Динамічні зміни тканинного протеолізу у статевозрілих і старих щурів із пораненням товстої кишки Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ЩДСУМОК

При дп етанолу на 9-у добу eM6pioreHe3y у мишей виникае затримка формування аорто-пульмонально! перегородки, яка спричинена ано-мальним розвитком мезенхiмноi тканини конус-

но-стовбурового вiддiлy серця, порушенням мь граци клiтин нервового гребеня в стовбyровi гре-беня, а також вщсутшстю своечасно! редукцп м'язово! оболонки стовбура i конуса серця.

СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ

1. Alcohol and congenital heart defects: an experimental study in mice / Webster W.S., Germain M.A., Lipson A., Walsh D. // Cardiovasc. Res.-1984.- Vol.18, N 6.- P.335-338.

2. Development of the coronary arteries in a murine model of transposition of great arteries / Gonzalez-Iriarte M., Carmona R., Perez-Pomares J.M. et al. // J. Mol. Cell. Cardiol.- 2003.- Vol. 35, N 7.- P.795-802.

3. Developmental spectrum of cardiac outflow tract anomalies encompassing transposition of the great arteries and dextroposition of the aorta: pathogenic effect of extrinsic retinoic acid in the mouse embryo / Yasui H., Morishima M., Nakazawa M. et al. // Anat. Rec.- 1999.-Vol. 254, N 2.- P.253-260.

4. Hyperplastic conotruncal endocardial cushions and transposition of great arteries in perlecan-null mice / Costell M., Carmona R., Gustafsson E. et al. // Circ. Res.-2002.- Vol.91.- P.158-165.

5. Kirby M. L. Embryogenesis of transposition of the great arteries. A lesson from the heart // Circ. Res.-2002.- Vol. 91.- P.87-88.

6. Morphological observations on the pathogenetic process of transposition of the great arteries induced by retinoic acid in mice / Yasiu H., Nakasawa M., Mori-shima M. et al. // Circulation.- 1995.- Vol. 91, N 9.- P. 2478-2486.

♦

УДК 616.345-001:612.398.19-092.9

В.П. Польовий ДИНАМ1ЧН1 ЗМ1НИ ТКАНИННОГО

ПРОТЕОЛ1ЗУ У СТАТЕВОЗР1ЛИХ I СТАРИХ ЩУР1В 13 ПОРАНЕННЯМ ТОВСТО1 КИШКИ

Буковинський державний медичний утверситет кафедра госттальног хгрургИ (зав.- проф. А.ГЛфтодш)

Ключовi слова: товста кишка, поранення, кровотеча, протеолгз, в1к

Key words: large intestine, injury, bleeding, proteolysis, age

Резюме. Экспериментально установлено, что у половозрелых крыс с ранением толстой кишки в ее ткани перманентно возрастает интенсивность лизиса высокомолекулярных белков, тогда как у старых животных увеличение лизиса азоальбумина имеет синусоидальный характер с максимумом на 60-ю мин. эксперимента и снижением альбумино-литической активности до исходного уровня на 180-ю мин. опыта. В отличие от половозрелых животных, у которых интенсивность локального протеолитического распада высокомолекулярных белков после ранения толстой кишки прогрессивно возрастает, у старых крыс казеинолитическая активность ткани толстой кишки резко увеличивается на 60-ю мин. эксперимента и в дальнейшем постепенно уменьшается, оставаясь на 180-ю мин. больше исходного уровня. В ответ на ранение толстой кишки у половозрелых крыс коллагенолитическая активность ее ткани уменьшается со 120-й мин. и достигает минимальных величин на 180-ю мин. наблюдения. У старых животных снижения интенсивности тканевого коллагенолиза не происходит. Наоборот, через 120 мин. после ранения толстой кишки локальный протеоли-тический распад коллагена значительно возрастает и в конце опыта остается существенно выше контрольных показателей. Summary. It was experimentally established that in sexually mature rats with an injuried large intestine the intensity of lysis of highly molecular proteins permanently increases in intestine tissue, whereas in old rats an increase of azoalbumin lysis has a synusoidal character with the peak falling on the 6oth minute of the experiment with a further decrease of albuminolytic activity to

