CC BY
12Ветеринарный врач. 2023. № 2. С. 41 - 46. The Veterinarian. 2023; (2): 41 - 46
Научная статья УДК 579.62
DOI: 10.33632/1998-698Х 2023 2 41
Дифференциация штаммов Bacillus anthracis методом анализа температур плавления продуктов ПЦР, полученных после амплификации VNTR локусов
Наиль Анисович Фахрутдинов, Елизавета Алексеевна Анисимова, Динис Анатолиевич Миргазов, Эльмира Наримановна Мустафина, Константин Анатольевич Осянин
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Россия
Автор, ответственный за переписку: Елизавета Алексеевна Анисимова, elizaveta-real@mail.ru
Аннотация. В настоящее время генотипирование штаммов Bacillus anthracis широко используется при проведении расследований вспышек сибирской язвы и осуществлении эпидемиологического надзора за данной инфекцией. В рамках данной работы проведено исследование десяти штаммов B. anthracis (семи вирулентных и трех вакцинных) с использованием мультилокусного VNTR-анализа. Для определения различий в исследуемых локусах использовали метод определения температур плавления ПЦР-продуктов в присутствии интеркалирующего красителя «EvaGreen». Данный методический подход позволил дифференцировать между собой восемь из десяти исследуемых штаммов B. anthracis. Также установлен размер повторов в локусах, температура плавления ПЦР-продуктов которых была идентична температурам плавления ампликонов тех же VNTR локусов референсного штамма СГИ-1. Таким образом, показана принципиальная возможность использования рассмотренной в данной работе методики для идентификации и дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы.
Ключевые слова: Bacillus anthracis; дифференциация; VNTR; MLVA; кривые плавления ампликонов
Differentiation of Bacillus anthracis strains by method based on melting points of the PCR products obtained after amplification the VNTR loci
Nail A. Fakhrutdinov, Elizaveta A. Anisimova, Dinis A. Mirgazov, Elvira N. Mustafina, Konstantin A. Osyanin
Federal State Budgetary Scientific Institution «Federal Center for toxicological, radiation, and biological safety», Kazan, Russia.
Corresponding author: Elizaveta A. Anisimova, elizaveta-real@mail.ru
Abstract. Currently, genotyping of strains of Bacillus anthracis is widely used to inverstiqate outbreaks of anthrax and the implementation of epidemiological surveillance of this infection. In this paper, the ten strains of B. anthracis (seven virulent and three vaccine) were studied by multiple-locus VNTR analysis. To determine the difference in the studied loci was used the method for determining the melting points of PCR products in the presence of the intercalating dye «EvaGreen». This methodological approach made it possible to differentiate eight out of ten studied B. anthracis strains. The size of the repeats in the loci was also determined, the melting temperature of the PCR products of which was identical to the melting temperatures of the amplicons of the same VNTR loci of the reference strain CTI-1. Thus, the fundamental possibility of using the technique considered in the present study for the identification and differentiation of strains of the anthrax pathogen has been shown.
Keywords: Bacillus anthracis; differentiation; VNTR; MLVA; amplicon melting curves
Введение. Бактерии Bacillus anthracis являются возбудителем особо опасной зоонозной инфекции - сибирской язвы. Заражение домашнего скота и диких животных данным
заболеванием происходит чаще всего через споры, проглатываемыми ими на пастбищах [2]. Заражение человека может происходить тремя путями: через ссадины или порезы на коже, употребление в пищу мяса, инфицированного животного или через вдыхание спор [7, 10]. Важно отметить, что споры сибирской язвы устойчивы к абиотическим факторам окружающей среды и, как следствие, способны сохраняться в почве в течение нескольких десятилетий [6].
Каждый случай возникновения заболевания человека или животного с подозрением на сибирскую язву требует индикации возбудителя методами молекулярной диагностики. Вид B. anthracis принадлежит к таксономической группе Bacillus cereus sensu lato, в состав которой также входят B. cereus и B. thuringiensis. Вышеперечисленные виды обладают высоким генетическим сродством, поэтому их невозможно дифференцировать между собой с помощью большинства молекулярно-генетических подходов, в части методом ДНК-ДНК-гибридизации, по последовательностям 16S-23S рРНК и межгенным спейсерным областям gyrB-gyrA [10]. Штаммы B. anthracis также характеризуются незначительными генетическими отличиями внутри данного вида, что значительно затрудняет их дифференциацию между собой [4]. Для идентификации B. anthracis широкое применение находит молекулярное типирование, в частности мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов (VNTR) под названием MLVA [5, 8]. Данный метод позволяет обнаружить внутривидовое разнообразие возбудителя сибирской язвы, а также определять географическое происхождение штамма
и источник инфекции. В основе проведения MLVA чаще всего лежит метод ПЦР с последующим разделением продуктов амплификации в агарозном геле электрофорезом [3]. Ограничением данного подхода является тот факт, что не все используемые для MLVA локусы имеют размер повтора более 10 п.о., т.е. являются агарозосовместимыми [5]. Идентификация числа повторов на таких коротких участках возможна только при помощи дорогостоящего оборудования и секвенирования.
