CC BY
184
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
УДК 619: 616.98: 578: 616-076
Дифференциальная диагностика коронавирусных гастроэнтеритов свиней
О.Е. Латышев1, кандидат биологических наук ([email protected]), М.А. Арутюнова1,
О.В. Елисеева1, кандидат биологических наук, О.В. Сергеев2, кандидат биологических наук ([email protected]), Т.В. Гребенникова1, доктор биологических наук, О.А. Верховский1, доктор биологических наук,
Т.И. Алипер3, доктор биологических наук
1 АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных» (Москва).
2 ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» МЗ РФ (Москва).
3 НПО «НАРВАК» (Москва).
В статье описаны результаты исследования поголовья в 26 промышленных свиноводческих хозяйствах, находящихся в 14 регионах России, на две коронавирусные кишечные инфекции свиней — ТГС и ЭДС. Исследование проведено с использованием двух методов диагностики: ОТ-ПЦР и иммунохроматографии на нитроцеллюлозных стрипах. Результаты показывают, что ареал распространения ТГС в различных регионах России существенно сокращается, тогда как ЭДС расширяется. Отмечена важность вакцинопрофилактики ЭДС в России с использованием опыта вакцинации свиней против ТГС.
Ключевые слова: иммунохроматография, полимеразная цепная реакция, трансмиссивный гастроэнтерит свиней, эпизоотическая диарея свиней Сокращения: ИФА — иммуноферментный анализ, ИХТС — иммунохроматографический метод на нитроцеллюлозных мембранах, ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция в обратной транскрипции, РКВС — респираторный коронавирус свиней, РН — реакция нейтрализации, РНК — рибонуклеиновая кислота, ТГС — трансмиссивный гастроэнтерит свиней, ТЦД — тканевая цитопатическая доза, ЦПД — цитопатическое действие, ЭДС — эпизоотическая диарея свиней, OIE — World Organisation for Animal Health (Международное эпизоотологическое бюро — МЭБ)
Введение
Коронавирусные гастроэнтериты свиней широко распространены в странах с развитым свиноводством. Основными возбудителями этих болезней являются РНК-содержащие вирусы ТГС и ЭДС, относящиеся к роду Coronavirus семейства Coronaviridae [4]. До 80-х годов прошлого столетия ТГС был широко распространен во многих странах мира и причинял значительный экономический ущерб, однако с появлением (1984) и быстрым распространением в свиноводческих хозяйствах природного делеционного мутанта вируса ТГС — РКВС в европейских странах значительно сократились вспышки ТГС и циркуляция вируса. В настоящее время случаи заболевания ТГС являются спорадическими, по данным OIE, их периодически регистрируют в Европе, Северной Америке и Азии. В США при циркуляции в популяции свиней РКВС проблема специфической профилактики ТГС не потеряла своей актуальности [10]. В нашей стране благодаря использованию современных средств диагностики и вакцинопрофилактики удалось оздоровить и значительно снизить число неблагополучных по ТГС свиноводческих хозяйств [1].
В отличие от зарубежных стран, ЭДС на территории РФ зарегистрирована сравнительно недавно (2006-2007 гг.), однако это заболевание, также как и ТГС, характеризуется высокой контагиозностью и по-
тенциальной способностью причинять значительный экономический ущерб неблагополучным хозяйствам. Так как по клинической картине ЭДС и ТГС неразличимы между собой («заболевания-близнецы»), своевременная дифференциальная диагностика и специфическая профилактика указанных инфекций служат залогом их быстрой ликвидации.
В настоящее время лабораторная диагностика ко-ронавирусных инфекций включает в себя обнаружение вирусного антигена, самого вируса или его нуклеиновой кислоты и специфических антител. Для дифференциальной диагностики ЭДС и ТГС используют ИФА
[2, 3, 9], ОТ-ПЦР, в частности дуплексную ОТ-ПЦР [6_8],
а также (и весьма успешно) ИХТС с иммобилизованными моноклональными антителами против структурных белков вирусов ТГС и ЭДС [5]. Вирус-специфические антитела обычно выявляют в РН и ИФА. Дифференциальная диагностика коронавирусных инфекций — необходимое звено в системе дальнейших ветеринарно-санитарных мероприятий и основной аргумент для применения в хозяйстве средств специфической профилактики.
Цель исследования
Посредством комплекса молекулярно-биологических и иммунологических методов исследований провести дифференциальную диагностику коронавирусных гастроэнтеритов свиней в неблагополучных свиноводческих хозяйствах ряда регионов РФ. Исследовать на ТГС и ЭДС посредством серологических методов ввозимое в хозяйства поголовье свиней.