the initial level on the 180th minute of the experiment. In contrast to sexually mature animals in whom intensity of the local proteolytic breakdown of highly molecular proteins progressively increases after injury of a large intestine, in old rats the caseinolytic activity of a large intestinal tissue sharply increases during the 60th minute of the experiment with a further gradual decrease, remaining higher initial level during the 180th minute. In response to the injury of a large intestine in sexually mature rats the collagenolytic activity of its tissue diminishes beginning with the 120th minute and reaches minimal values during the 180th minute of the observation. In old animals a decrease of tissue collagenolysis intensity doesn't occur. On the contrary, in 120 minutes after an injury of the large intestine the local proteolytic breakdown of collagen considerably increases and at the end of the trial remains significantly higher than the control parameters.

Шлунково-кишковi кровотечi залишаються актуальною проблемою сучасно! х1рурги, оскшь-ки створюють серйозну загрозу для життя хворого, особливо пащенпв л^нього i старечого в> ку [4,6]. При кровотечах травматичного генезу клшчна ситуащя ускладнюеться ще й тим, що одночасно вщбуваеться шфшування черевно! по-рожнини, внаслщок чого зона ушкодження киш-ково! стшки втягуеться у процес запалення. Одним iз пускових механiзмiв ушкодження клгтин-них мембран у зон запалення е активащя про-цешв пероксидного окиснення лшдав, що приз-водить до вившьнення протеол^ичних фермен-пв. Судинш реакцп i гемокоагуляцiйнi зсуви створюють зону шеми, що викликае вторинну альтеращю за участi металопроте!наз, лiзосома-льних ферменпв i продуктiв лшопероксидаци, що накопичуються внаслiдок збiльшення гене-раци активних форм кисню за iшемiчними i реперфузiйними механiзмами [7,9].

Роль продукпв лшопероксидаци в усклад-неннi патологiчного процесу добре вщома. Вод-ночас питання вшово! залежносп змiн локально! протеолгтично! активностi при травматичних шлунково-кишкових кровотечах вивчено не-достатньо.

Метою ще! роботи е дослщити особливостi динамiки змiн у старих щурiв локально! про-теол^ично! активностi тканини товсто! кишки тсля !! поранення.

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛЩЖЕНЬ

У роботi використано 75 статевозрших i 75 старих самщв бiлих щурiв iз масою тша 0,14-0,16 кг (статевозрiлi тварини вшом 4-6 мiс.) та 0,490,55 кг (старi тварини вiком 20-22 мю.).

Усi операцiйнi втручання проводилися вщпо-вiдно до основних вимог Ванкуверських конфе-ренцiй (1979, 1994) про бюмедичт експерименти щодо гуманного ставлення до лабораторних тва-рин, в асептичних умовах, пiд уретановим наркозом (1000 мг/1 кг маси тша). Пюля серединно! лапаротомi!' моделювали стандартизоване пора-

нення товсто! кишки у статевозрших i старих щурiв за допомогою спещального пристрою з нанесенням прицшьно! дозовано! травми силою до 40 кг/см2 тсля попереднього накладання з двох сторш туршке^в для пiдвищення вну-трiшньопорожнинного тиску . Як ударники вико-ристовували монолiтнi конструкцi! рiзно! форми та площ^ а також з центральною i змiщеною вiссю коректора ударно! хвилi [8]. У всiх ви-падках пiсля поранення товсто! кишки на розрiз черевно! порожнини накладали 5 швiв, що за-побшало тепловим втратам. Дослiдження змiн параметрiв тканинного протеолiзу виконувалося серiйно (по 15 тварин у сери) - через 30, 60, 120 i 180 хв. тсля поранення товсто! кишки.

