CC BY
0УДК 636.4.033:575.174.015.3
В. Н. Кипень, Е. В. Снытков, М. Е. Михайлова, Р. И. Шейко
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОРОД СВИНЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ KASP — ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПОРОДЫ ДЮРОК
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: v.kipen@igc.by
На биологическом материале (ушные выщипы свиней пород белорусская крупная белая, белорусская мясная, дюрок, ландрас, йоркшир) установлен высокий дифференцирующий потенциал полиморфных вариантов rs80967182, rs81333725 (RXFP1) и rs80859281 (ASAH2) для дифференциации свиней породы дюрок. Предложена тест-модель из трех однонуклеотидных полиморфизмов для идентификации свиней породы дюрок, которая отличается высокими значениями точности (98,4%), специфичности и чувствительности. С использованием KASP разработан быстрый и простой подход к дифференциации на основании предложенной тест-модели, который призван сократить временные и финансовые затраты на молекулярно-генетический анализ, а также снизить риск кросс-контаминации, т. к. процесс является одностадийным (исключены этапы рестрикции и электрофореза).
Ключевые слова: Sus scrofa domesticus, однонуклеотидный полиморфизм, дифференциация, конкурентная аллель-специфическая ПЦР (KASP, Kompetitive allele specific PCR), генотипирование in silico.
Введение
В свиноводстве и птицеводстве производственными животными обычно являются трех-или четырехпородные помеси. Скрещивание приводит к получению экономических выгод, в основе которых находятся гетерозис и ком-плементарность пород. Для улучшения продуктивности животных в каждой из чистопородных родительских линий проводится селекция. До эры геномики этот отбор часто основывался на чистопородных характеристиках, поскольку проследить родословную гибридных производственных животных до их чистопородных предков оказывалось проблематично или невозможно [1]. В данный момент подтверждение чистопородности с использованием молекулярно-генетических методов возможно на любой стадии селекционного процесса. Определение чистопород-ности сельскохозяйственных животных играет ключевую роль в селекционном процессе, в частности для свиноводства и для животноводства в целом.
Развитие методологически-материальной базы молекулярно-генетических методов и снижение финансовых и временных затрат
подобных исследований обусловили полный переход породных ассоциаций ряда стран (США, Канада, Германия и др.) на использование ДНК-анализа, что значительно увеличивает точность селекционного процесса. Кроме того, созданные параллельно ДНК-банки являются основой проведения генетического мониторинга пород и популяций, а также исследований по идентификации и внедрению технологий маркерной селекции [2].
Определение чистопородности сельскохозяйственных животных в селекционном процессе имеет ключевое значение для всей отрасли животноводства. По причине того, что количественные признаки в подавляющем большинстве случаев наследуются полигенно, т. е. предетерминированы совокупностью генов и их функциональным состоянием, определение значимых корреляций между SNP (Single nucleotide polymorphisms) и фенотипическим признаком на высоком уровне статистической значимости осуществимо только при полногеномных поисках ассоциаций — GWAS (Genome-Wide Association Studies).
Выявленные генетические ассоциации на уровне генома необходимо в обязательном по-
рядке проверять и подтверждать в дальнейших субпопуляционных исследованиях. В первую очередь результаты GWAS способствуют тому, чтобы обозначить исследователю область поиска в геноме для выявления локусов (генов), ответственных за наследование того или иного признака. В этой связи приоритетной задачей для исследователей биоинформатиче-ского профиля становится определение SNP, расположенных вблизи генетических маркеров, дифференцирующий потенциал которых был определен ранее.
Для Республики Беларусь свиноводство является традиционной отраслью сельского хозяйства, а в перечень разводимых пород входят такие, как белорусская крупная белая, белорусская черно-пестрая, эстонская беконная, ландрас, дюрок и др. Доминирующей породой в этом перечне является белорусская крупная белая, однако и остальные породы составляют значительную часть генофонда свиней Республики Беларусь.