Материалы и методы
Исследования проводили в течение 2007-2013 гг. в крупных свиноводческих хозяйствах, из которых в 26 наблюдались гастроэнтериты неустановленной этиологии. Материалом для исследования служили ткани или содержимое тонкого кишечника больных свиней различного возраста. Диагностический материал до исследования хранили при температуре не выше -5 °С. Пат-материал измельчали, смешивали с физиологическим
Дифференциальная диагностика коронавирусных гастроэнтеритов свиней
Распространенность ТГС и ЭДС в промышленном свиноводстве России
Число Результаты исследований
Регион повторных ОТ-ПЦР ИХТС
исследований ТГС ЭДС ТГС ЭДС
Вологодская обл. 3 19/4 19/11 5/3 5/3
2 1/0 1/0 НИ НИ
1/0 1/1 НИ НИ
Московская обл. 2 3 26/0 26/13 18/9 18/6
3 13/1 13/11 10/0 10/10
2 9/0 9/2 5/0 5/1
2 7/0 7/6 НИ НИ
3 4 27/1 27/9 4/4 4/0
Белгородская обл. 4 17/1 17/14 5/1 5/1
5 3 24/3 24/19 НИ НИ
6 3 12/0 12/3 НИ НИ
7 1/0 1/0 НИ НИ
8 1/1 1/0 НИ НИ
Краснодарский 10/0 10/7 НИ НИ
край 2 2/0 2/0 3/0 3/0
Самарская обл. 3 7/1 7/5 НИ НИ
2 1 4/0 4/2 НИ НИ
Новгородская обл. 1 2 24/0 24/7 23/0 23/5
Псковская обл. 1 1 5/0 5/3 НИ НИ
Ярославская обл. 1 7 18/3 18/8 11/5 11/10
Пензенская обл. 1 2 2/0 2/2 НИ НИ
Смоленская обл. 1 2 6/0 6/0 6/0 6/0
Тюменская обл. 1 3 24/1 24/6 3/0 3/3
Томская обл. 1 2 8/0 8/0 4/0 6/1
Свердловская обл. 1 2 22/2 22/7 9/0 9/5
Удмуртия 1 1 20/0 20/0 4/0 4/1
Итого 26 310/18 310/36 110/22 110/46
Примечание. В числителе — число проб, исследованных указанным методом, в знаменателе — число положительных проб от общего числа исследованных. НИ — не исследовали
раствором (1:1) и осветляли (применяли метод отстоя или низкоскоростное центрифугирование).
Для установления этиологии коронавирусных энтеритов свиней (ТГС или ЭДС) использовали два принципиально различных метода: ОТ-ПЦР, основанную на выявлении вирусного генома (310 проб кишечного материала, взятого от больных, погибших или вынужденно убитых свиней разного возраста) и ИХТС, основанную на выявлении вирусного антигена (110 проб кишечного материала, взятого от больных поросят).
Вирусную РНК для ОТ-ПЦР выделяли из патматери-ала по методике компании «Promega» (США) с использованием рекомендованных реактивов. ОТ-ПЦР ставили с праймерами и по методике, разработанными в ООО «Ветбиохим» («Инструкция по применению тест-системы для обнаружения вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и эпизоотической диареи методом полимеразной цепной реакции», 2009 г.).
Для иммунохроматографического исследования использовали коммерческие наборы «Antigen Rapid TGE/PED Ag Kit» и «ZETECT TGE/PED» компании «BIONOTE» (Южная Корея) в соответствии с инструкцией производителя. Отрицательным контролем служил аналогичный материал от клинически здоровых животных.
Для серологических исследований (ИФА) использовали коммерческий набор для выявления и дифференциации антител к вирусу ТГС и респираторному коронавирусу свиней «ТГС/РКВС - СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим»). Постановку реакции, учет и интерпретацию полученных результатов проводили согласно наставлению по применению.
Антитела к вирусу ЭДС в сыворотке крови свиней и в молозиве (молоке) свиноматок выявляли посредством РН (микрометод), которую ставили в 96-луноч-ных полистироловых планшетах с использованием культуры клеток Vero со сплошным монослоем. Активированный вирус ЭДС в концентрации 2...4 х 103 ТЦД50/мл смешивали с равным объемом серийного раз-
ведения сыворотки или молозива, инкубировали 1 ч при 37 °С и вносили в лунки с культурой клеток. Далее инкубировали 1 ч при 37 °С в атмосфере, содержащей 4 % СО2, после чего удаляли внесенную смесь, монослой клеток отмывали от сыворотки и вносили поддерживающую среду ДМЕМ с трипсином (5__10 мкг/мл). План-
шеты инкубировали при 37 °С в атмосфере с 4 % СО2. Результаты реакции учитывали через 5 суток по наличию или отсутствию ЦПД в культуре. Вируснейтрализую-щий титр сыворотки выражали как предельное ее разведение, ингибирующие развитие ЦПД вируса в 50 % зараженных культур клеток.