Пюля евтанази тварин шляхом забору кровi з черевно! аорти наважки товсто! кишки одразу заморожували в рщкому азотi. Перед до-слiдженням тканинного протеолiзу наважки роз-морожували, гомогенiзували у 2,0 мл охолодже-ного боратного буферу (рН 9.0) i надалi вико-ристовували в бiохiмiчному аналiзi.

Дослiдження протеол^ично! активностi тканини товсто! кишки проводили за лiзисом азо-альбум^, азоказе!ну та азоколу (Укра!на). Принцип методу полягае в тому, що при шкубаци бiлкових азосполук у присутностi акти-ваторiв та iнгiбiторiв протеолiзу, яю мiстяться у тканинi товсто! кишки, вщбуваеться лiзис азо-альбумiну (деградащя низькомолекулярних про-те!нiв), азоказе!ну (розпад високомолекулярних бiлкiв) та азоколу (колагенолiз), iнтенсивнiсть якого оцiнюеться за ступенем забарвлення шку-бацiйного розчину в лужному середовищi.

По 0,1 мл гомогенату тканини товсто! кишки вносили у пробiрки, яю мiстили 5 мг азосполуки i 1,9 мл боратного буферу ( рН 9.0). У дублшати пробiрок "РП" (розчин порiвняння) замiсть гомогенату товсто! кишки додавали 0,1 мл боратного буферу. Ус пробiрки одночасно шкубували у водяному термостатi "ТПС-1" при температурi 37°С протягом 15 хв. За цей промiжок часу вщ-буваеться розпад азосполук i вивiльнення барв-

05/ Том X / 3

11

ника в шкубацшний розчин вщповщно до протеолггично! активностi тканини товсто! кишки. Пiсля шкубацп yci пробiрки одночасно охолоджували до 5°С для зупинки лiзисy азо-сполук. У кожну пробiркy для залужування сере-довища додавали по 20 мкл 5 М розчину №ОН. До уах пробiрок додавали 2,0 мл дистильовано! води, вмют фiльтрyвали через шар вати, що знаходилась у шприцах. На спектрофотометрi "СФ-46" (Росiя) у кюветах товщиною 1 см при довжинi хвилi 440 нм проти розчину порiвняння проводили замiрювання оптично! густини проб. Отримаш екстинци перераховували на мкг азо-сполуки на 1 г селезшково! тканини за 1 год. шкубацп за формулою: лiзис азосполуки — (Е440 х 1000 х 4 х k) : n — мкг азосполуки/1 г тканини товсто! кишки за 1 год., де k - коефщент пере-рахунку, n - наважка тканини товсто! кишки (мг).

Статистичну обробку отриманих даних проводили методом варiацiйного аналiзy на PC IBM 586 з визначенням критерiю Стьюдента за допо-могою програми "BioStat" [3].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

Результати дослщження динамiки змiн про-теол^ично! активностi у тканинi товсто! кишки наведет у таблищ. У статевозрших щyрiв штен-

сивнiсть розпаду низькомолекулярних бiлкiв у тканинi товсто! кишки тсля !! поранення про-тягом перших 30 хв. дослiдy не змшювалась. На 60-у хв. експерименту локальна альбумшол^ич-на активнiсть збшьшувалася на 84,6%, на 120-у хв. - перевищувала вихiдний рiвень у 2,7 раза, а на 180-у хв. експерименту виявилась у 4,0 раза бшьшою за контроль. Зовшм iншi змши спосте-рiгались у старих щyрiв: лiзис азоальбyмiнy тд-вищувався у 3,2 раза на 60-у хв. дослщу, був на 56,9% бшьшим за контрольнi показники на 120-у хв., проте на 180-у хв. спостереження рiзко зни-жувався i вiрогiдно вiд вихщного рiвня не вiдрiзнявся. У статевозрших i старих щyрiв виз-начальна альбумшол^ична активнiсть тканини товсто! кишки була практично рiвною. Порiвня-льний аналiз не виявив мiжгрyпових вщмш-ностей зазначеного показника i через 30 хв. шсля поранення товсто! кишки. На 60-у хв. дослщу лiзис альбумшу виявився на 46,5% бшьшим у старих тварин. Однак надалi штенсивнють розпаду низькомолекулярних бшюв у тканинi поранено! товсто! кишки старих щyрiв була значно меншою за таку у статевозрших тварин: на 120-у хв. - yдвiчi, на 180-у хв. - у 3,7 раза.

