CC BY
12
Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология СООбШ,@НЫЯ Meditsinskaya Immunologiya
2018, Т. 20, № 5, стр. 747-752 Г^ . 2018, Vol. 20, No 5, pp. 747-752
© 2018, СПбРО РААКИ ShOVt COmmUniCtttlOnS © 2018, SPb RAACI
ДИНАМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГРАНУЛИЗИНА И КАТЕЛИЦИДИНА У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ, БОЛЬНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ ТУБЕРКУЛЕЗА ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ
Авербах М.М. (мл.), Панова Л.В., Губкина М.Ф., Евсеева Н.И.
ФГБНУ«Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Резюме. Цитолитические молекулы системы врожденного иммунитета гранулизин и кателицидин являются важными защитными факторами при инфицировании микобактериями туберкулеза. Нами получены данные о высоких показателях гранулизина и кателицидина у группы инфицированных МБТ детей и подростков. У больных туберкулезом органов дыхания показано низкое содержание сывороточного кателицидина при деструктивных формах, а гранулизина — при «малых» формах туберкулеза до начала специфической химиотерапии. Проведенная химиотерапия не оказывала влияния на содержание гранулизина и кателицидина в сыворотке у больных с деструктивным туберкулезом, тогда как у больных «малыми» формами (ТВГЛУ/очаговый туберкулез) выявлено достоверное увеличение содержания гранулизина через 6 месяцев лечения и кателицидина — через 3 месяца химиотерапии с последующим возвращением к исходному уровню.
Ключевые слова: туберкулез, дети, подростки, врожденный иммунитет, гранулизин, кателицидин
DYNAMIC CHANGES OF GRANULYSIN AND CATHELICIDIN IN CHILDREN AND ADOLESCENTS WITH DIFFERENT FORMS OF PULMONARY TUBERCULOSIS
Averbakh M.M. (Jr), Panova L.V., Gubkina M.F., Evseeva N.I.
Central Research Institute for Tuberculosis, Moscow, Russian Federation
Abstract. Granulysin and cathelicidin, the cytolytic molecules of innate immune system are important protective factors during infection with Mycobacterium tuberculosis. We present original data concerning high levels of granulysin and cathelicidin among the group of children and adolescents with latent TB infection.
Адрес для переписки:
Авербах Михаил Михайлович (мл.)
ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский
институт туберкулеза»
107564, Россия, Москва, Яузская аллея, 2.
Тел.: 8(499) 785-90-72.
Факс: 8 (499) 785-91-08.
E-mail: amm50@mail.ru
Образец цитирования:
М.М. Авербах (мл.), Л.В. Панова, М.Ф. Губкина, Н.И. Евсеева «Динамические изменения гранулизина и кателицидина у детей и подростков, больнькразличными формами туберкулеза органов дыхания» //Медицинская иммунология, 2018. Т. 20, № 5. С. 747-752. doi: 10.15789/1563-0625-2018-5-747-752
© Авербах М.М. (мл.) и соавт., 2018
Address for correspondence:
Averbakh Michael M. (Jr)
Central Research Institute for Tuberculosis
107564, Russian Federation, Moscow, Yauzskaya all., 2.
Phone: 7(499) 785-90-72.
Fax: 7 (499) 785-91-08.
E-mail: amm50@mail.ru
For citation:
M.M. Averbakh (Jr), L.V. Panova, M.F. Gubkina, N.I. Evseeva "Dynamic changes of granulysin and cathelicidin in children and adolescents with different forms of pulmonary tuberculosis", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2018, Vol. 20, no. 5,pp. 747-752.. doi: 10.15789/1563-0625-2018-5-747-752
DOI: 10.15789/1563-0625-2018-5-747-752
Patients with tuberculosis of the respiratory system exhibit significantly lower amounts of serum cathelicidin in destructive forms, as well as granulysin levels in "minor" forms of tuberculosis before starting the specific chemotherapy. The chemotherapy performed did not influence the serum granulysin and cathelicidin contents in patients with destructive tuberculosis, whereas the patients with "minor" forms (TLN/focal tuberculosis) revealed a significant increase in granulysin content after 6 months of treatment, and same trend for cathelicidin concentrations after 3 months of chemotherapy, followed by subsequent return to baseline values.
Keywords: tuberculosis, children, adolescent, innate immunity, granulysin, cathelicidin
Введение
Актуальность
Гранулизин и кателицидин, а также другие цитолитические молекулы ф-дефензин, перфо-рин, гранзим) относятся к веществам, обеспечивающим различные механизмы врожденного иммунитета. Гранулизин синтезируется в гранулах активированных цитотоксических CD8+T-клетках и NK-клетках в виде молекулы 15 kDa и частично 9 kDa и оказывает цитотоксическое действие на опухолевые клетки и широкий спектр грамположительных и грамотрицатель-ных бактерий и внутриклеточных бактерий. Применительно к M. tuberculosis гранулизин повреждает клеточную стенку через нарушение метаболизма липидов [14]. Кроме того, гранулизин индуцирует экспрессию генов различных провоспалительных цитокинов и хемокинов (RANTES, MCP-1, MCP-3, MIP-1a, IL-10, IL-1, IL-6 и IFNa). Также показано, что небольшая часть субпопуляции CD4+T-клеток может лизи-ровать M. tuberculosis-инфицированные макрофаги с использованием молекул гранулизина и перфорина [7]. Кроме того, показано, что при вакцинации БЦЖ образуются CD4+T-клетки памяти, обладающие способностью экспресси-ровать гранулизин и перфорин [8]. В дальнейшем было показано, что у больных туберкулезом детей и подростков имеются Т-клетки памяти с фенотипом CD4+CD45RO+, специфичные к M. tuberculosis и экспрессирующие гранулизин, причем основным источником являются про-лиферирующие Т-клетки памяти с фенотипом CFSElowCD4+CD45RO+ [10].
Кателицидин человека hCAP-18/LL-37 (human cationic antimicrobial protein,18 kDa — название относится к пептиду 18 кДа, полученному внеклеточным протеолизом из С-конца CAP человека [катионный антимикробный белок]) вырабатывается в плоскоклеточном эпителии
дыхательных путей, рта, языка, пищевода и кишечника. Кроме того, этот пептид секретируется в поту, слюне, раневой жидкости и в семенной плазме.
Методами иммуногистохимии и гибридизации in situ показана продукция hCAP18/LL-37 моноцитами, Т-лимфоцитами, В-лимфоцитами, NK-клетками, эпителиальными клетками и тучными клетками, что приводит к реализации его основной функции в виде аккумуляции на поверхности бактерий и повреждает их мембраны посредством образования ионных каналов, ведущих к гипоосмотическому лизису микроорганизмов. Он способен индуцировать секрецию хемо-кинов, включая CXCL8 (IL-8) и CCL2 (MCP-1), которые рекрутируют дендритные клетки, моноциты и нейтрофилы на место повреждения, и увеличивает индуцированную IL-1 секрецию IL-6, IL-10 [1].