Определение чистопородности свиней может быть проведено с использованием SNP или STR (Short tandem repeat) маркеров. Одними из главных преимуществ использования STR-локусов является возможность их мультиплексирования (10-15 локусов в одной пробирке), а также относительно низкая стоимость анализа при массовом генотипиро-вании. Также для характеристики определенного фенотипического признака необходимо, чтобы ген, ответственный за этот признак, находился в одной группе сцепления с STR-ло-кусом. Как правило, STR-локусы в данном контексте менее информативны, чем SNP. Технология мультиплексирования SNP сегодня достигла уровня, который позволяет за один запуск прибора (ридер чипов или секвенатор для массового параллельного секвенирования) охарактеризовать десятки и сотни тысяч SNP одновременно для сотен животных. Так, компанией Illumina© разработан чип для полногеномного анализа SNP для животных вида Sus scrofa — PorcineSNP60 BeadChip [3], включающий в себя более 60 тыс. полиморфных вариантов.
Ramos A. M. с соавторами применяли данную технологию для оценки дифференцирующего потенциала ряда SNP для определения чистопородности свиней пород дюрок, ланд-
рас, крупная белая и пьетрен [4]. За последние 10 лет в научных журналах было опубликовано более 50 работ, которые посвящены поиску видо- и породоспецифичных SNP для вида S. scrofa. В основном исследователи прибегали к использованию чиповых технологий производства Illumina©. Также SNP были исследованы в ряде работ для оценки QTL или чисто-породности для пород свиней крупная белая [2, 4-12], ландрас [4, 6, 11-14], дюрок [4, 1113, 15], пьетрен [4, 11-13, 16]. Оценка генетического разнообразия пород свиней в контексте решения ряда задач по криминалистике обсуждалась в исследованиях Roberts K. S. с соавторами [17], Stratz P. с соавторами [16], Wilkinson S. с соавторами [11], Кипень В. Н. с соавторами [18] и др.
Как правило, исследователи, применявшие PorcineSNP60 BeadChip, либо не приводят информацию о дифференцирующем потенциале конкретного SNP в контексте различения пород свиней, либо предпочитают кодировать их спектр. Однако в настоящее время имеется довольно много информации, находящейся в открытом доступе в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI, National Center for Biotechnology Information), относительно полногеномных сиквенсных проектов для вида S. scrofa. По состоянию на 2023 г. в открытом доступе зарегистрирована информация о более чем 300 полностью секвениро-ванных геномах свиней пород дюрок, ландрас, крупная белая, пьетрен и др., характеризующихся достаточной глубиной прочтения для определения генотипа in silico с использованием методов биоинформатики.
Свиньи породы дюрок были впервые выведены в Северной Америке в 1860-х гг. и распространились по всему миру как одна из самых известных тощих пород свиней [19]. Свиньи данной породы характеризуются быстрым темпом роста, высокой устойчивостью к неблагоприятным воздействиям и хорошими характеристиками туши. Дюрок является одной из самых популярных коммерческих пород во всем мире. Интенсивный искусственный отбор в породе привел к значительным генетическим улучшениям по множеству представляющих экономический интерес признаков. Свиньи дюрок стали основой для многих коммерческих тощих хряков смешанных
пород благодаря их превосходным характеристикам с точки зрения роста, эффективности усвояемости корма, телосложения, туши и качества мяса [20]. Например, коммерческие свиньи породы Дюрок х (Ландрас * Йоркшир) доминируют на рынке свинины в Китайской Народной Республике. В Республике Беларусь дюрок используется в селекционных схемах и является высоко значимой породой для улучшения характеристик гибридных линий, поэтому отбор для селекционных мероприятий «чистых» особей, без примеси других пород, является актуальной задачей, которую возможно решить с использованием комбинированного подхода, используя методологию биоинформатики и молекулярной биологии.
Исходя из вышеизложенного, цель данной работы — выявить и исследовать SNP с высоким дифференцирующим потенциалом для различения свиней породы дюрок с другими породами, представленными в Беларуси. Для достижения поставленной цели был решен ряд задач: с использованием методов биоинформатики проведено генотипирование in silico для коммерческих пород свиней, геномы которых представлены в NCBI; с использованием методов статистики отобраны наиболее информативные SNP; с использованием технологии KASP определен генотип для отобранных SNP и предложена тест-модель для дифференциации.
