условия в жидкости более равномерны, что снижает влияние градиент-факторов на рост и интенсивность микробиолюминесценции.
Культивирование в суспензии осуществлялось в анаэробных и аэробных условиях. В анаэробных условиях бактерии культивировались в герметично закрытых пробирках типа эппендорф, что довольно технологично, так как обеспечивает постоянный газовый состав, снижает риск испарения и высыхания среды, контаминации культуры.
Культивирование на агаризованной среде имеет свои особенности, например, излучающая биомасса бактерий обладает высокой плотностью клеточной популяции, свет не поглощается средой, соответственно, свечение ожидалось более интенсивным. Рост микроорганизмов потенциально можно учитывать планиметрическим методом. Кроме того, при культивировании на агаре потенциально можно изучать воздействие газообразных веществ или физических факторов, которые будут влиять непосредственно на бактериальные клетки, без взаимодействия с плотными средами. Ознакомиться с вариантами культивирования и составом сред можно в табл. 1.
Таблица 1
Варианты культивирования бактерий и состав питательных сред
№ Среда С (АБП) мг/л Емкость Кол-во пробирок Примечание
1 ГРМ-агар 600 Пробирка Флоринского (аэробн.) 10 Из лиофилизата
2 ГРМ-агар 100 Пробирка Флоринского (аэробн.) 10 Из лиофилизата
3 ГРМ- бульон 600 Пробирка Флоринского (аэробн.) 10 Из лиофилизата
4 ГРМ- бульон 100 Пробирка Флоринского (аэробн.) 10 Из лиофилизата
5 ГРМ- бульон 600 Эппендорф 5 мл (анаэробн.) 20 Из лиофилизата
6 ГРМ- бульон 600 Эппендорф 5 мл (анаэробн.) 10 Старая культура
Измерение интенсивности свечения измерялось люминометром ПХЛ-01. Показания прибора, а также множитель, определяющий диапазон чувствительности, вносились в электронные таблицы Excel.
Для большей точности измерений и приведения их результатов к одной размерности были вычислены поправочные коэффициенты для каждого диапазона чувствительности люминометра. Каждый коэффициент был получен
от серии не менее 10 замеров стандартного источника с разной интенсивностью, что позволяет учесть нелинейность характеристики прибора.
Прибор измеряет интенсивность свечения в относительных единицах (ОЕ), пригодных для расчетов тушения билолюминесценции токсикантами или построения динамики.
Инкубация пробирок в штативах производилась в воздушном термостате при температуре 37 ±1°С.
Объем выборок составлял от 10 до 20 пробирок с культурами на каждый тип культуры. Измерения производились с периодичностью от 30 мин до двух суток в соответствии с общей динамикой яркости биолюминесценции. Так, в течение первых двух суток, когда яркость менялась наиболее интенсивно, интервалы составляли от 30 мин до 12 ч, позже - увеличивались.
Все расчеты производились средствами Microsoft Excel 2007 и Statistica 8.0 согласно стандартным методам математический статистики.
Нормальность распределения проверялась с помощью критерия Шапиро - Уилка.
В результате обработки полученных данных было установлено, что культуры демонстрируют в основном схожую динамику биолюминесценции, но различный уровень предельной яркости. В графическим виде результаты представлены ниже (рис. 1).
Как видно из графика, наиболее интенсивное свечение у всех культур, восстановленных из лиофилизата, регистрируется в период с 20-го по 50-й час в течение опыта и практически полностью пропадает через 230 ч.
Можно отметить, что наибольшая светимость характерна для культур на агаризованной среде (по сравнению с суспензионными).
Также можно отметить, что общая закономерность прослеживается в изменении интенсивности свечения всех типов культур из лиофилизата. Исключение составляет культура, поддерживаемая на агаре в активном виде (последняя кривая).
Данный график (рис. 1) приведен с целью оценки общей динамики у разных вариантов культур, далее будет рассмотрен отрезок времени от 0-го до 230-го часа, где биолюминесценция наиболее выражена (рис. 2).
На втором графике представлены кривые интенсивности биолюминесценции «Эколюм-8» при различных типах культур, но одинаковой концентрации антибиотика (рис. 2).
Рис. 1. Сводный график светимости шести вариантов культур Escherichia coli штамма «Эколюм-8» в средах, содержащих от 100 до 600 мг/л АБП
Рис. 2. Сводный график светимости суспензий Escherichia coli штамма «Эколюм-8»
при концентрации АБП 600 мг/л
При этом последняя кривая демонстрирует динамику микробиолюминесценции для «старой» культуры, поддерживаемой на ГРМ-агаре в активном виде при температуре 25±1°С и в данном опыте пересеянной в суспензию, с 20-кратно увеличенной амплитудой. Исходной кривой является предпоследняя (ГРМ-бульон, анаэробные условия, 600 мг/л «старая» культура). Это позволяет визуально оценить отличие динамики светимости данной культуры от остальных.