Исследования, посвященные клинической значимости содержания гранулизина и кате-лицидина в сыворотке крови при туберкулезе не многочисленные по сравнению с исследованиями различных звеньев адаптивного иммунитета. Так, Sahiratmadjaa Е. и соавт. [11] показали, что содержание сывороточного гранулизина у взрослых, больных туберкулезом, до начала противотуберкулезной терапии было достоверно низким по сравнению с контрольной группой. При легкой/средней выраженности туберкулезных изменений (по Международной классификации туберкулеза) его количество составляло 1,1 нг/мл (0,1-11,2) и при значительной — 0,9 нг/мл (0,1-12,4), тогда как в контроле находилось на уровне 2,6 нг/мл (0,2-44,6). Через 2 месяца химиотерапии показатели повышались до 2,7 нг/мл (0,3-8,5) и 2,4 нг/мл (0,3-14,5) и к окончанию лечения составляли 4,1 нг/мл (1,1-28,8) и 3,8 нг/мл (0,5-22,5) соответственно. В аналогичных исследованиях на больных
туберкулезом детского возраста уровень сывороточного гранулизина до начала лечения составлял 0,45 нг/мл (0,33-2,98), а в контрольной группе был достоверно выше 1,4 нг/мл (0,22-6,00). После 4-месячного курса лечения уровень гранулизина достоверно возрастал и достигал уровня контрольной группы [6]. Прямая антимикробная активность hCAP18/LL-37 показана как в культуре M. tuberculosis, так и на экспериментальной микобактериальной инфекции при интратрахеальном заражении мико-бактериями (штамм H37Rv) у мышей Balb/с [4]. Исследования о содержании кателицидина в биологических жидкостях у больных туберкулезом единичны. Так, показано увеличение его концентрации в жидкости БАЛ у больных туберкулезом по сравнению со здоровым контролем [3]. Также было показано, что концентрация кателицидина была выше у больных активным туберкулезом при положительном посеве на ми-кобактерии и незначительно снижалась в первые 2 месяца химиотерапии [15]. Однако к настоящему моменту не ясна степень выраженности гранулизина и кателицидина у больных детско-подросткового возраста при деструктивных процессах и «малых» формах туберкулеза, учитывая появляющиеся данные о возможном клиническом применении синтетических аналогов гранулизина и особенно кателицидина в комплексе с терапией витамином Д [12].
Целью настоящего исследования явилось изучение содержания гранулизина и кателицидина плазмы крови у детей и подростков больных раз-
личными формами туберкулеза в процессе противотуберкулезной химиотерапии.
Материалы и методы
Исследование проведено на 49 больных, разделенных на три группы. В группу больных с деструктивным туберкулезом включено 15 человек в возрасте от 14 до 17 лет. Инфильтративный туберкулез в фазе распада и обсеменения диагностирован у 8 человек, диссеминированный туберкулез в фазе распада — у 3 человек, множественные туберкуломы в фазе распада и обсеменения — у 2 человек, фиброзно-кавернозный туберкулез — у 1 человека и казеозная пневмония — у 1 человека.
В исследование включено 25 больных в возрасте от 3 до 16 лет с «малыми» формами туберкулеза органов дыхания. Туберкулез внутригрудных лимфатических узлов (ТВГЛУ) диагностирован у 11 человек, в том числе с очагами отсева в легочную ткань — 2 человека; очаговый туберкулез легких — 14 человек. Большинство процессов были выявлены в фазе начинающейся кальцинации —10 человек и реже в фазе уплотнения — 10 человек, и в фазе инфильтрации — 5 человек.
Группу инфицированных МБТ составили 9 пациентов в возрасте от 5 до 14 лет, обратившихся по поводу контакта с больными туберкулезом и имевших положительные реакции на пробу Манту с 2 TE и Диаскинтест.
Гранулизин определяли в К3ЭДТА плазме методом иммуноферментного анализа с помощью набора SEB517Hu (Cloud-Clone Corp.) согласно инструкции изготовителя. Диапазон определе-
1850 1800 1750 1700 1650 §Ё 1600 = ^ 1550 1500 1450 1400 1350
Инфицирование МБТ Деструктивный ТБ ТВГЛУ/Очаговый ТБ Infection with МТB DestructiveTB TLN/Focal TB
"I 4
Инфицирование МБТ Деструктивный ТБ ТВГЛУ/Очаговый ТБ Infection with МТB DestructiveTB TLN/Focal TB
8
7
6
5
3
2
0
Рисунок 1. Содержание кателицидина до начала лечения
Figure 1. Cathelicidin content before treatment
Рисунок 2. Содержание гранулизина до начала лечения
Figure 2. Granulosin content before treatment
2500 2000 1500
¡ E ■ ™ 1000
500
0
I
i
T
0 мес. 0 mo.
Деструктивный ТБ DestructiveTB
3 мес. 3 mo.
6 мес. 6 mo.
ТВГЛУ/Очаговый ТБ TLN/Focal TB
0 мес. 0 mo.
Деструктивный ТБ DestructiveTB
3 мес. 3 mo.
6 мес. 6 mo.
ТВГЛУ/Очаговый ТБ TLN/Focal TB
Рисунок 3. Динамические изменения кателицидина и гранулизина
Figure 3. Dynamic changes of cathelicidin and granulosin
ния тест-системы — 0,25-15 нг/мл, минимальная определяемая концентрация — 0,08 нг/мл.
Кателицидин определяли в К3ЭДТА плазме методом иммуноферментного анализа с помощью набора CEC419Hu (Cloud-Clone Corp.) согласно инструкции изготовителя. Диапазон определения тест-системы 123,5-10 000 нг/мл, минимальная определяемая концентрация 47,4 нг/мл, концентрация белка в ЭДТА плазме у волонтеров составила 161-1041 нг/мл. Результаты обрабатывались статистически с помощью пакета Microsoft Ехсе1.
Результаты и обсуждение
Сравнение результатов содержания в плазме исследуемых факторов у 3 исследуемых групп показало, что до начала лечения уровень содержания кателицидина не имел достоверных различий между исследуемыми группами (деструктивный, ТВГЛУ/оча-говый и инфицированные — 1578,1±123,14, 1549,08±97,26 и 1752,43±225,3 соответственно) (рис. 1). Содержание гранулизина было более низкое в группе больных с ТВГЛУ/очаговым туберкулезом по сравнению с группой инфицированных МБТ (5,14±0,18 нг/мл и 6,37±0,12 нг/мл, p = 0,009449 соответственно) (рис. 2.).
В результате проводимой противотуберкулезной химиотерапии содержание кателицидина в плазме в группе деструктивного туберкулеза не менялось, а в группе больных «малыми» формами туберкулеза достоверно возрастало к 3-м месяцам до 2011,3±134,1 нг/мл (p = 0,042984) и затем снижалось до уровня первоначальных показателей (рис. 3).
Содержание гранулизина плазмы крови у больных деструктивным туберкулезом не меня-
лось в процессе лечения (до лечения -6,17±0,78, через 3 и 6 месяцев — 4,96±0,63 и 4,79±0,69 соответственно), а в группе больных «малыми» формами туберкулеза достоверно возрастало к 6-ти месяцам с 5,13±0,18 нг/мл до 6,56±0,5 нг/мл (p = 0,023631), что было сравнимо с показателями у группы инфицированных МБТ пациентов (6,37±0,12 нг/мл).
В экспериментальных и клинических исследованиях по иммунологии туберкулеза клеточным и гуморальным компонентам врожденного иммунитета традиционно отведена вторичная роль, и в основном рассматриваются такие компоненты, как нейтрофильные лейкоциты, Toll-подобные рецепторы, NK-клетки и в значительно меньшей степени цитолитические молекулы (гранулизин, кателицидин, р-дефензин, перфо-рин, гранзим) [9]. Существует представление, что реакции врожденного иммунитета преимущественно активны на стадии «латентной» фазы туберкулеза при наличии положительных кожных проб и IGRA-тестов и малозначимы при активном функционировании специфического адаптивного иммунитета [5].
Нами получены данные о высоких показателях гранулизина и кателицидина у группы инфи-цированнных МБТ детей и подростков, и даже достоверно более высоких для гранулизина по сравнению с группой ТВГЛУ/очагового туберкулеза. В процессе лечения в последнем случае уровень фактора достоверно возрастал до уровня группы инфицированных МБТ. Сходная динамика изменения этого фактора у детей представлена в исследовании di Liberto D. и соавт. [6]. Вероятно, это можно связать с возрастанием субпопули-ции CD8 Т-лимфоцитов, которая увеличивается в результате успешной химиотерапии [2].
5
4
3
2
0
Нами выявлено достоверное возрастание концентрации кателицидина у больных ТВГЛУ/оча-говым туберкулезом через 3 месяца после начала специфической химиотерапии с последующим возвращением к исходному уровню у нелеченых больных. Нам представляется, что данный эффект может возникать вследствие временной активизации моноцитарно-макрофагального звена иммунитета и выработки кателицидина моноцитами. Подобный эффект описан Fiske С.Т. и со-авт. [7], которые показали подъем продукции хемокинов CCL2 (МСР-1) у этой категории больных в результате проведенного лечения [7].