Материалы и методы
Биологические образцы
В исследование было включено 328 образцов биологического материала (ушной выщип) вида S. scrofa domesticus следующих пород: дюрок (ДЮ, 46 обр.), ландрас (ЛА, 110 обр.), йоркшир (ЙО, 77 обр.), белорусская крупная белая (БКБ, 49 обр.) и белорусская мясная (БМ, 46 обр.). Образцы животных были отобраны сотрудниками селекционно-гибридных центров «Заднепровский», «Полесье-Агро» и «ЖодиноАгроПлемЭлита».
Выделение ДНК
ДНК из образцов ушных выщипов выделяли с использованием набора ДНК-сорб-Б (Прайм-тех, Беларусь) в соответствии с рекомендациями производителя. KASP
Определение генотипа по SNP осущест-
вляли с использованием технологии, основанной на конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP, Kompetitive allele specific PCR). Генотипирование проводили с использованием KASP Assay mix (KASP by Design, KBD) и KASP Master mix (LGC Biosearch Technologies, Великобритания; ООО «Максим Медикал», Россия) в двукратной повторности. ПЦР проводили в объеме 10 мкл в термоцикли-ре Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, США) согласно имеющимся рекомендациям.
Определение генотипа in silico
Генотипы in silico для животных, геномы которых были представлены в открытом доступе в NCBI, которые дополнительно конвертировали в формат *.fasta c помощью пакета SRA-Toolkit v.2.11, определяли с использованием оригинального программного обеспечения GenIS, написанного на языке Pythonv3.10 [24].
В биоинформатическом анализе были задействованы 248 особей вида S. scrofa domesticus (дюрок — 85, ландрас — 46, крупная белая — 70, пьетрен — 28, йоркшир — 19), «сырые» данные полных геномов которых расположены в базе Sequence Read Archive (SRA, [25]): PRJEB1683 (2013, Wageningen University & Research, Нидерланды), PRJNA260763 (2014, Seoul National University и NICEM — Южная Корея, BGI — КНР), PRJNA255085 (2014, Centre For Research in Agrigenomics, Испания), PRJEB9922 (2015, Wageningen University & Research, Нидерланды), PRJNA309108 (2016, Novogene, США), PRJNA322309 (2016, China Agricultural Universtiy, КНР), PRJNA358108 (2016, China Agricultural University, КНР), PRJNA343658 (2016, USDA-ARS-USMARC, США), PRJNA378496 (2017, China Agricultural University, КНР), PRJNA393920 (2017, INRA, Франция), PRJNA487172 (2018, Huazhong Agricultural University, КНР), PRJNA506339 (2018, University of Edinburgh, Шотландия), PRJNA507853 (2018, Sichuan Agricultural University, Китай), PRJNA485589 (2018, Agricultural Genome Institute at Shenzhen, КНР), PRJNA488960 (2018, Huazhong Agriculture University, КНР), PRJEB30282 (2019, Queen Mary University of London, Великобритания), PRJNA520978 (2019, Centre for Research in Agricultural Genomics, Испания), PRJNA550237 (2019, Jiangxi Agricultural University, КНР),
PRJNA553106 (2019, Georg-August-University Goettingen, Германия), PRJNA622908 (2020, ETH Zurich, Германия), PRJNA626370 (2020, Centre for Research in Agricultural Genomics, Испания), PRJNA671763 (2020, Chinese Academy of Agricultural Sciences, КНР), PRJNA712489 (2021, China Agricultural University, КНР).
Статистический анализ данных
Дифференцирующий потенциал SNP определяли с использованием ROC-анализа в SPSS v.20.0. При наличии нижней границы асимптотического 95% доверительного интервала более 0,8 для параметра AUC (площадь под кривой) полиморфизм позиционировался как генетический маркер с высоким дифференцирующим потенциалом. Вероятность отнесения образца к одной из групп рассчитывали с использованием логистической регрессии.