Как видно из графика, ее максимальная светимость приходится на период с 90-го по 150-й час, что значительно продолжительнее, чем у других культур. Несмотря на относительно долгий период свечения, абсолютная светимость данной культуры исчезающе мала по отношению к показателям остальных. Таким образом, поддержание культур lux+ бактерий в активном состоянии негативно сказывается на их характеристиках, в качестве биосенсора. Эти результаты показывают, что возраст и тип культуры, а также концентрация селектирующего фактора могут оказывать значительное влияние на динамику биолюминесценции в периодической культуре.
Выводы
1. При культивировании Escherichia coli штамма «Эколюм-8» на агаризованной среде интенсивность регистрируемой биолюминесценции значительно выше, чем в суспензионной культуре. Максимальные значения светимости на агаре превосходят в 2,7 раза (при 100 мг/л антибиотика, t = 9,1) и в 1,9 раза (при 600 мг/л, t = 3,5) максимум в суспензии.
2. Как в течение большей части опыта, так и в точках максимумов свечение аэробных культур превосходит свечение культур анаэробных, это видно на графиках и подтверждается максимальными значениями: аэробная суспензия с 600 мг/л антибиотика излучает в 1,97 раза интенсивнее анаэробной (t = 3,7).
Высокая концентрация антибиотика, напротив, снижает светимость, что особенно выражено у культур на агаризованной среде в период до 50 часов.
3. Бактерии, высеваемые из лиофилизата непосредственно перед анализом, демонстрируют большую интенсивность биолюминесценции и резкие скачки ее интенсивности. Так, старая культура уступает по максимальной светимости свежей более чем в 10 раз при культивировании в суспензии (t =13,9) и в 54,9 раза по сравнению с культурой на ГРМ-агаре (t = 18,2).
Список литературы
1. Власенко Л.В. Бактериальные люминесцирующие биосенсоры в системе оценки антибактериальной активности углеродных наноматериалов // Материалы I Международной школы-конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Биомедицина, материалы и технологии XXI века». - Казань, 2015. - С. 46.
2. Данилов В.С., Завильгельский Г.Б., Зарубина А.П., Мажуль М.М. Роль генов luxCDE в биолюминесценции бактерий // Вестник МГУ. - Сер. 16: Биология. - 2008. - № 2. - С. 11-15.
3. Дерябин Д.Г., Поляков Е.Г., Каримов И.Ф. Особенности использования биолюминесцентных тест-систем при исследовании абиотических сред и биологических жидкостей // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2004. - № 5(30). - С. 101-104.
4. Дерябин Д.Г., Поляков Е.Г. Перспективы использования люминесцирующих бактерий для оценки бактерицидной активности биологических жидкостей макроорганизма // Материалы VIII Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов, паразитологов. - М., 2002. - Т. 3. - С. 253.
5. Ерошников Г.Е. Lux-оперон Photorhabdus luminescens ZM1 и его аналитическое применение : автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2003. - 24 с.
6. Котова В.Ю., Рыженкова К.В., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. Индуцируемые специфические lux-биосенсоры для детекции антибиотиков: конструирование и основные характеристики // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. - №. 1. - С. 112-117.
7. Пшеничнов Р.А., Никитина Н.М., Демина М.В., Масленникова И.Л. Разработка и использование микробиолюминесцентного метода для выявления, количественной суммарной оценки токсикантов табачного дыма // Токсикологический вестник. - 2007. - № 5(86) [Электронный ресурс]. - URL: https://cyberleninka.ru/article/n/razrabotka-i-ispolzovanie-mi-krobnolyummestsentnogo-metoda-dlya-vyyavlemya-koH-chestvennoy-summamoy-otsenki-toksikantov-1 (дата обращения: 19.05.2023).
8. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий / В.С. Данилов, А.П. Зарубина, Г.Е. Ерошников и др. // Вестник МГУ. - 2002. - № 3. - С. 20-24.
9. Экспресс-анализ чувствительности бактерий к бета-лактамным антибиотикам с помощью резонатора с поперечным электрическим полем О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, О.А. Караваева и др. // Антибиотики и химиотерапия. -2019. - № 64(1-2). - С. 3-8.