Таким образом, активная продукция цитоли-тических молекул гранулизина и кателицидина характерна для инфицированных МБТ пациентов. Значимость продукции этих факторов при деструктивных формах туберкулеза невелика вследствие преобладания реакций Т-клеточного звена адаптивного иммунитета. Однако роль ка-телицидина и особенно гранулизина более заметна при «малых» формах туберкулеза, где в результате специфической химиотерапии происходит подъем уровня их продукции до уровня инфицированных МБТ пациентов.
Список литературы / References
1. Agerberth B., Charo J., Werr J., Olsson B., Idali F., Lindbom L., Kiessling R., Jornvall H., Wigzell H., Gudmundsson G.H. The human antimicrobial and chemotactic peptides LL-37 and alpha-defensins are expressed by specific lymphocyte and monocyte populations. Blood, 2000, Vol. 96, pp. 3086-3093.
2. Caccamo N., Meraviglia S., La Mendola C., Guggino G., Dieli F., Salerno A. Phenotypical and functional analysis of memory and effector human CD8 T cells specific for mycobacterial antigens. J. Immunol., 2006, Vol. 177, pp. 1780-1785.
3. Cakir E., Torun E., Gedik А.Н., Umutoglu T., Aktas E.C., Topuz U., Deniz G. Cathelicidin and human P-defensin 2 in bronchoalveolar lavage fluid of children with pulmonary tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung. Dis., 2014, Vol. 18, pp. 671-675.
4. Castañeda-Delgado J., Hernández-Pando R., Serrano C.J., Aguilar-León D., León-Contreras J., RivasSantiago C., Méndez R., González-Curiel I., Enciso-Moreno A., Rivas-Santiago B. Kinetics and cellular sources of cathelicidin during the course of experimental latent tuberculous infection and progressive pulmonary tuberculosis. Clin. Exp. Immunol., 2010, Vol. 161, pp. 542-550.
5. Dheda K., Schwandre S.K., Zhu B., van Zyl-Smit S.K., Zhang V. The immunology of tuberculosis: From bench to bedside. Respirology, 2010, Vol. 15, pp. 433-450.
6. di Liberto D., Buccheri S., Caccamo N., Serena Meraviglia S., Amelia Romano A., di Carlo P., Titon L., Francesco Dieli F., Krensky AM.. , Salerno A. Decreased serum granulysin levels in childhood tuberculosis which reverse after therapy. Tuberculosis (Edinb), 2007, Vol. 87, pp. 322-328.
7. Fiske C.T., de Almeida C.N., Shintani А.К., Kalam A., Sterlinga T.R. Abnormal immune responses in persons with previous extrapulmonary tuberculosis in an in vitro model that simulates in vivo infection with Mycobacterium tuberculosis. Clin. Vaccine Immunol., 2012, Vol. 19, pp. 1142-1149.
8. Gansert J.L., Kiessler V., Engele M., Wittke F., R5llinghoff M., Krensky A.M., Porcelli S.A., Modlin R.L., Stenger S. Human NKT cells express granulysin and exhibit antimycobacterial activity. J. Immunol., 2003, Vol. 170, pp. 3154-3161.
9. Korbel D.S., Schneider B.E., Schaible U.E. Innate immunity in tuberculosis: myths and truth. Microbes Infect., 2008, Vol. 10, 995e1004. doi: 10.1016/j.micinf.2008.07.039.
10. Mueller H., Fae K.C., Magdorf M., Ganoza C.A., Wahn U., Guhlich U., Feiterna-Sperling C., Kaufmann S.H.E. Granulysin-expressing CD4+ T cells as candidate immune marker for tuberculosis during childhood and adolescence. PLoS ONE, 2011, Vol. 6, Issue 12, e29367. doi: 10.1371/journal.pone.0029367.
11. Sahiratmadjaa Е., Alisjahbanad В., Buccherie S., Di Libertoe D., de Boera T., Adnanc I., van Crevelf R., Kleina M.R., van Meijgaardena K.E., Nelwang R.H.H., van de Vosseb E., Dielie F., Ottenhoff T.H.M. Plasma granulysin levels and cellular interferon-y production correlate with curative host responses in tuberculosis, while plasma interferon-^ levels correlate with tuberculosis disease activity in adults. Tuberculosis, 2007, Vol. 87, pp. 312-321.
12. Selvaraj P. Vitamin D, vitamin D receptor, and cathelicidin in the treatment of tuberculosis. Vitam. Horm., 2011, Vol. 86, pp. 307-324.
13. Soehnlein O., Zernecke A., Eriksson E.E., Rothfuchs A.G., Pam C.T., Herwald H., Bidzhekov K., Rottenberg M.E., Weber C., Lindbom L. Neutrophil secretion products pave the way for inflammatory monocytes. Blood, 2008, Vol. 112, pp. 1461-1567.
14. Krensky A.M., Clayberger C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens, 2009, Vol. 73, pp. 193-198.
15. Yamshchikov A.V., Kurbatova E.V., Kumari M., Blumberg H.M., Ziegler T.R., Ray S.M., Tangpricha V. Vitamin D status and antimicrobial peptide cathelicidin (LL-37) concentrations in patients with active pulmonary tuberculosis. Am. J. Clin. Nutr., 2010, Vol. 92, pp. 603-611.
Авторы:
Авербах М.М. (мл.) — д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела иммунологии ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Панова Л.В. — д.м.н., ведущий научный сотрудник детско-подросткового отдела ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Губкина М.Ф. — д.м.н., ведущий научный сотрудник детско-подросткового отдела ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Евсеева Н.И. — младший научный сотрудник детско-подросткового отдела ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Поступила 29.09.2017 Отправлена на доработку 10.10.2017 Принята к печати 08.11.2017
Authors:
Averbakh M.M. (Jr), PhD, MD (Medicine), Professor, Main Research Associate, Department of Immunology, Central Research Institute for Tuberculosis, Moscow, Russian Federation
Panova L.V., PhD, MD (Medicine), Senior Research Associate, Pediatric Department, Central Research Institute for Tuberculosis, Moscow, Russian Federation
Gubkina M.F., PhD, MD (Medicine), Senior Research Associate, Pediatric Department, Central Research Institute for Tuberculosis, Moscow, Russian Federation
Evseeva N.I., Junior Research Associate, Pediatric Department, Central Research Institute for Tuberculosis, Moscow, Russian Federation
Received 29.09.2017 Revision received 10.10.2017 Accepted 08.11.2017
Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология Meditsinskaya Immunologiya
2018, Т. 20, № 5, стр. 753-762 . » 2018, Vol. 20, No 5,pp. 753-762
© 2018, СПбРО РААКИ MCthOUS © 2018, SPb RAACI
АНАЛИЗ СПЕКТРА АНТИФОСФОЛИПИДНЫХ АНТИТЕЛ У ПАЦИЕНТОВ С ТРОМБОЗАМИ И ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ
Ткаченко О.Ю.1, Лапин С.В.1, Шмонин А.А.1, 2' 3, Соловьева Л.Н.2, Бондарева Е.А.1, Сельков С.А.4, Чепанов С.В.4, Тотолян Арег А.1, 5, Роггенбук Дирк6, 7
1ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
2 СПбГБУЗ «Городская больница № 26», Санкт-Петербург, Россия
3 ФГБУ«Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова», Санкт-Петербург, Россия
4 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия
5 ФБУН«Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера», Санкт-Петербург, Россия
6 Бранденбургский технический университет, Коттбус-Зенфтенберг, Зенфтенберг, Германия
7 GA Generic Assays GmbH, Далевиц, Германия
Резюме. Лабораторная диагностика антифосфолипидного синдрома (АФС) состоит в выявлении антифосфолипидных антител (АФА) методом иммуноферментного анализа (ИФА), а именно в детекции антикардиолипиновых (аКл) антител и антител к бета-2-гликопротеину (ap2GP1). Использование классических ИФА тест-систем затруднено их недостаточной стандартизацией. Новым подходом к детекции антифосфолипидных антител является использование мультиплексного лайн-блоттинга (ЛБ), преимуществом которого является сорбция антигенов на гидрофобной PVDF-мембране и детекция спектра АФА.