Комплексную оценку дифференцирующего потенциала для совокупности SNP проводили с использованием программы MDR v. 3.0.2 [21]. Вклад конкретного генотипа определялся величиной энтропии Н (выраженной в процентах). При H = 100% генотип способен однозначно дифференцировать, к какой группе (породе) относится образец. В программе MDR в результате множественных перестановок (пермутаций) первичных данных определяется наиболее оптимальная модель дифференциации.
В процессе моделирования были использованы высоко консервативные настройки поиска конфигурации модели, которые позволили однозначно дифференцировать наличие/отсутствие статистически значимых эффектов, а именно: количество атрибутов (attribute count range) — от 1 до n (где n — количество переменных в модели); воспроизводимость модели (cross-validation count) — 100; анализ топ-моделей (track top models) — 1 000; поиск конфигурации модели (search method configuration) — всесторонний (exhaustive); метод сравнения (ambiguous cell analysis) — точный тест Фишера (Fisher's exact test); классификация ячеек (ambiguous cell assignment) — неклассифицированные (unclassified). Корректность модели оценивали по значению сбалансированной точности (Balanced Accuracy), которая зависит от чувствительности и специфичности модели.
Результаты и обсуждения
На биоинформатическом этапе был сфор-
мирован максимально широкий перечень потенциально информативных SNP, в который вошли как ранее описанные SNP [22], так и фланкирующие их SNP из Axiom® Porcine Genotyping Array (Axiom_PigHDv1) от Affymetrix©, а также SNP, для которых по состоянию на 2021 г. имелась доказанная ассоциация с QTL (Quantitative Trait Locus) и была представлена информация в Pig Quantitative Trait Locus Database (Pig QTLdb [26]). Определение генотипа in silico c помощью программы GenlS было осуществлено по 7 451 SNP для 248 животных вида S. scrofa domesticus [23].
Полученные результаты легли в основу математического анализа классификаций с применением ROC-кривых (receiver operating characteristic), также известных как кривые ошибок. Количественную интерпретацию ROC дает показатель AUC (area under ROC curve) — площадь, ограниченная ROC-кривой и осью доли ложных положительных классификаций. Чем выше показатель AUC, тем качественнее осуществляется классификация, при этом значение 0,5 демонстрирует непригодность выбранного метода классификации.
Для свиней породы дюрок нами выявлены 39 SNP с высоким дифференцирующим потенциалом, для которых значение асимптотической значимости для AUC оказалось <1 х 10-10. Значение AUC составило 0,7320,831. При этом частота породоспецифичного аллеля для данных SNP находилась в диапазоне 68,3-96,4%.
Мы считаем, что для создания модели определения чистопородности свиней с использованием молекулярно-генетического анализа должно быть включено небольшое количество генетических маркеров, оптимальное количество SNP для решения данной задачи — не более 5. Поэтому для достижения данной цели необходимо было с использованием статистических методов редуцировать общее количество выявленных нами SNP до логически и экономически приемлемого количества, оставив в модели наиболее значимые комбинации SNP c наивысшим дифференцирующим потенциалом. Также для создания универсальной системы дифференциации наиболее корректным будет решение включить в тест-систему SNP, расположенные на разных хромосомах, чтобы избежать сложностей, со-
пряженных с совместным наследованием генетических маркеров.
Построение модели взаимодействий SNP для определения минимального и достаточного количества генетических маркеров для решения поставленной цели проводилось с использованием биоинформатического метода многомерного сокращения размерности (MDR ^3.0.2) на массиве генотипов, полученных в процессе биоинформатического анализа данных SRA. В результате проведенного анализа была определена модель, включающая ЗОТ ге80859281 (Щ-.14:99099156С > Т, Sscrofa11.1 (GCF_000003025.6), ген ASAH2); «80967182 (С^.7:106301845А > G); rs81333725 (Chr.8:47482649G > Т, ген RXFPl) и ^81458130 (Chr.16:32192496C > Т, ген ITGA1). Данная модель характеризовалась высокими значениями точности (96,3%), специфичности (94,1%) и чувствительности (98,5%).
Впоследствии для данных SNP с использованием технологии КАЗР определены генотипы для 328 образцов биологического материала (ушной выщип) свиней пяти пород. Результаты молекулярно-генетического анализа представлены в таблице 1.