В проведенном исследовании рассмотрена возможность применения метода, основанного на анализе температур плавления ампликонов в реальном времени для определения различий в VNTR-локусах. Для дифференциации ампликонов исследуемых VNTR-локусов применили технологию амплификации с использованием интеркалирующего красителя «EvaGreen». Механизм воздействия данного красителя заключается во встраивании между двумя комплементарными нуклеотидами в двухспиральной молекуле ДНК. При возбуждении красителя светом определенной длины волны он флуоресцирует. При денатурации ДНК и разрыве водородных связей флуоресценция отсутствует. Таким образом, при постепенном повышении температуры в амплификаторе и постоянной детекции возможно определение длины исследуемого ампликона по температуре плавления. Данный подход обладает такими преимуществами как быстрота проведения анализа и высокая чувствительность, также его применение не требует дорогостоящего оборудования [3]. Целью проведенного исследования являлась оценка эффективности проведения MLVA методом анализа кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения для дифференциации B. anthracis.
Материалы и методы. В работе использовали десять штаммов возбудителя сибирской язвы: три вакцинных (B. anthracis СТИ-1, B. anthracis 55, B. anthracis «Onderste Pookt») и семь вирулентных штаммов B. anthracis различного географического происхождения, обозначенных в данной статье как Kr, U-1, Km, Ba, Izh, Uf, Vg. Для безопасного выделения ДНК из культур клеток B. anthracis проводили обработку и обеззараживание биологического материала согласно МУК 4.2.2941-11 [1]. Для выделения ДНК использовали набор РНК-преп-М производства ООО «Медипалтех» (Россия). Все манипуляции выполняли в соответствии с инструкцией производителя.
Для проведения MLVA использовали восемь характерных для B. anthracis локусов тандемных повторов (vrrA, vrrBl, vrrB2, vrrC1, vrrC2, CG3, pX01, pX02). Амплификацию VNTR-локусов проводили с использованием праймеров, представленных ранее в работе [11].
ПЦР-смесь для постановки ПЦР-РВ содержала: 1,5 мкл 10*ПЦР-буфера c красителем «EvaGreen» (ЗАО «Синтол», Россия), 25 мМ раствора MgCh (ЗАО «Синтол», Россия), 1,0 единицу Taq-полимеразы (ЗАО «Синтол», Россия), 2,5 мM каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 5 pM прямого и обратного праймера, 10 нг ДНК-матрицы, ddH2O (до 15 мкл). Амплификацию проводили по программе: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 мин, 39 циклов: денатурация 95 °C - 10 с, отжиг олигонуклеотидов: 60 °C - 30 с (детекция по каналу FAM) и элонгацию 72 °C - 10 с. Параметры плавления: диапазон температур от 65 °C до 95 °C, шаг 0,2 °C - 5 с. Графический анализ кривых плавления продуктов амплификации проводили в программе CFX ManangerTM («Bio-Rad», США).
ПЦР-смесь для классической ПЦР объемом 15 мкл содержала 2,5 мкл 10*ПЦР буфера, 1,5 мкл 25 hM MgCh, 5 пкЫ каждого праймера, 2,5 мкл 2,5 hM dNTP, 0,5 мкл Taq-полимеразы, 2,5 мкл ДНК матрицы, 5 мкл ddH2O. Амплификацию проводили по программе: начальная денатурация ДНК при 95
°С в течение 3 мин, далее 45 циклов: денатурация 95 °C - 10 с, отжиг олигонуклеотидов 60 °C - 30 с, элонгация 72 °C - 10 с. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле в ТВЕ-буфере с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией с помощью UV-трансиллюминатора. Размер полученных фрагментов определяли путем сравнения фрагмента с маркером молекулярной массы ДНК — GeneRuler™ 100 bp DNA Ladders («Fermentas», Литва).
Для проведения ПЦР и ПЦР-РВ использовали амплификатор Real-Time С1000 с оптическим блоком CFX96 («Bio-Rad», США).
Биоинформационный анализ проводили с помощью программ Vector NTI 9.1 и баз данных ресурсов NCBI (https://www.ncbi.gov).