Целью данного исследования является анализ диагностической ценности нового ЛБ в постановке серологического диагноза АФС.
Нами была собрана коллекция образцов сывороток 45 пациентов с некардиоэмболическими ише-мическими инсультами, 19 пациентов с рецидивирующими тромбозами глубоких вен нижних конечностей и 44 пациента с привычным невынашиванием беременности, а также 50 клинически здоровых доноров. В данных сыворотках были измерены аКл IgG, аКл IgM, ap2GP1 методом ИФА с помощью тест-систем фирм Euroimmun (ПР1) и Orgentec Diagnostica (ПР2) и аКл IgG, аКл IgM, ap2GP1, а также некритериальные АФА — методом иммуноблоттинга на тест-системе фирмы Medipan (ПР3).
При использовании ИФА тест-систем ПР1 аКл и ap2GP1 детектировались у 30,5 % пациентов. ИФА
Адрес для переписки:
Ткаченко Ольга Юрьевна ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова»
197022, Россия, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого,
6-8, корп. 28.
Тел.: 8(921) 095-94-98.
E-mail: tkachenie@mail.ru
Address for correspondence:
Tkachenko Olga Yu.
First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University 197022, Russian Federation, St. Petersburg, L. Tolstoy str., 6-8, bldg 28.
Phone: 7 (921) 095-94-98. E-mail: tkachenie@mail.ru
Образец цитирования:
О.Ю. Ткаченко, С.В. Лапин, А.А. Шмонин, Л.Н. Соловьева, Е.А. Бондарева, С.А.. Сельков, С.В. Чепанов, Арег А Тотолян, Дирк Роггенбук «Анализ спектра антифосфолипидных антител у пациентов с тромбозами и привычным невынашиванием беременности» // Медицинская иммунология, 2018. Т. 20, №5. С. 753-762. doi: 10.15789/1563-0625-2018-5-753-762 © Ткаченко О.Ю. и соавт., 2018
For citation:
O.Yu. Tkachenko, S.V. Lapin, A.A. Shmonin, L.N. Solovyova, E.A Bondareva, S.A. Selkov, S.V. Chepanov, AregA Totolian, Dirk Roggenbuck "Ranging of antiphospolipid antibodies in the patients with thrombophilia and recurrent miscarriage", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2018, Vol. 20, no. 5,pp. 753-762. doi: 10.15789/1563-0625-2018-5-753-762 DOI: 10.15789/1563-0625-2018-5-753-762
методом на тест-системах ПР2 АФА были обнаружены у 38% пациентов. Методом ЛБ аКл и ap2GP1 были выявлены у 30% пациентов. Встречаемость средних и высоких титров АФА, измеренных методом ИФА на тест-системах ПР1 и ПР2, составила 12 и 11% соответственно, а методом ЛБ — 16,6%. При анализе спектра АФА методом ЛБ чаще всего обнаруживались ap2GP1, аФс, аКл, аАн V, аФк.
Метод мультиплексного лайн-блоттинга ЛБ показывает более высокую чувствительность при детекции средних и высоких титров АФА, а также позволяет выявить пациентов с множественной АФА позитивностью.
Ключевые слова: антифосфолипидный синдром, антифосфолипидные антитела, иммуноферментный анализ, лайн-блоттинг, новые методы
RANGING OF ANTIPHOSPOLIPID ANTIBODIES IN THE PATIENTS WITH THROMBOPHILIA AND RECURRENT MISCARRIAGE
Tkachenko O.Yu.a, Lapin S.V.a, Shmonin A.A.a' b, Solovyova L.N.b, Bondareva E.A.a, Selkov S.A.d, Chepanov S.V.d, Totolian Areg A.a' е, Roggenbuck Dirkf' g
a First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University, St. Petersburg, Russian Federation
b City Hospital No. 26 of St. Petersburg, St. Petersburg, Russian Federation
c V. Almazov North-West Federal Medical Research Center, St. Petersburg, Russian Federation
d D. Ott Research Institute of Obstetrics, Ginecology and Reproductology, St. Petersburg, Russian Federation
e St. Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russian Federation
f Brandenburg University of Technology, Cottbus-Senftenberg, Senftenberg, Germany
g GA Generic Assays GmbH, Dahlewitz, Germany
Abstract. Laboratory diagnosis of antiphospholipid syndrome (APS) is based on detection of antiphospholipid antibodies (aPLs). E.g., aPLs are directed against conformational epitopes of the so-called "co-factor" proteins: p2-gycoprotein 1 (P2-GP1), annexin V (An V) and prothrombin (Pt) that are formed during interaction with phospholipids — cardiolipin (CL), phosphatic acid (Pha), phosphatidylcholine (Pch), phosphatidylethanolamine (Pe), phosphatidylglycerol (Pg), phosphatidylinositol (Pi), phosphatidylserine (Ps). A routine methodology of detection based on ELISA testing is challenged by new tests when the antigen is absorbed on another kind of support like microbeads or membranes that can influence density of conformational epitopes for aPL's binding. The aim of our study was to compare the results of aPLs detection by ELISA and multi-line immunodot assay (MLD).
We collected blood serum samples from 45 patients with noncardioembolic ischemic strokes, 19 patients with recurrent deep vein thrombosis of lower limbs, 44 females with recurrent miscarriages, and 50 clinically healthy donors. To compare the results of aPL detection by ELISA and MLD kits, the test systems from different manufacturers were evaluated. We used an ELISA kits for detection of antibodies to CL IgG, aCL IgM, P2-GP1 produced by Euroimmun AG (Mr1) and Orgentec Diagnostica GmbH (Mr2) and MLD — for detection of antibodies to CL, P2-GP1, Pch, Pe, Pg, Pi, Ps, AnV and Pt (Medipan GmbH, Mr3).
When a cut-off titer was used as the main index, 30.5% of patients were aPLs-positive with ELISA method by Mr1 and 38%, wiht Mr2. By MLD aPls were detected in 30% of patients. In the same cohort, medium and high aPLs titers (> 40 U/mL) were determined in 12% of patients using ELISA kits. Positive and highly positive aPLs titers were determined in 16% when using a new method by Mr3. Medium and high titer were detected only for antibodies to P2-GP1, CL, An V, Pha and Phs.
The use of ELISA approach for detection of aPLs in patients with thrombosis and obstetric pathology is associated with relatively high number of low-positive ELISA results. Due to higher sensitivity for medium and high aPLs titers, MLD testing may be used as a confirming method for APS diagnosis.
Keywords: antiphospholipid syndrome, antiphospholipid antibodies, enzyme-linked immunosorbent assays, multi-line dot assay, new methods
Исследование было поддержано грантом Российского научного фонда. Соглашение РНФ № 16-15-00118.
Введение
Антифосфолипидные антитела (АФА) — семейство аутоантител, направленных против конформационных эпитопов плазменных белков, которые образуются в результате их взаимодействия с анионными фосфолипидами [2, 3, 12]. Это семейство включает антитела, направленные против фосфолипид-связываю-щих, или «кофакторных», белков, а именно р2-гликопротеина 1 (ap2GP1), аннексина V (аАн V) и протромбина (аПт). Также выделяют антитела к отрицательно заряженным фосфолипидам — к кардиолипину (аКл), фосфатидилглицеролу (аФг), фосфатидилинозитолу (аФи), фосфа-тидилсерину (аФс), фосфатидиловой кислоте (аФк), и нейтрально заряженным фосфолипидам — фосфатидилэтаноламину (аФэ), фосфати-дилхолину (аФх) [16, 25].