Наибольший дифференцирующий потенциал был определен для ^80967182 (АиС = 0,972; 95%ДИ = [0,955-0,989];
p = 9,08E-25); rs80859281 (AUC = 0,934; 95%ДИ = [0,876-0,991]; p = 4,02E-21); rs81333725 (AUC = 0,928; 95%ДИ = [0,9000,956]; p = 1,28E-20); rs81458130 (AUC = 0,858; 95%ДИ = [0,786-0,930]; p = 2,28E-08).
Частота распространенности аллеля A для rs80967182 в выборке ДЮ составила 91,3%; для остальных пород она варьировала в диапазоне 2,6-21,7%. Частота распространенности аллеля T для rs80859281 в выборке ДЮ составила 60,7%; в выборке ЙО — 0,6%, для остальных пород аллель Т отсутствовал. Для rs81333725 и rs81458130 разница между частотой распространенности аллелей была менее выраженной.
Графическая интерпретация модели представлена на рисунке 1. Согласно полученным результатам, сбалансированная точность дифференциации (adj. Balanced accuracy) свиней породы дюрок и других пород (лан-драс, йоркшир, белорусская крупная белая и белорусская мясная) при анализе 328 образцов по трем SNP — rs80859281, rs80967182 и rs81333725 — составила 98,37% (специфичность модели — 100%, чувствительность — 100%). В среднем в 6,4% случаев особь не удалось отнести ни к одному кластеру с заявленным в MDR-уровнем точности в 99,0%.
Таблица 1
Результаты генотипирования для особей пяти пород свиней по исследуемым
SNP Генотип Порода свиней
ДЮ (n = 46) ЛА (n = 110) ЙО (n = 77) БКБ (n = 49) БМ (n = 46)
rs80859281 CC 6 (13,0%) 110 (100%) 76 (98,7%) 49 (100%) 46 (100%)
CT 24 (52,2%) - 1 (1,3%) - -
TT 16 (34,8%) - - - -
rs80967182 AA 38 (82,6%) - - 3 (6,1%) 3 (6,5%)
AG 8 (17,4%) 24 (21,8%) 4 (5,2%) 7 (14,3%) 14 (30,4%)
GG - 86 (78,2%) 73 (94,8%) 39 (79,6%) 29 (63,0%)
rs81333725 GG 45 (97,8%) 10 (9,1%) 2 (2,6%) 10 (20,4%) 16 (34,8%)
GT 1 (2,2%) 27 (24,5%) 12 (15,6%) 22 (44,9%) 21 (45,7%)
TT - 73 (66,4%) 63 (81,8%) 17 (34,7%) 9 (19,6%)
rs81458130 CC 28 (60,9%) 52 (47,3%) 7 (9,1%) 5 (10,2%) 3 (6,5%)
CT 18 (39,1%) 53 (48,2%) 27 (35,1%) 21 (42,9%) 25 (54,3%)
TT - 5 (4,5%) 43 (55,8%) 23 (46,9%) 18 (39,1%)
Примечание. в пустых ячейках генотип не выявлен
сс
^80967182
АА Ав вв
т
В тс
35,0
4,0 2,0 2,0
63,0
4,0 15,0 ■
128,0 ■
32,0
1.0 ■
Г380859281
ст
^80967182
АЭ
ТТ
ге80967182
АА Ав вБ
20,0 4,0
1,0
14,0 1,0
1,0
Рис. 1. Графическое представление модели из трех полиморфизмов для дифференциации дюрока от других пород свиней, адаптировано из ПО MDR ^3.0.2 (в каждой ячейке цифра слева — абсолютное количество свиней породы дюрок, цифра справа — абсолютное количество особей свиней других пород)
Вклад каждого полиморфизма в дифференциацию свиней породы дюрок и других пород характеризуются величиной энтропии Н (выраженной в процентах). Максимальное значение H было выявлено для ^80859281 (43,82%), ге80967182 (40,61%) и ^81333729 (30,93%). Аддитивный эффект для трех полиморфизмов составил 52,18%.