Результаты исследований. Для проведения MLVA использовали расширенный протокол, включающий анализ восьми локусов вариабельных тандемных повторов, описанных ранее [9, 11]. В качестве референсного штамма использовали B. anthracis СТИ-1, поскольку его геном полностью секвенирован и представлен в базе данных GenBank. На первом этапе работы определили размер тандемных повторов с помощью in silico анализа хромосомной (GenBank CP066168) и плазмидной ДНК (GenBank CP007661.1) B. anthracis СТИ-1. Локализация праймеров показала, что в геноме штамма B. anthracis СТИ-1 ожидаемый ампликон локуса vrrA размером 314 п.о. содержит четыре повтора по 12 п.о., VrrB1 размером 229 п.о. - два повтора по 9 п.о., VrrB2 размером 162 п.о. - три повтора по 9 п.о., VrrC1 размером 616 п.о. - два повтора по 36 п.о., VrrC2 размером 604 п.о. - два повтора по 72 п.о., CG3 размером 156 п.о. - один повтор по 5 п.о., pX01 размером 126 п.о. - шесть повторов по 3 п.о.
Далее определили пики плавления ПЦР-РВ продуктов амплифицируемых VNTR локусов исследуемых штаммов B. anthracis. ПЦР-РВ проводили с использованием красителя «EvaGreen» в трех повторениях. Обнаружили, что разница между повторами для большинства анализируемых локусов составляет 0,2 °С. Поэтому для дифференцировки штаммов B. anthracis допустимым отличием в показаниях приняли значения от 0,2 °С. Результаты молекулярно-генетического анализа исследуемых штаммов B. anthracis представлены в таблице 1.
Установили, что полученные после амплификации локуса VrrA1 кривые плавления вирулентного штамма Vg и вакцинного B. anthracis 55 идентичны кривой плавления того же локуса B. anthracis СТИ-1 и, вероятно, содержат в локусе VrrA1 четыре тандемных повтора. Четыре вирулентных штамма (U-1, Km, Ba и Uf) демонстрируют более высокую температуру плавления ампликонов в сравнении с B. anthracis СТИ-1, что говорит о большем количестве тандемных повторов в локусе VrrA1. Наибольшую температуру плавления демонстрирует вакцинный штамм B. anthracis «Onderste Pookt» - 85,4 °С. Самой низкой температурой плавления ампликона VrrA1 обладает штамм Kr и, как следствие, характеризуется наименьшим количеством повторов в локусе VrrA1.
Вирулентные штаммы (Izh и Vg) и вакцинные (55 и «Onderste Pookt») обладают идентичными с B. anthracis СТИ-1 кривыми плавления ампликонов VrrB1 и, как следствие, содержат в локусе VrrB1 два тандемных повтора. Из данных, представленных в таблице 1, следует, что штаммы (Km, U-1, Km и Ba) содержат в данном локусе наименьшее количество повторов, а Uf наибольшее.
Девять из десяти исследованных штаммов, в том числе и референсный B. anthracis СТИ-1, характеризуются одинаковыми температурами плавления ампликона VrrB2, следовательно, содержат три тандемных повтора в данном локусе. Штамм Kr обладают наименьшей температурой плавления ампликона VrrB2 и, как следствие, содержат в данном локусе два или один тандемный повтор.
Полученные данные о кривых плавления апликонов CG3 свидетельствуют о том, что все штаммы, кроме Izh и Uf, содержат в локусе CG3 один тандемный повтор, характерный для B. anthracis СТИ-1. Тандемные повторы в данном локусе у штаммов Izh и Vg, вероятно, отсутствуют.
Температуры плавления ПЦР-продуктов, полученные после амплификации локусов VrrC1 и VrrC2, позволили разделить все исследуемые штаммы на два кластера. Вирулентные штаммы Izh, Uf и Vg, а также вакцинные 55 и «Onderste Pookt» характеризуются идентичными с референсным штаммом температурами плавления данных локусов. Температура плавления ПЦР-продуктов, полученная после амплификации локуса VrrC1, у штаммов Kr, U-1, Km и Ba превышала значение, полученное для B. anthracis СТИ-1. Из чего можно сделать заключение, что исследованные штаммы несут в локусе VrrC1 три или более тандемных повтора. Данные штаммы обладают более низкой температурой плавления ампликонаVrrC2 в сравнении с СТИ-1 и, вероятно, несут в данном локусе один повтор.