Выявление аКл и ap2GP1 в качестве диагностического показателя включено в лабораторные критерии антифосфолипидного синдрома (АФС) [19], а детекция аКл — в лабораторные критерии системной красной волчанки (СКВ) SLIСС 2012 [24]. Однако АФА обнаруживаются у пациентов с другими аутоиммунными, инфекционными и лимфопролиферативными заболеваниями, а также у здоровых доноров, не проявляя себя тромбозами или акушерской патологией [8, 9, 14, 27, 28]. По мнению ряда авторов [17], разные представители семейства АФА различаются по уровню патогенности, который также зависит от используемого лабораторного метода их определения.
Исторически АФА определяли с помощью метода радиоиммунного анализа [13], однако в настоящее время широко используется имму-ноферментный анализ (ИФА). Отсутствие стандартизации ИФА тест-систем ведет к низкой сопоставимости результатов при использовании тест-систем разных производителей [7]. Использование ИФА приводит к большому количеству ложноположительных результатов и необходимости повторного обследования. В связи с этим актуальна оценка клинико-диагностических параметров новых твердофазных методов для детекции АФА.
Особого внимания заслуживает метод лайн-блоттинга (ЛБ) [11]. Преимуществом ЛБ при сравнении с ИФА является «мультиплексный» подход, позволяющий единовременно детекти-
ровать до 10 разновидностей АФА. Кроме того, уникальные особенности гидрофобной PVDF-мембраны позволяют достичь более высокой плотности антигена. Целью данного исследования является анализ диагностической ценности нового метода ЛБ в постановке серологического диагноза АФС.
Материалы и методы
Нами были собраны 44 образца сыворотки крови пациентов с некардиоэмболическими ишемическими инсультами, 19 пациентов с рецидивирующими тромбозами глубоких вен нижних конечностей, 45 пациентов с акушерской патологией, а также 50 здоровых доноров. Все пациенты, включенные в исследование, были моложе 50 лет и не имели других аутоиммунных, лимфопролиферативных и хронических инфекционных заболеваний в анамнезе.
Согласно рекомендациям по детекции АФА для твердофазных тест-систем [6], исследования на АФА были проведены в течение 2-3 дней после взятия крови, пробы поставлены в дублях, проведен расчет внутрилабораторного референтного интервала (РИ) непараметрическим методом 99 перцентиль для каждой из ИФА тест-систем.
Для исследования клинической значимости результатов тестов методом ЛБ и сравнения с результатами ИФА были оценены тест-системы различных производителей. Мы использовали ИФА тест-системы фирмы Euroimmun (Германия), в дальнейшем именуемой Производитель 1 (ПР1), ИФА тест-системы фирмы Orgentec Diagnostica (Германия), Производитель 2 (ПР2), и тест-системы фирмы Medipan (Германия), основанные на методе ЛБ, Производитель 3 (ПР3), в соответствии с инструкцией. Получены результаты измерений ИФА тест-систем в оптических единицах и результаты ЛБ метода в денситоме-трических единицах, оцененных программой DotBlot-Analyzer как слабоположительный (+), положительный (++) и восокоположительный (+++) результаты. В собранных образцах сыворотки крови измерены аp2GP1, аКл классов IgG и IgM, антитела методом ИФА, кроме того широкий спект аутоантител, в том числе аКл, аp2GP1, аФх, аФэм, аФг, аФэл, аФс, аФк, аАн V и аПр классов IgG и IgM исследовали методом ЛБ.
Для сравнительного анализа полученных результатов были использованы методы описательной статистики (вычисление средних значений, средних квадратических отклонений, медианы) и непараметрические (критерий Хи-квадрат Пирсона) методы статистической обработки.
Результаты
Референтные интервалы (РИ) ИФА тестов всех производителей наборов реактивов были получены путем обследования 50 сывороток здоровых доноров.
Для сравнения методов ИФА и ЛБ была оценена частота выявления АФА в каждой группе пациентов, с учетом верхней границы РИ (табл.1).
В общей когорте пациентов при использовании ИФА тест-систем ПР1 аКл и ap2GP1 детектировались в 30,5 % образцах, ИФА методом на тест-системах ПР2 АФА были обнаружены у 38% пациентов. Методом ЛБ аКл и ap2GP1 были выявлены у 30% пациентов.
Так как авторы международных критериев АФС указывают на клиническое значение только средних и высоких титров АФА, мы проанали-
ТАБЛИЦА 1. ВСТРЕЧАЕМОСТЬ АФА В ГРУППАХ ПАЦИЕНТОВ С НЕКАРДИОЭМБОЛИЧЕСКИМИ ИШЕМИЧЕСКИМИ ИНСУЛЬТАМИ, С РЕЦИДИВИРУЮЩИМИ ТРОМБОЗАМИ ГЛУБОКИХ ВЕН НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ И ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ, ИЗМЕРЕННЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАМИ РАЗНЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
TABLE 1. THE FREQUENCY OF APA IN GROUPS OF PATIENTS WITH NONCARDIOEMBOLIC ISCHEMIC STROKES, RECURRENT DEEP VEIN THROMBOSIS OF THE LOWER EXTREMITIES AND RECCURENCE MISCARRIAGE, MEASURED BY KITS FROM DIFFERENT MANUFACTURERS
ПР MR АФА aPLs BrPM* ULRR* Пациенты с острым инсультом Patients with noncardioembolic ischemic strokes (n = 44) Пациентки с невынашиванием беременности Patients with reccurence miscarriage (n = 45) Пациенты с тромбозом глубоких вен Patients with recurrent deep vein thrombosis of the lower extremities (n = 19) Всего All (n = 108)
аКл (IgG + IgM) aCl (IgG + IgM) > 12 U/ml 1 (2,2%) 19 (42%) 3 (15,7%) 23 (21,2%)
ПР1 > 40 U/ml 1 (2,2%) 2 (4,5%) 1 (5,2%) 4 (3,7%)
MR1 aß2GP1 > 20 U/ml 3 (6,8%) 8 (18%) 1 (5,2%) 12 (11,1%)
(IgGAM) > 40 U/ml 1 (2,2%) 7 (15,5%) 1 (5,2%) 9 (8,2%)
аКл (IgG + IgM) aCl (IgG + IgM) > 10 U/ml 14 (31,8%) 11 (24%) 2 (10,5%) 27 (25%)
ПР2 > 40 U/ml 1 (2,2%) 2 (4,5%) 1 (5,2%) 4 (3,7%)
MR2 aß2GP1 > 10 U/ml 10 (22,7%) 16 (35%) 2 (10,5%) 28 (25,9%)
(IgGAM) > 40 U/ml 1 (2,2%) 11 (24%) 1 (5,2%) 8 (12%)
аКл (IgG + IgM) aCl (IgG + IgM) > + 2 (4,5%) 11 (24%) 6 (31,5%) 19 (17,5)
ПР3 > ++ 2 (4,5%) 1 (2,2%) 3 (15,7%) 6 (5,5%)
MR3 aß2GP1 > + 10 (22,7%) 11 (24%) 5 (26,3%) 26 (24%)
(IgGAM) > + 4 (9%) 7 (15,5%) 1 (5,2%) 12 (11,1%)
Примечание. ПР1 - Euroimmun (Германия), ПР2 - Orgentec Diagnostica (Германия), ПР3 - Medipan (Германия); ВГРИ - верхняя граница референтного интервала: рассчитана непараметрическим методом 99 перцентиль при детекции АФА в группе 50 здоровых доноров.
Note. MR1, Euroimmun (Germany); MR2, Orgentec Diagnostica (Germany); MR3, Medipan (Germany); ULRR is the upper limit of the reference range: calculated by the nonparametric 99 percentile method on APA detection in the group of 50 healthy donors.