Динамжа змш тканинного протеолiзу у щурiв i3 пораненням товстоТ кишки (x±Sx)

СтатевозрШ щури n=15 Стар1 щури n=15

Пер1оди спостереження лзис азоальбум1ну, мкг/1 г тканини за 1 год. л1зис азоказешу, мкг/1 г тканини за 1 год. лзис азоколу, мкг/1 г тканини за 1 год. лзис азоальбум1ну, мкг/1 г тканини за 1 год. л1зис азоказешу, мкг/1 г тканини за 1 год. л1зис азоколу, мкг/1 г тканини за 1 год.

Контроль (вихвдш показники) 19,67+1,44 16,56+1,61 13,55+1,45 16,55+1,71 Р1>0,05 14,01+1,18 Р1>0,05 10,91+1,06 Р1>0,05

Через 30 хв. тсля поранення 22,71+2,11 p>0,05 19,77+1,65 p>0,05 16,28+1,80 p>0,05 18,94+1,57 p>0,05 Р1>0,05 15,34+1,35 p>0,4 Р1=0,05 13,88+1,46 p>0,05 Р1>0,05

Через 60 хв. п1сля поранення 36,31±3,06 p<0,001 44,74+4,05 p<0,001 14,27+1,67 p>0,5 53,21+4,33 p<0,001 pj<0,05 59,35+4,81 p<0,001 pj<0,05 9,51+0,85 p>0,05 pj<0,05

Через 120 хв. тсля поранення 53,13+4,48 p<0,001 59,34+4,03 p<0,001 9,42+0,89 p<0,05 25,97+2,82 p<0,05 Р1<0,001 22,42+2,32 p<0,05 Р1<0,001 19,47+2,40 p<0,05 Р1<0,05

Через 180 хв. тсля поранення 78,97+6,22 p<0,001 86,20+4,43 p<0,001 5,75+0,83 p<0,001 21,31+2,61 p>0,05 P1<0,001 20,13+2,34 p<0,05 P1<0,001 16,53+1,81 p<0,05 P1<0,001

Примаки! р - стyпiнь достов1рност1 рiзниць показникiв вiдносно вихiдного рiвня; р1 - стyпiнь достовiрностi рiзниць показникiв у статевозрiлих i старих щyрiв у вiдповiднi перiоди спостереження; n - число спостережень.

Подiбнi змiни спостерiгались i з боку про-теолiтично! деградацi! високомолекулярних бш-кiв. У статевозрiлих щyрiв шсля поранення тов-

сто! кишки вщбувалося прогресивне пiдвищення казе!нолiтично! активностi !! тканини, тодi як у старих тварин рiзке пiдвищення лiзисy азоказе!-

ну на 60-у хв. експерименту змшювалось посту-повим зниженням штенсивносп розпаду високо-молекулярних бiлкiв. Проте наприкшщ спосте-реження лiзис азоказе!ну залишався на 43,7% бiльшим за контрольш показники. Порiвняльний аналiз не виявив вiрогщно! рiзницi мiж визна-чальною казе!нолгтичною активнiстю у старих i статевозрiлих щурiв, так само як i через першi 30 хв. шсля поранення товсто! кишки. На 60-у хв. дослщу iнтенсивнiсть розпаду високомолекуляр-них бiлкiв була на 32,7% бшьшою у старих щурiв. Надалi, навпаки, лiзис азоказе!ну у старих тварин виявився значно меншим, шж у стате-возрiлих щурiв: на 120-у хв. - у 2,6 раза, на 180-у хв. - у 4,3 раза.