В то же время, при оценке точности отнесения образца к одной из двух групп: дюрок («Дюрок») или другие породы («Другие породы»), с использованием логистической регрессии, получены следующие данные: при наличии генотипа СС (ге80859281) / GG (ге80967182) / ГГ (^81333725) вероятность отнесения образца к группе «Другие породы» составляет 100% (распространенность особей с данным генотипом в группе — 45,4%); при наличии генотипа СС (^80859281) / GG (ге80967182) / Ш (ге81333725) — 100% (распространенность — 22,3%); при наличии генотипа СС (^80859281) / AG (ге80967182) / ГГ (ге81333725) — 100% (распространенность — 11,3%); при наличии генотипа СС (^80859281) / AG (^80967182) / Ш (^81333725) — 100% (распространенность — 5,3%); при наличии генотипа СС (^80859281) / GG (^80967182) / GG (ге81333725) — 98,6% (распространенность особей с данным генотипом в группе — 12,4%); при наличии генотипа СГ (ге80859281) / АА (ге80967182) / GG (ге81333725) вероятность отнесения образца к группе «Дюрок» состав-
ляет 100% (распространенность — 43,5%); при наличии генотипа ГГ (ге80859281) / АА (ге80967182) / GG (ге81333725) вероятность отнесения образца к группе «Дюрок» составляет 100% (распространенность — 30,4%).
Особого внимания заслуживают четыре особи с генетическим профилем СС (ге80859281) / AG (ге80967182) / GG (ге81333725), две из которых относятся к породе белорусская мясная. Дифференцировать этих свиней и дюрока с использованием трех полиморфизмов оказалось невозможно. Предположительно, данные особи являются отдаленными гибридами с генетическими корнями от дюрока. Возможно, в дальнейшем анализ этих образцов с использованием STR-локусов подтвердит данное предположение.
Необходимо отметить, что сбалансированная точность дифференциации свиней породы дюрок составила более 95%, данного показателя вполне достаточно для решения большинства задач биологической направленности, например, в контексте популяционных исследований или селекционной направленности. В то же время в 6,4% случаев (согласно модели, рис. 1) образцы не представляется дифференцировать с уровнем значимости р <0,01. Если уменьшить порог точности до р <0,05, то количество дифференцированных особей уменьшится до 2,4%. В этом случае точность модели составит 99,2% при специфичности в 99,6% и чувствительности в 100%.
В перспективе, для дальнейшего увеличе-
ния точности модели (например, при импорте свиней для селекции), может быть применено как увеличение выборки исследуемых пород за счет включения новых образцов с заведомо известной породной принадлежностью, по результатам генетического исследования (например, анализ STR-локусов), так и добавление в предложенную нами модель новых SNP с высоким дифференцирующим потенциалом
Заключение
В рамках проведенного исследования предложена тест-система по дифференциации свиней породы дюрок от других пород (ландрас, крупная белая, пьетрен, йоркшир, в том числе белорусская крупная белая, белорусская мясная). Так, с использованием методов биоинформатики определены 39 SNP c высоким дифференцирующим потенциалом, а также на практическом материале подтвержден высокий дифференцирующий потенциал выявленных полиморфных вариантов. На основании результатов молекулярно-генетического анализа 328 образцов предложена тест-модель из трех SNP: rs80859281 (Chr.14:99099156C > T, Sscrofa11.1 (GCF_000003025.6), ген ASAH2); rs80967182 (Chr.7:106301845A > G); rs81333725 (Chr.8:47482649G > T, ген RXFP1), сбалансированная точность которой при уровне значимости p <0,01 составляет не менее 98,4%; при p <0,05 — не менее 99,2%.
Предложенная нами схема для дифференциации выгодно отличается своей универсальностью (с позиций методологического подхода возможно использовать различную приборную базу для ПЦР в реальном времени или ридеры флуоресцентного сигнала), а также высокой точностью и специфичностью. Молекуляр-но-генетический анализ с использованием KASP призван сократить временные и финансовые затраты на ДНК-тестирование, а также снизить риск кросс-контаминации, т. к. процесс является одностадийным (исключены этапы рестрикции и электрофореза).
В целом, расширение базы анализируемых образцов и включение в тест-систему дополнительных SNP для идентификации, в том числе и гибридов, продолжает оставаться актуальной задачей.