1 Ii
CD CD
30 25 20 15 10
nP1/MR1 DnP2/MR2 □ nP3/MR3
19
1 ё CD CD
35 30 25 20 15 10 5
nP1/MR1 □ nP2/MR2 □ nP3/MR3
29
26
12 12
8 5 1
гГ
>ВГРИ / > ULRR
> 40 U/ml / > ++
> ВГРИ / > ULRR
> 40 U/ml / > ++
Рисунок 1. Встречаемость антикардиолипиновых антител, измеренных тест-системами ПР1, ПР2, ПР3 Примечание. ВГРИ - верхняя граница референсного интервала, ПР1 - ИФА тест-системы фирмы Euroimmun (Германия), ПР2 - ИФА тест-системы фирмы Orgentec Diagnostika (Германия), ПР3 - метод ЛБ фирмы Medipan. Figure 1. Frequency of anticardiolipin antibodies detected by kits of MR1, MR2, MR3
Note. ULRR, upper limit of reference range; MR1, ELISA kits by Euroimmun (Germany); MR2, ELISA kits by Orgentec Diagnostika; MR3, multi-line immunodot assay by Medipan.
Рисунок 2. Встречаемость антител к 02-гликопротеину 1, измеренных тест-системами ПР1, ПР2, ПР3 Примечание. См. примечание к рисунку 1.
Figure 2. Frequency of antibodies to p2-glycoprotein 1 detected by kits of MR1, MR2, MR3 Note. As for Figure 1.
1 I?
CD CD
30 25 20 15 10 5 0
IgG/IgM (> +) □ IgG/IgM (> ++)
15,6
37 I I 37 37
П П 0,9 0,9
I 10,0 I 10,0 I 10,0 I—,0,0 I_,0,0
Г *
oe, /
ф, Ж
r
#
Рисунок 3. Спектр антифосфолипидных антител, измеренный методом лайн-блоттинга
Примечание. АФА - антифосфолипидные антитела, aß2GP1 - антитела к р2-гликопротеину 1, аКл - антитела к кардиолипину, аАнV - антитела к аннексину, аПт - антитела к протромбину, аФс - антитела к фосфатидилсерину, аФг - антитела к фосфатидилглицеролу, аФи - антитела к фосфатидилинозитолу, аФК - антитела к фосфатидиловой кислоте, аФэ - антитела к фосфатидилэтаноламину, аФх - антитела к фосфатидилхолину, ПР1 - ИФА тест-системы фирмы Euroimmun (Германия), ПР2 - ИФА тест-системы фирмы Orgentec Diagnostika (Германия), ПР3 - метод ЛБ фирмы Medipan. Figure 3. Spectrum of aPLs detected by multi-line immunodot assay
Note. aPLs, antiphospholipid antibodies; aß2GP1, antibodies to ß2-Glycoprotein 1; aCL, antibodies to cardiolipins; aAnV, antibodies to annexin V; aPr, antibodies to prothrombin; aPs, antibodies to phosphatidylserine; aPg, antibodies to phosphatidylglycerol; aPi, antibodies to phosphatidylinositol; aPAc, antibodies to phosphatidic acid; aPe, antibodies to phosphatidylethanolamine; aPh, antibodies to phosphatidylcholine; MR1, ELISA kits by Euroimmun (Germany); MR2, ELISA kits by Orgentec Diagnostika; MR3, multi-line immunodot assay by Medipan.
7
4
5
0
0
зировали встречаемость АФА, учитывая только средние и высокие титры для ИФА тест-систем, а также только положительные и высокоположительные результаты для ЛБ (рис. 2). Частота выявления средних и высоких титров АФА, измеренных методом ИФА на тест-системах ПР1 и ПР2, составила 12 и 11% соответственно, а методом ЛБ — 16,6%. Ввиду небольшого объема выборки положительных пациентов статитисти-чески достоверными являются данные, полученные в результате детекции аКл IgG методом ЛБ по сравнению с ИФА тест-системами ПР2 (p = 0,03). Таким образом, новый метод ЛБ позволяет добиться более высокой эффективности детекции при средних и высоких титрах АФА (рис. 1, рис. 2).
Так как одним из преимуществ ЛБ является возможность обнаружения 10 видов АФА, была оценена частота выявления как аБ2GP1, аКл, так и других АФА — аФк, аФх, аФэм, аФг, аФэл, аФс, аАн V и аПр (рис. 3). В общей когорте пациентов чаще всего обнаруживались ap2GP1, аФс, аКл, аАн V, аФк.
Анализ спектра антифосфолипидных антител может играть значимую роль в клинической практике. Мы оценили встречаемость одной разновидности АФА, а также единовременного выявления двух, трех и более АФА в общей когорте пациентов. У 19% пациентов обнаружен только один представитель семейства АФА: в 4,6% случаях детектировался только ap2GP1, в 3,7% — аАн V и аФс, в 2,7% — аФк, а также аФг, аФэл. В 13% случаев единовременно детектировались два маркера, одним из которых в 6,4% случаев были ap2GP1, в 4,6% - аФк. Три и более АФА детектировались в 8% случаев, наиболее часто — комбинации ap2GP1, аАн V и аФс. Нами не было обнаружено ассоциаций между спектром антифосфолипидных антител и клинической картиной на примере данной когорты больных.
Обсуждение
Согласно международным критериям АФС, лабораторная диагностика играет решающую роль в постановке диагноза и дальнейшей тактике ведения больных. Однако несовершенство традиционных методов выявления АФА ведет к необходимости повторного обследования пациентов, что затрудняет своевременную постановку диагноза. Действующие критерии рекомендуют учитывать в диагностике АФС только высокие титры АФА, в то время как на практике низкие титры антител встречаются в разы чаще, но их клиническое значение установить обычно не удается.
Для диагностики АФС активно разрабатываются новые методы детекции аутоантел [1, 2, 4, 5, 6], такие как хемилюминесцентный анализ и мультиплексный метод лайн-блоттинга [15]. Данные методы твердофазного анализа характеризуются новыми подходами к сорбции антигена, обеспечивая большую плотность антигена на твердофазном носителе. Особенностью ЛБ является высокое сродство фосфолипидов к PVDF-мембране, что позволяет ориентировать гидрофильные участки молекул, обеспечивая их взаимодействие с белковыми кофакторами [11]. Результатом оптимизации характеристик твердой фазы становится увеличение аналитической чувствительности теста и расширение диапазона измеряемых показателей.
Для определения встречаемости АФА с помощью разных методов мы исследовали 3 группы пациентов с клиническими проявлениями АФС. В первую вошли 44 пациента с некардио-эмболическими ишемическими инсультами, во вторую — 19 пациентов с рецидивирующими тромбозами глубоких вен нижних конечностей, третья состояла из 45 пациентов с двумя и более выкидышами. В качестве группы сравнения использовались сыворотки крови 50 здоровых доноров. Мы провели сравнительный анализ встречаемости ap2GP 1 и аКл между методом ЛБ и ИФА тест-системами ПР1 и ПР2, а также встречаемость спектра 10 разновидностей АФА в группах пациентов с клиническими проявлениями АФС, измеренных с помощью ЛБ.
Сходимость ИФА тест-систем ПР1, ПР2 и ПР3 для детекции ap2GP1 составила 75%, для детекции аКЛ — 84% соответственно. Большинство АФА при использовании ИФА тест-систем и метода ЛБ в нашем исследовании были обнаружены в низком титре. При оценке встречаемости АФА вне зависимости от титра мы не выявили преимуществ метода ЛБ по сравнению с методом ИФА. Но при анализе частоты средних и высоких титров новый метод показал достоверно более высокую чувствительность для детекции маркера АФС — аКл. Это позволяет избавиться от значительного числа низкоположительных неспецифических реакций АФА, которые могут быть обусловлены транзиторными непатогенными антителами. Значимость выявления АФА в средних и высоких титрах, их выраженная связь с клиническими проявлениями была описана рядом авторов и включена в международные критерии АФС [15, 16].