У статевозрших тварин колагенол^ична ак-тившсть тканини товсто! кишки протягом першо! години пiсля И поранення вiрогiдних змiн не зазнавала. На 120-у хв. експерименту лiзис азо-колу виявився на 30,5% меншим за вихщний рiвень, а на 180-у хв. дослщу був у 2,4 раза меншим за контроль. У старих щурiв змш локального колагенолiзу також не вщбувалося до 120-1 хв. дослiду, коли колагенол^ична актив-нiсть тканини ушкоджено! товсто! кишки рiзко зростала i перевищувала контроль на 78,5%. Наприкiнцi спостереження iнтенсивнiсть лiзису азоколу в тканиш товсто! кишки старих тварин залишалася високою - на 51,5% бшьшою за ви-хiднi показники. Визначальний рiвень колагено-лiтично! активностi у статевозрших i старих щурiв був практично однаковим. Мiжгрупових змiн зазначеного показника не виявлялось i через 30 хв. шсля поранення товсто! кишки. На 60-у хв. дослщу штенсившсть протеол^ичного розпаду колагену була на 33,4% меншою у старих щурiв, однак на 120-у i 180-у хв. експерименту колагенолiз у тканиш ушкоджено! товсто! кишки старих тварин перевищував такий у статевозрших щурiв вщповщно у 2,1 i 2,9 раза.

Вщомо, що при розвитку запального процесу в iнтерстицiйнiй тканинi накопичуються лiзосо-мальнi ферменти, бiлковi i бактерiальнi протеази [10]. Результат запально! реакцп багато в чому залежить вщ спiввiдношення нейтральних ме-талопроте!наз лаброцшгв i кислих протеаз ней-трофшв. За звичайних умов запалення тучш клi-тини мають значний стимулювальний вплив на репарацiю. Механiзм модулювального впливу лаброцшгв на репаративний процес пов'язаний iз гальмуванням нейтрофiлiв, обмеженням процешв альтерацi!, активацieю моноцитiв-макрофагiв, що сприяе очищенню вогнища запалення, а також зi стимуляцieю фiбробластiв i фiброзогенезу [5]. Регуляцiя запальних реакцiй здшснюеться за допомогою цитокiнiв. У вогнищi запалення тучнi клiтини активують генеращю iнтерлейкiну-1 [1].

Водночас гiдролази, що продукуються нейтро-фiлами, мають здатшсть до розщеплення або iнактивацi! цитоюшв, а також можуть блокувати !х продукцiю [12]. Поряд iз цим, гщролази при-гнiчують експресiю цитокшових рецепторiв, зд> йснюють !х шедшг [11]. Цитокiни, що виро-бляються мононуклеарними клiтинами, дiють на початковi етапи запальних та регенераторних процешв. 1х комплексна дiя проявляеться пригш-ченням надмiрно! пролiферацi! фiбробластiв та стримуванням запально! реакци шляхом галь-мування мiграцi! макрофагiв i нейтрофшв до зо-ни ушкодження [2].

Не виключено, що послаблення з вшом цито-кiново! регуляци запального процесу у старих щурiв iнвертуе нормальну протеолiтичну реак-щю в зонi поранення товсто! кишки, внаслщок чого замiсть активацi! протеол^ичного розпаду низько- i високомолекулярних бшюв та пригш-чення колагенолiзу вщбуваеться зниження альбу-мiно- i казе!нолгтично! активностi на тлi штен-сифшаци локального лiзису колагену. Це суттево порушуе процеси репаративно! регенерацi!, сприяе пролонгаци крововтрати i створюе за-грозу неспроможностi накладених на зону ушкодження товсто! кишки швiв, оскшьки процеси пролiферацi! фiбробластiв i колагеноутворення при старiннi перебiгають на тлi високо! локально! колагенолгтично! активностi.