Исследование выполнено в рамках ГПНИ
«Биотехнологии-2», подпрограмма «Гено-мика, эпигеномика, биоинформатика» на 2021-2025 гг., задание «Разработка системы генетического анализа для определения чистопородности свиней на основе изучения SNP-локусов» (2021-2023 гг.)
Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Список использованных источников
1. Dekkers, J. C. Marker-assisted selection for commercial crossbred performance / J. C. Dekkers // Journal of animal science. - 2007. - Vol. 85 (9).
- P. 2 104-2 114. - DOI: 10.2527/jas.2006-683
2. A genome-wide association study for a proxy of intermuscular fat level in the Italian Large White breed identifies genomic regions affecting an important quality parameter for dry-cured hams / L. Fontanesi [et al.] // Animal genetics. -2017. - Vol. 48 (4). - P. 459-465. - DOI: 10.1111/ age.12542
3. PorcineSNP60 DNA Analysis Kit v3 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.illumina.com/products/by-type/ microarray-kits/porcine-snp60.html. - Дата доступа: 28.08.2023.
4. Identification of high utility SNPs for population assignment and traceability purposes in the pig using high-throughput sequencing / A. M. Ramos [et al.] // Animal genetics.
- 2011. - Vol. 42 (6). - P. 613-620. - DOI: 10.1111/j.1365-2052.2011.02198.x
5. Genome-wide association study for ham weight loss at first salting in Italian Large White pigs: towards the genetic dissection of a key trait for dry-cured ham production / L. Fontanesi [et al.] // Anim. Genet. - 2017. - Vol. 48 (1). -P. 103-107. - DOI: 10.1111/age.12491
6. Genetic diversity analysis of two commercial breeds of pigs using genomic and pedigree data / R. Zanella [et al.] // Genet. Sel. Evol. - 2016. - Vol. 30. - P. 1-10. - DOI: 10.1186/s12711-016-0203-3
7. Genome-wide study on intramuscular fat in Italian Large White pig breed using the PorcineSNP60 BeadChip / R. Davoli [et al.] // J. Anim. Breed Genet. - 2016. - Vol. 133 (4). - P. 277-282. - DOI: 10.1111/jbg.12189
8. A genome-wide association study in large white and landrace pig populations for number piglets born alive / S. Bergfelder-Druing [et al.] // PLoS One. - 2015. - Vol. 10 (3). - P. 1-19. -DOI: 10.1371/journal.pone.0117468
9. A genomewide association study for average daily gain in Italian Large White pigs / L. Fonta-nesi [et al.] // J. Anim. Sci. - 2014. - Vol. 92 (4).
- P. 1 385-1 394. - DOI: 10.2527/jas.2013-7059
10. A genome-wide association study to detect QTL for commercially important traits in Swiss Large White boars / D. Becker [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8 (2). - P. 1-6. - DOI: 10.1371/journal.pone.0055951
11. Development of a genetic tool for product regulation in the diverse British pig breed market / S. Wilkinson [et al.] // BMC Genomics. - 2012. - Vol. 15. - P. 1-12. - DOI: 10.1186/1471-2164-13-580
12. Using SNP array data to test for host genetic and breed effects on Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viremia / S. Biffani [et al.] // BMC Proc. - 2011. - Vol. 5 (Suppl 4). - P. 1-4.
- DOI: 10.1186/1753-6561-5-S4-S28
13. Estimation of U.S. Yorkshire breed composition using genomic data / Y. Huang [et al.] // J. Anim. Sci. - 2014. - Vol. 92 (4). - P. 1 3951 404. - DOI: 10.2527/jas.2013-6907
14. Uimari, P. Whole-genome SNP association analysis of reproduction traits in the Finnish Landrace pig breed / P. Uimari, A. Sironen, M. L. Sevon-Ai-monen // Genet. Sel. Evol. - 2011. - Vol. 43 (1). -P. 1-8. - DOI: 10.1186/1297-9686-43-42
15. Multi-breed genome-wide association study reveals novel loci associated with the weight of internal organs / Y. He [et al.] // Genet. Sel. Evol. - 2015. - Vol. 47 (87). - P. 1-9. - DOI: 10.1186/s12711-015-0168-7
16. Investigations on the pattern of linkage disequilibrium and selection signatures in the genomes of German Piétrain pigs / P. Stratz [et al.] // J. Anim. Breed Genet. - 2014. - Vol. 131 (6).