Детектировали, что штаммы Kr, «Onderste Pookt» и СТИ-1 обладают наименьшей температурой плавления ампликона рХО1 - 74,2 °С. Заключили, что данные бактерии содержат на плазмиде рХО1 шесть тандемных повторов. Остальные исследованные штаммы B. anthracis, вероятно, содержат в локусе pXO1 более шести повторов. Количество повторов в локусе pXO2 для исследованных штаммов B. anthracis установить невозможно ввиду отсутствия данного маркера у бактерий B. anthracis СТИ-1.
Отметим, что отсутствие плазмиды pXO2 у B. anthracis СТИ-1, 55 и «Onderste Роок» является их характерным признаком [4].
Как видно из представленных в таблице 1 данных, большинство исследованных штаммов возбудителя сибирской язвы характеризуются уникальным профилем температур ПЦР-продуктов, полученных после амплификации VNTR-локусов. Исключением являются штаммы ^1 и Km, демонстрирующие одинаковые профили и, вероятно, относящиеся к одному генотипу. Таким образом, методический подход, основанный на анализе температур плавления VNTR-локусов, позволил дифференцировать между собой восемь из десяти исследуемых штаммов.
Отметим, что используемый в рамках данной работы MLVA подход, основанный на разделении VNTR-ампликонов электрофорезом, позволил определить только примерные размеры VNTR локусов исследуемых штаммов (таблица 1) и, как следствие, может использоваться только в качестве оценочного.
Заключение. Полученные результаты имеют потенциал использования для разработки методического подхода для быстрой дифференциации штаммов B. anthracis, основанного на мониторинге в реальном времени процесса плавления амплифицированных VNTR-локусов. Поскольку размер повторов установлен только в тех локусах, температура плавления ПЦР-продуктов которых была идентична температурам плавления ампликонов тех же VNTR локусов штамма СТИ-1, в дальнейшем необходимо провести секвенирование исследованных в данной работе локусов для создания базы данных температур плавления VNTR-последовательностей, соотносящиеся с их размером. В перспективе метод идентификации и дифференциации штаммов B. anthracis, основанный на кривых плавления VNTR-ампликонов, будет иметь преимущества перед другими методами благодаря меньшим материальным и временным затратам и, таким образом, может быть полезным в работе диагностических лабораторий.
□
ЬЭ О
о сз о о-
гг £5
^ г-К
О
£
н
й
Н
й. о\ Й 8 С Р
Ч
о 8 о н 8 Л о о я 8 о
О
►е-8 Й 8
8 о о
й о й VI о
К &
X
Б н
й
о
(Я
(М
а
а ^
о
а о
й
о 8 8 Е со
8 О
о и> VI Й № н
й
Г
>
8 К о Л
ё
8
0
1
а
о
и 8
8 Е
8 ►в-Н О
(Я
Е
й о Й о 8 Е
СО 8
ё о 8
оо
температура плавления ампликона,
%
ю о
размер ампликона, п.о.
00
температура плавления ампликона,
а
ю о
размер ампликона, п.о.
00
температура плавления ампликона,
о
размер ампликона, п.о.
Ч ю
ю
00 ю
температура плавления ампликона,
Ч О
размер ампликона, п.о.
00
температура плавления ампликона
о
размер ампликона, п.о.
К)
температура плавления ампликона,
К)
температура плавления
амппитня_
¡=1 О - Я
о
<
Ч О ю
О О
размер ампликона, п.о.
О
ю
размер ампликона, п.о.
температура плавления ампликона.
размер ампликона, п.о.
X О
ю ■
й
Литература
1. МУК 4.2.2941-11 Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней : методические указания : введены впервые : дата введения 2011-07-14 / разработан Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора. - Москва : Роспотребнадзор, 2011. - 55 с.
2. Особенности природной очаговости сибирской язвы и экологии Bacillus anthracis / А. П. Родионов, Е. А. Артемьева, Л. А. Мельникова [и др.] // Ветеринария сегодня. - 2021. - Г. 2, № 37. - С. 151-158.
3. Современные подходы к генотипированию возбудителей особо опасных инфекций / О. С. Бондарева, С. С. Савченко, Г. А. Гкаченко [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2014. - T. 1. - С. 34-44.
4. Сравнительный мультилокусный VNTR- и SNP-анализ вакцинных штаммов Bacillus anthracis / М. В. Афанасьев, Е. В. Кравец, З. Ф. Дугаржапова [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2014. - T. 29, № 2. - С. 86-92.
5. Тимофеев, В. С. Генотипирование Bacillus anthracis и близкородственных микроорганизмов / В. С. Тимофеев, И. В. Бахтеева, И. А. Дятлов // Генетика. - 2018. - Г. 54, № 1. - С. 3-14.