ВИСНОВКИ

1. У статевозрших щурiв iз пораненням товсто! кишки в !! тканинi перманентно зростае штенсившсть лiзису високомолекулярних бшюв, тодi як у старих тварин збшьшення лiзису азо-альбумiну мае синусо!дальний характер iз максимумом на 60-у хв. експерименту i зниженням альбумшол^ично! активностi до вихщного рiвня на 180-у хв. дослщу.

2. На вiдмiну вiд статевозрших тварин, у яких iнтенсивнiсть локального протеол^ичного розпаду високомолекулярних бшюв пiсля поранення товсто! кишки прогресивно зростае, у старих щурiв казе!нолiтична активнють тканини товсто! кишки рiзко збшьшуеться на 60-у хв. експерименту i надалi поступово зменшуеться, зали-шаючись на 180-у хв. бшьшою за вихщний р> вень.

3. У вщповщь на поранення товсто! кишки у статевозрших щурiв колагенол^ична активнiсть !! тканини зменшуеться з 120-! хв. дослiду i до-сягае мiнiмальних величин на 180-у хв. спостереження. У старих тварин зниження штенсивносп тканинного колагенолiзу не вщбуваеться. Навпаки, через 120 хв. шсля поранення товсто! кишки локальний протеол^ичний розпад колагену значно зростае i наприкшщ дослщу за-лишаеться суттево вищим за контрольнi показ-ники.

05/ Том X / 3

13

СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ

1. Влияние тучных клеток на продукцию интерлейкина-1 макрофагами экссудата и костного мозга при воспалении / Клименко Н.А., Дыгай А.М., Богдашин И.В. и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1993. - Т. 115, № 6. - С.599-600.

2. Возианов А.Ф., Бутенко А.К., Зак К.П. Ци-токины. Биологические и противоопухолевые свойства. - К.: Наук. думка, 1998. - 313 с.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. -М.: Практика, 1999. - 459с.

4. Ефименко Н.А., Лысенко М.В., Асташов В.Л. Кровотечение из хронических гастродуоденальных язв: современные взгляды и перспективы лечения // Хирургия. - 2004. - № 3. - С.56-60.

5. Клименко Н.А., Татарко С.В. Роль тучных клеток в репаративных явлениях при воспалении // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1995. - Т. 119, № 3. - С.262-265.

6. Лечебная тактика при толстокишечных кровотечениях опухолевого генеза / Бойко В.В., Криво-ручко И.А., Красивский С.Л. и др. // Хiрургiя Украши. - 2003. - Т. 8, № 2. - С.63-64.

7. Насыров Х.М., Кондратенко Р.М. К проокси-дантному действию медиаторов воспаления // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 1992. - № 3. -С.12-14.

8. Принципы моделирования травматических повреждений внутренних органов в экспериментальной хирургии / Пикенин А.М., Горонов В.Г., Гри-горьян Г.О., Молчанов А.И. // Клинич. хирургия. -1990. - №4. - С. 25-26.

9. Сапрыкин В.П., Галанкин В.Н. Ультраструктурная характеристика нефлогогенного и флогоген-ного реагирования моно- и полинуклеарных фагоцитов при их взаимодействии со Staphylococcus aureus // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 1998. - № 1. - С.22-26.

10. Чилингиров Р.Х. Влияние ингибиторов про-теолиза на некоторые бактериальные возбудители и течение гнойно-воспалительного процесса // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 1997. - № 3. -С.37-39.

11. Cleavage of the epidermal growth factor receptor by a membrane-bound leupeptin-sensitive proteinase active in nonionic detergent lysates of senescent but not young human diploid fibroblasts / Carlin C., Phillips P.D., Brooks-Federich K. et al. // J. Cell. Physiol. - 1994. -Vol.160. - P.427-434.

12. Enzymatic degradation of tumor necrosis factor by activated human neutrophils: Role of elastase / Nortier J., Vandenabeele P., Noel E. et al. // Life Sci. - 1991. -Vol. 49, N 25. - P.1879-1886.