Важность оценки спектра АФА для определения риска клинических проявлений подчеркивается исследованиями Ре^о и соавт. (2005). При
проспективном анализе когорты больных АФС было установлено, что одновременное выявление нескольких разновидностей АФА позволяет установить риск развития тромбоэмболических событий и патологии беременности [22, 23]. Пациенты, у которых одновременно детектируются аКл и аp2GP1 и ВАК в среднем или высоком титре, состоят в группе наиболее высокого риска развития клинических проявлений АФС. Основываясь на этом наблюдении, для диагностики АФС и стратификации риска развития осложнений Otomo и соавт. [21] разработали диагностический комплекс, включающий 5 коагуляционных тестов для детекции ВАК и 6 ИФА тестов (аКл класса IgG/IgM, аp2GP1 класса IgG/IgM, фосфатидилсерин-зависимые аПр класса IgG/IgM) [21]. Позже была создана шкала для стратификации риска АФС GAPSS [26], включающая, помимо лабораторных маркеров, демографические и клинические показатели. В связи с этим важным преимуществом метода ЛБ является единовременная детекция аКл,
аp2GP1, аФх, аФэм, аФг, аФэл, аФс, аФк, аАн V и аПр классов IgG и IgM. Мы оценили встречаемость одного, двух, трех и более АФА в общей когорте пациентов, обследованных с помощью метода ЛБ. В нашем исследовании у 19% пациентов обнаружен только один маркер АФС, два и более маркера — в 21% случаев. Таким образом, можно выделить значительное количество случаев, при котором АФС подтверждается несколькими серологическими биомаркерами. В проведенной работе нам не удалось выявить взаимосвязи между клинической картиной и встречаемостью одного, двух, трех и более АФА у обследованных нами пациентов, что может быть обусловлено небольшим размером группы и коротким временем наблюдения.
Таким образом, метод мультиплексного лайн-блоттинга показывает более высокую чувствительность при детекции средних и высоких титров АФА, а также позволяет выявить пациентов с множественной серологической позитивностью.
Список литературы / References
1. Лапин С.В., Мазинг А.В., Булгакова Т.В., Маслянский А.Л., Иливанова Е.П., Козаренко А.А., Тото-лян А.А. Аналитические и диагностические характеристики отечественной тест-системы для выявления антител к циклическому цитруллиновому пептиду // Клиническая лабораторная диагностика, 2011. № 12. С. 12-17. [Lapin S.V., Mazing A.V., Bulgakova T.V., Maslyansky A.L., Ilivanova E.P., Kozarenko A.A., Totolian A.A. Analytical and diagnostic characteristics of the domestic test system for detection of antibodies to cyclic citrulline peptide. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics, 2011, no. 12, pp. 12-17. (In Russ.)]
2. Лапин С.В., Тотолян A.A. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний. СПб.: Человек, 2006. 128 с. [Lapin S.V., Totolian A.A. Immunological laboratory diagnostics of autoimmune diseases]. St. Petersburg: Chelovek, 2006. 128 p.
3. Лапин С.В., Тотолян A.A. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний. СПб.: Человек, 2010. 272 с. [Lapin S.V., Totolian A.A. Immunological laboratory diagnostics of autoimmune diseases]. St. Petersburg: Chelovek, 2006. 272 p.
4. Созина A.B., Иливанова Е.П., Шульман A.M., Шульман M.A., Шемеровская Т.Г., Лапин С.В., Тотолян A.A. Клинико-диагностическое значение выявления антинуклеарного фактора, антител к двуспираль-ной ДНК и кардиолипину у больных системной красной волчанкой // Клиническая лабораторная диагностика, 2008. № 5. C. 44-47. [Sozina A.V., Ilivanova E.P., Shulman A.M., Shulman M.A., Shemerovskaya T.G., Lapin S.V., Totolian A.A. Clinical and diagnostic significance of detection of the antinuclear factor, antibodies to double-stranded DNA and cardiolipin in patients with systemic lupus erythematosus. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics, 2008, no. 5, pp. 44-47. (In Russ.)]
5. Созина A.B., Неустроева ЮА., Тихомирова ТА., Лапин С.В. Сочетанная встречаемость аутоантител у больных с диффузными болезнями соединительной ткани // Медицинская иммунология, 2007. Т. 9, № 1. С. 69-76. [Sozina A.V., Neustroeva Yu.A., Tikhomirova T.A., Lapin S.V. Combined prevalence of autoantibodies in patients with diffuse connective tissue diseases. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2007, Vol. 9, no. 1, pp. 69-76. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2007-1-69-76.
6. Роггенбук Д., Ширак П., Сак У, Лапин С.В., Мазинг A.B., Тотолян Aрег A. Новые подходы к стандартизации выявления аутоантител в лабораторной диагностике аутоиммунных ревматических заболеваний // Медицинская иммунология, 2014. Т. 16, № 3. С. 221-226. [Roggenbuck D., Schierac P., Sack U., Lapin S.V., Mazing A.V., Totolian A.A. Novel methods for autoantibody detection in laboratory diagnostics of autoimmune
rheumatic diseases. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2014, Vol. 1б, no. 3, pp. 221-22б. (In Russ.)] doi: 10.15789/15б3-0б25-2014-3-221-22б.
7. Ткаченко О.Ю., Лапин С.В, Лазарева Н.М., Шмонин A.A., Соловьева Л.Н., Бондарева Е.А., Сель-ков С.А., Чепанов С.В., Тотолян A.A. Сравнительный анализ иммунологических методов детекции антифосфолипидных антител // Клиническая лабораторная диагностика, 2017. Т. б2, № 1. С. 40-44. [Tkachenko O.Yu., Lapin S.V., Mazing A.V., Lazareva N.M., Shmonin A.A., Solovyova L.N., Bondareva E.A., Selkov S.A., Chepanov S.V., Totolian A.A. The comparative analysis of immunologic techniques of detection of antiphospholipid Antibodies. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics, 2011, Vol. б2, no. 1, pp. 40-44. (In Russ.)]
8. Ambrosino P., Lupoli R., Spadarella G., Tarantino P., di Minno A., Tarantino L., di Minno M.N. Autoimmune liver diseases and antiphospholipid antibodies positivity: A meta-analysis of literature studies. J. Gastrointest. Liver Dis., 2015, Vol. 24, no. 1, pp. 25-34.
9. Dalekos G.N., Zachou K., Liaskos C. The antiphospholipid syndrome and infection. Curr. Rheumatol. Rep., 2001, Vol. 3, no. 4, pp. 211-285.
10. Devreese K.M., Pierangeli S.S., de Laat B., Tripodi A., Atsumi T., Ortel T.L.; Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Phospholipid/Dependent Antibodies. Testing for antiphospholipid antibodies with solid phase assays: guidance from the SSC of the IS TH. J. Thromb. Haemost., 2014, Vol. 12, no. 5, pp. 192-195.
11. Egerer K., Roggenbuck D., Büttner T., Lehmann B., Kohn A., von Landenberg P., Hiemann R., Feist E., Burmester G.R., Dörner T. Single-step autoantibody profiling in antiphospholipid syndrome using a multi-line dot assay. Arthritis Res. Ther., 2011, Vol. 13, no. 4, R118. doi: 10.1186/ar3421.
12. Galli M., Comfurius P., Maassen C., Hemker H.C., de Baets M.H., van Breda-Vriesman P.J., Barbui T., Zwaal R.F., Bevers E.M. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 1990, Vol. 335, no. 8105, pp. 1544-1541.
13. Harris E.N., Gharavi A.E., Boey M.L., Patel B.M., Mackworth-Young C.G., Loizou S., Hughes G.R. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 1983, Vol. 322, no. 83б1, pp. 1211-1214.
14. Jeleniewicz R., Majdan M., Targoñska-St^pniak B., Dryglewska M. Prevalence of antiphospholipid antibodies in rheumatoid arthritis patients and relationship with disease activity. Pol. Arch. Med. Wewnçtrznej, 2012, Vol. 122, no. 10, pp. 480-48б.
15. Krilis S.A., Giannakopoulos B. Laboratory methods to detect antiphospholipid antibodies. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program, 2014, Vol. 2014, no. 1, pp. 321-328.