Результаты и обсуждение
Результаты по дифференциальной диагностике ТГС и ЭДС приведены в таблице.
Из представленных в таблице данных видно, что посредством ПЦР РНК вируса ТГС была выявлена в 18 пробах (5,8 % общего числа), а РНК вируса ЭДС — в 136 пробах (43,9 %); 6 проб (1,9 %) содержали РНК двух вирусов. При проведении ИХТС вирус ТГС обнаружили в 22 пробах (20 %), вирус ЭДС — в 46 пробах (41,8 %). При этом ни одной пробы, положительной на оба вируса, не было выявлено. Наиболее удобным и результативным материалом для выявления вирусов ЭДС и ТГС обоими методами оказались фекалии свиней разного возраста, взятые в начале профуз-ной диареи.
При исследовании свиноматок-реконвалесцентов (и, возможно, вирусоносителей) из инфицированных стад был установлен высокий уровень вируснейтра-лизующих антител в сыворотке крови. Так, значение титра антител к вирусам ЭДС и ТГС составило 1:64...1:512.
Проведенные исследования показали, что посредством ИХТС можно быстро (в течение 1 ч) выявить и дифференцировать вирусы ТГС и ЭДС в патологическом материале. Однако при использовании ИХТС для получения результата необходимо минимальное количество вирусного антигена, эквивалентное 105 ТЦД50/мл культурального вируса, что не всегда бывает в пробах, содержащих вирус ЭДС.
Метод ПЦР значительно чувствительнее: он позволяет выявить одну копию генома (вирусную частицу) в 1 мл суспензии. Но необходимо значительно больше времени для получения результатов, особенно при исследовании большого числа проб. Поскольку специфичность обоих методов высокая, их можно рассматривать как взаимодополняющие в дифференциальной диагностике близкородственных вирусов.
На основании результатов, представленных в таблице, можно сделать основной вывод о том, что многие свиноводческие хозяйства промышленного типа из числа исследованных оказались неблагополучными по коронавирусным гастроэнтеритам: одни из них были неблагополучны по ТГС, другие — по ЭДС, третьи — по ЭДС и ТГС. Вместе с тем следует отметить, что ареал распространения ТГС в различных регионах России существенно сокращается, а ЭДС расширяется. Этот вывод подтверждается результатами серологического исследования ввозимого в хозяйства поголовья (п>5000), которые показали, что в большин-
О.Е. Латышев, М.А. Арутюнова, О.В. Елисеева, О.В. Сергеев, Т.В. Гребенникова, О.А. Верховский, Т.И. Алипер
стве случаев у серопозитивных животных выявляли антитела к РКВС, в нескольких случаях — к вирусу ЭДС и не выявляли антител к вирусу ТГС.
Выводы
Полученные результаты свидетельствуют о значительно более широком распространении ЭДС в промышленном свиноводстве России в настоящее время по сравнению с ТГС. Значительное сокращение заболеваемости свиней ТГС в России, по нашему мнению, обусловлено, прежде всего, своевременной диагностикой и эффективной вакцинопрофилактикой свиней в предыдущий период (конец XX — начало XXI столетия). Первичное появление ЭДС в РФ пришлось на конец 2006 г. — начало 2007 г. и, вероятно, связано с интенсивным импортом племенных свиней, латентно инфицированных вирусом ЭДС.
Результаты проведенных исследований указывают на особую актуальность вакцинопрофилактики ЭДС в промышленном свиноводстве РФ с использованием опыта борьбы против ТГС.
Библиография
1. Алипер, Т.И. Инактивированная вакцина при трансмиссивном гастроэнтерите свиней (ТГС) / Т.И. Алипер, Е.И. Непоклонов, В.А. Сергеев // Ветеринария. — 2002. — №8. — С. 18-21.
2. Carvajal, A. Evaluation of an ELISA for the detection of porcine epi demic diarrhea virus (PEDV) in feces of naturally infected pig / A. Carvajal, R. Diego, I. Lanza et al. // Proc. 3rd Congr. ESW, 1995a. — Р. 516-519.
3. Carvajal, A. Evaluation of a blocking ELISA using monoclonal antibodies for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and its antibodies / A. Carvajal, R. Diego, I. Lanza et al. // J. Vet. Diagn. Invest. — 1995b. — N.7. — P. 60-64.