- P. 473-482. - DOI: 10.1111/jbg.12107
17. Roberts, K. S. Relationships among and variation within rare breeds of swine / K. S. Roberts, W. R. Lamberson // J. Anim. Sci. - 2015. -Vol. 93 (8). - P. 3 810-3 813. - DOI: 10.2527/ jas.2015-9001
18. Оценка интрогрессии генов свиньи до-
машней (Sus scrofa domesticus) в генофонд дикого кабана (Sus scrofa scrofa) на основе исследования полиморфизма генов MC1R и NR6A1 / В. Н. Кипень [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика / Институт гюе-нетики и цитологии НАН Беларуси ; редкол.
A. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск, 2019. - Т. 26. - С. 83-95.
19. Animal Genetic Resources in China Pigs / L. Y. Wang [et al.] // Beijing: Chinese Agriculture Press. - 2011. - Р. 25-29.
20. Genomic Analysis To Identify Signatures of Artificial Selection and Loci Associated with Important Economic Traits in Duroc Pigs / Yun-long Ma [et al.] // G3 (Bethesda, Md.). - 2018.
- Vol. 8 (11). - P. 3 617-3 625. - DOI: 10.1534/ g3.118.200665
21. Multifactor-dimensionality reduction reveals high-order interactions among estrogen-metabolism genes in sporadic breast cancer / M. D. Ritchie [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 2001. - Vol. 69(1). - P. 138-147. - DOI: 10.1086/321276
22. Analysis of HEPH Gene Polymorphism on the X Chromosome for Identification of Wild Boar and Domestic Pig / V. N. Kipen [et al.] // Russian Journal of Genetics. - 2020. - Vol. 56. - P. 1 0991 108. - DOI: 10.1134/S1022795420080062
23. Дифференциация пород домашних свиней c использованием расширенного биоин-форматического анализа SNP / В. Н. Кипень [и др.] / Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2022. - Т. 66. - № 3. - С. 301-309.
- DOI: 10.29235/1561-8323-2023-67-2-119-125
24. GENIS — методологический подход для генотипирования in silico (апробация на результатах секвенирования для Sus scrofa) /
B. Н. Кипень, Е. В. Снытков // Математическая биология и биоинформатика. - 2024. - № 19(1).
- С. 36-51. - DOI: 10.17537/2024.19.36
25. Sequence Read Archive [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.ncbi.nlm. nih.gov/sra. - Дата доступа: 01.09.2023.
26. Pig Quantitative Trait Locus Database [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.animalgenome.org. - Дата доступа: 01.09.2023.
V. N. Kipen, E. V. Snytkov, М. Е. Mikhailova, R. I. Sheyko
DIFFERENTIATION OF PIG BREEDS USING KASP TECHNOLOGY — TESTSYSTEM FOR DUROC
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: v.kipen@igc.by
Using the biological material (the earmarks of the following pig breeds: Belarusian Large White, Belarusian Meat, Duroc, Landrace, Yorkshire), the high differentiating potential of the polymorphic variants rs80967182, rs81333725 (RXFP1) and rs80859281 (ASAH2) for the differentiation of Duroc pigs from other breeds was established. The test model consisting of three single nucleotide polymorphisms, which is characterized by the high values of accuracy (98.4%), specificity and sensitivity, was proposed for the identification of Duroc pigs. Using KASP, a quick and simple approach to differentiation was developed based on the proposed test model, which is destined to reduce the time and financial costs of molecular genetic analysis, as well as the risk of cross-contamination since the process is one-stage (restriction and electrophoresis stages are excluded).
Keywords: Sus scrofa domesticus, single nucleotide polymorphism, differentiation, kompetitive allele-specific PCR (KASP), in silico genotyping.
Дата поступления в редакцию: 07 сентября 2023 г.