16. Meroni P., Chighizola C., Rovelli F., Gerosa M. Antiphospholipid syndrome in 2014: more clinical manifestations, novel pathogenic players and emerging biomarkers. Arthritis Res. Ther., 2014, Vol. 1б, no. 2, p. 209.
17. Meroni P.L., Borghi M.O., Raschi E., Tedesco F. Pathogenesis of antiphospholipid syndrome: understanding the antibodies. Nat. Rev. Rheumatol., 2011, Vol. 1, no. б, pp. 330-339.
18. Misasi R., Capozzi A., Longo A., Recalchi S., Lococo E., Alessandri C., Conti F., Valesini G., Sorice M. New antigenic targets and methodological approaches for refining laboratory diagnosis of antiphospholipid syndrome. J. Immunol. Res., 2015, Vol. 2015, 858542. doi:10.1155/2015/858542.
19. Miyakis S., Lockshin M.D., Atsumi T., Branch D.W., Brey R.L., Cervera R., Derksen R.H., de Groot P.G., Koike T., Meroni P.L., Reber G., Shoenfeld Y., Tincani A., Vlachoyiannopoulos P.G., Krilis S.A. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). Thromb. Haemost., 200б, Vol. 4, no. 2, pp. 295-30б.
20. Neville C., Rauch J., Kassis J., Chang E.R., Joseph L., le Comte M., Fortin P.R. Thromboembolic risk in patients with high titre anticardiolipin and multiple antiphospholipid antibodies. Thromb. Haemost., 2003, Vol. 90, no. 1, pp. 108-115.
21. Otomo K., Atsumi T., Amengual O., Fujieda Y., Kato M., Oku K., Horita T., Yasuda S., Koike T. Efficacy of the antiphospholipid score for the diagnosis of antiphospholipid syndrome and its predictive value for thrombotic events. Arthritis Rheum., 2012, Vol. б4, no. 2, pp. 504-512.
22. Pengo V., Biasiolo A., Pegoraro C., Cucchini U., Noventa F., Iliceto S. Antibody profiles for the diagnosis of antiphospholipid syndrome. Thromb. Haemost., 2005, Vol. 93, no. б, pp. 1141-1152.
23. Pengo V., Ruffatti A., Legnani C., Testa S., Fierro T., Marongiu F., de Micheli V., Gresele P., Tonello M., Ghirarduzzi A., Bison E., Denas G., Banzato A., Padayattil Jose S., Iliceto S. Incidence of a first thromboembolic event in asymptomatic carriers of high risk antiphospholipid antibody profile: a multicenter prospective study. Blood, 2011, Vol. 118, no. 11, pp. 4114-4118.
24. Petri M., Orbai A.M., Alarcón G.S., Gordon C., Merrill J.T., Fortin P.R., Bruce I.N., Isenberg D., Wallace D.J., Nived O., Sturfelt G., Ramsey-Goldman R., Bae S.C., Hanly J.G., Sánchez-Guerrero J., Clarke A., Aranow C., Manzi S., Urowitz M., Gladman D., Kalunian K., Costner M., Werth V.P., Zoma A., Bernatsky S., Ruiz-Irastorza G.,
Khamashta M.A., Jacobsen S., Buyon J.P., Maddison P., Dooley M.A., van Vollenhoven R.F., Ginzler E., Stoll T., Peschken C., Jorizzo J.L., Callen J.P., Lim S.S., Fessler B.J., Inanc M., Kamen D.L., Rahman A., Steinsson K., Franks A.G. Jr, Sigler L., Hameed S., Fang H., Pham N., Brey R., Weisman M.H., McGwin G. Jr, Magder L.S. Derivation and validation of the systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum., 2012, Vol. 64, no. 8, pp. 2677-2686.
25. Ruiz-Irastorza G., Crowther M., Branch W., Khamashta M.A. Antiphospholipid syndrome. Lancet, 2010, Vol. 376, no. 9751, pp. 1498-1509.
26. Sciascia S., Sanna G., Murru V., Roccatello D., Khamashta M.A., Bertolaccini M.L. The global antiphospholipid syndrome score in primary APS. Rheumatol. (United Kingdom), 2014, Vol. 54, no. 1, pp. 134-138.
27. Touré A.O., Ly F., Sall A., Diatta A., Gadji M., Seck M., Faye B., Dieye T., Diop S. Antiphospholipid antibodies and systemic scleroderma. Turkish J. Haematol., 2013, Vol. 30, no. 1, pp. 32-36.
28. Zhou Y., Ying Z., Li R., Zhu J., Li Z. Clinical and immunological relevance of antiphospholipid antibodies in patients with lymphoma. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2011, Vol. 91, no. 37, pp. 2607-2610.
Авторы:
Ткаченко О.Ю. — врач клинической лабораторной диагностики, лаборатория диагностики аутоиммунных заболеваний, НМЦ по молекулярной медицине Министерства здравоохранения РФ ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Лапин С.В. — к.м.н., заведующий лабораторией диагностики аутоиммунных заболеваний НМЦ по молекулярной медицине Министерства здравоохранения РФ ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Шмонин А.А. — врач-невролог СПб ГБУЗ «Городская больница № 26»; доцент кафедры физических методов лечения и спортивной медицины ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ; старший научный сотрудник института экспериментальной медицины ФГБУ «Северо-Западноый федеральный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова
Соловьева Л.Н. — врач-невролог СПб ГБУЗ «Городская больница № 26», Санкт-Петербург, Россия
Бондарева Е.А. — аспирант кафедры неврологии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Authors:
Tkachenko O.Yu., Clinical Laboratory Diagnostician, Laboratory for Diagnostics of Autoimmune Diseases, Center for Molecular Medicine, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University, St. Petersburg, Russian Federation
Lapin S.V., PhD (Medicine), Head, Laboratory for Diagnostics of Autoimmune Diseases, Center for Molecular Medicine, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University, St. Petersburg, Russian Federation
Shmonin A.A., Neurologist, City Hospital No. 26 of St. Petersburg; Associate Professor, Department of Physical Methods of Treatment and Sports Medicine, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University; Senior Research Associate, Institute of Experimental Medicine, V. Almazov North-West Federal Medical Research Center, St. Petersburg, Russian Federation
Solovyova L.N., Neurologist, City Hospital No. 26 of St. Petersburg, St. Petersburg, Russian Federation
Bondareva E.A., Postgraduate student, Neurology Department, Center for Molecular Medicine, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University, St. Petersburg, Russian Federation
Сельков С.А. — д.м.н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, руководитель отдела иммунологии и межклеточных взаимодействий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии ирепродуктологии имени Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия
Чепанов С.В. — врач клинической лабораторной диагностики, лаборатория клинической иммунологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия Тотолян Арег А. — д.м.н., профессор, академик РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии, директор ФБУН«Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»; заведующий кафедрой иммунологии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Роггенбук Дирк — д.м.н., профессор, Бранденбургский технический университет, Коттбус-Зенфтенберг, Зенфтенберг; директор, GA Generic Assays GmbH, Далевиц, Германия
Selkov S.A., PhD, MD (Medicine), Professor, Honoured Worker of Science of the Russian Federation, Head, Department of Immunology, D. Ott Research Institute of Obstetrics, Ginecology and Reproductology, St. Petersburg, Russian Federation
Chepanov S.V., Clinical Laboratory Diagnostician, Laboratory of Clinical Immunology, D. Ott Research Institute of Obstetrics, Ginecology and Reproductology, St. Petersburg, Russian Federation
Totolian Areg A., PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Molecular Immunology, Director, St. Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Head, Department of Immunology, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University, St. Petersburg, Russian Federation
Roggenbuck Dirk, PhD, MD (Medicine), Professor, Brandenburg University of Technology, Cottbus-Senftenberg, Senftenberg; director, GA Generic Assays GmbH, Dahlewitz, Germany
Поступила 30.10.2017 Отправлена на доработку 02.11.2017 Принята к печати 17.01.2018
Received 30.10.2017 Revision received 02.11.2017 Accepted 17.01.2018