4. Gonzalez, J.M. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae / J.M. Gonzalez, P. Gomez-Puertas, D. Cavanagh et al. // Arch Virol. —
2003. — N. 148. — P. 2207-2235.
5. Kang, J.H. Development of a simple and rapid immunochromatographic strip test for diarrhea-causative porcine rotavirus in swine stool / J.H. Kang, D.H. Kwon, T.W. Chung et al. // J. Virol. Methods. — 2007. — N. 146. — P. 74-79.
6. Kim, O. In situ hybridization for the detection and localization of porcine epidemic diarrhea virus in the intestinal tissues from naturally infected piglets / 0. Kim, C. Chae // Vet. Pathol. —
2000. — N. 37. — P. 62-67.
7. Kim, S.Y. Differential detection of transmis sible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR / S.Y. Kim, D.S. Song, B.K. Park // J. Vet. Diagn. Invest. —
2001. — N. 13. — P. 516-520.
8. Kubota, S. Detection of porcine epidemic diarrhea virus using polymerase chain reaction and comparison of the nucleocapsid protein genes among strains of the virus / S. Kubota, 0. Sasaki, K. Animoto et al. // J. Vet. Med. Sci. — 1999. — N. 61. — P. 827-830.
9. Kweon, C.H. Cell adaptation of KPEDV-9 and serological survey on porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection in Korea / C.H. Kweon, B.J. Kwon, Y.B Kang., S.H. An // Korean J. Vet. Res. — 1994. — N. 34. — P. 321-326.
10. Saif LJ. Animal coronavirus vaccines: lessons for SARS / L.J. Saif // Dev. Biol. (Basel). —
2004. — N. 119. — P. 129-140.
SUMMARY O.Ye. Latyshev1, M.A. Arutyunova1, O.V. Yeliseeva1, O.V. Sergeyev2, T.V.Grebennikova-i, O.A. Verkhovsky1, T.I. Aliper3
1 Diagnostic and Prevention Research Institute (DPRI) for Human and Animal Diseases, Independent Non-Profit Organization (Moscow).
2 D. Ivanovsky Institute of Virology, Ministry of Health of Russia (Moscow).
3 R&D NARVAC (Moscow).
Differential Diagnostic of Coronaviral Gastroenteritis in Pigs. The article describes a survey of the two coronaviral gastrointestinal infections of swine, transmissible gastroenteritis (TGE) and porcine epidemic diarrhea (PED). The survey was carried out on 26 industrial pig raising farms in 14 regions of Russia. Two techniques were applied: reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunochromatography on nitrocellulose strips. The results show that TGE has become less widespread on the industrial pig farms, whereas the frequency of PED is on the rise. The importance of vaccine-based control of PED in Russia using the experience of vaccination against TGE is pointed out.
Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации 1 квартал 2014 года
Наиболее тревожные факты в условиях ухудшения общей ветеринарной эпидобстановки в стране
Хронические инфекции — бруцеллез — эпидситуация продолжает ухудшаться.
Субклинические заболевания — лейкоз КРС — нет положительных изменений в эпидситуации. Природно-очаговые/синантропные заболевания — лептоспироз — ситуация не улучшается.
Экзотические инфекции — африканская чума свиней — серьезное ухудшение ситуации — распространение продолжается. Формируется вторичная эпи-эндемичная по АЧС зона на территории европейской части страны.
В 1 квартале 2014 года зарегистрировано 16 новых неблагополучных по АЧС пунктов (в том числе, 4 — в популяции домашних свиней, 12 — в дикой фауне) и 2 инфицированных объекта (мясная продукция, поступившая в Московскую и Орловскую области из ПХ «Лазаревское» Тульской области).
В январе 2014 года вспышка АЧС выявлена в крупном племенном хозяйстве в Тульской области (поголовье восприимчивых животных в очаге составило 58, 5 тыс. голов).
Впервые заболевание домашних свиней было выявлено в ранее благополучных Брянской и Калужской областях.
Всего с 2007 года (на 30.03.2014) по данным всех источников информации в Российской Федерации выявлено 32 инфицированных объекта и 624 очага АЧС, в том числе 334 — в популяции домашних свиней (из которых 69 — на свиноводческих предприятиях и 290 — в дикой фауне).
В европейской части Российской Федерации образовались 2 эндемичные по АЧС зоны, заболевание продолжает распространяться (5 новых территорий объявили о своем неблагополучии в 2013 году: Белгородская, Владимирская, Смоленская. Псковская, Тамбовская области).
По данным Информационно-аналитического центра Россельхознадзора