6. Эпизоотическая характеристика стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов в Республике Гатарстан / А. П. Родионов, Е. А. Артемьева, Л. А. Мельникова, М. А. Косарев // Ветеринарный врач. - 2021. - № 1. - С. 50-56.
7. Genetic characterization of Bacillus anthracis strains circulating in Italy from 1972 to 2018 / V. Rondinone, L. Serrecchia, A.Parisi [et al.] // PLoS ONE. - 2020. - Vol. 15, No 1. - P. e0227875.
8. Genotyping and population diversity of Bacillus anthracis in China based on MLVA and canSNP analysis / D. Wang , B. Wang, L. Zhu [et al.] // Genotyping and population diversity of Bacillus anthracis in China based on MLVA and canSNP analysis. Microbiological Research. - 2020. - Vol. 233, No 1. - P. 126414.
9. Indication and Identification of Bacillus anthracis Isolates from the Middle Volga Region by Multi-Primer PCR / N. M. Aleksandrova, I. A. Rogozhina, T. K. Faizov [et al.] // BioNanoScience. - 2018. - Vol. 8, No 1. - P. 434-440.
10. Molecular Characterization of Korean Bacillus anthracis Isolates by Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis and Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Analysis / C. Ryu, K. Lee, H. Hawng [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 2005. - Vol. 71. - P. 4664-4671.
11. Multiplelocus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis / P. Keim, L. B Price, A. M. Klevytska [et al.] // J Bacteriol. - 2000. - Vol. 182. - P. 2928-2936.
References
1. MUK 4.2.2941-11 The procedure for organizing and conducting laboratory diagnostics of anthrax for laboratories of the territorial, regional and federal levels : guidelines: introduced for the first time : date of introduction 2011-07-14 / developed by the Federal Public Health Institution «Stavropol Research Anti-Plague Institute» Rospotrebnadzor. - Moscow : Rospotrebnadzor, 2011. - 55 p.
2. Features of anthrax natural foci and Bacillus anthracis ecology / A. P. Rodionov, E. A. Artemeva, L. A. Melnikova [et al.] // Veterinary Science Today. - 2021. - Vol. 2, No 37. - P. 151-158.
3. Modern approaches to genotyping of causative agents of particularly dangerous infections / O. S. Bondareva, S. S. Savchenko, G. A. Tkachenko [et al.] // Epidemiology and infectious diseases. - 2014. - Vol. 1. -P. 34-44.
4. Comparative multilocus vntr and snp analysis of Bacillus anthracis vaccine strains / M. V. Afanasiev, E. V. Kravets, Z. F. Dugarzhapova [et al.] // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. - 2014. - Vol. 29, No 2. - P. 86-92.
5. Timofeev, V. S. Genotyping of Bacillus anthracis and closely related microorganisms. Russian Journal of Genetics / V. S. Timofeev, I. V. Bakhteeva, I. A. Dyatlov // Russian Journal of Genetics. - 2018. - Vol. 54, No 1. - P. 3-14.
6. Epizootic characteristics of stationary anthrax unfavorable points in the Republic of Tatarstan / A.P. Rodionov, Е.А. Artemieva, L.A. Melnikova, M.A. Kosarev // Veterinarian. - 2021. - No 1. - Р. 50-56.
7. Genetic characterization of Bacillus anthracis strains circulating in Italy from 1972 to 2018 / V. Rondinone, L. Serrecchia, A.Parisi [et al.] // PLoS ONE. - 2020. - Vol. 15, No 1. - P. e0227875.
8. Genotyping and population diversity of Bacillus anthracis in China based on MLVA and canSNP analysis / D. Wang , B. Wang, L. Zhu [et al.] // Microbiological Research. - 2020. - Vol. 233, No 1. - P. 126414.
9. Indication and Identification of Bacillus anthracis Isolates from the Middle Volga Region by Multi-Primer PCR / N. M. Aleksandrova, I. A. Rogozhina, T. K. Faizov [et al.] // BioNanoScience. - 2018. - Vol. 8, No 1. - P. 434-440.
10. Molecular Characterization of Korean Bacillus anthracis Isolates by Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis and Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Analysis / C. Ryu, K. Lee, H. Hawng [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 2005. - Vol. 71. - P. 4664-4671.
11. Multiplelocus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis / P. Keim, L. B Price, A. M. Klevytska [et al.] // J Bacteriol. - 2000. - Vol. 182. - P. 2928-2936.
© Фахрутдинов Н. А., Анисимова Е. А., Миргазов Д. А., Мустафина Э. Н., Осянин К. А. 2023
