CC BY
158
УДК 632: 633
ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ СИМПТОМОВ У СОРТООБРАЗЦОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ИЗ КОЛЛЕКЦИИ ВНИИР
А.П. ГЛИНУШКИН, кандидат биологических наук, доцент
Оренбургский ГАУ
О.О. БЕЛОШАПКИНА, доктор сельскохозяйственных наук, профессор
РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева С.В. ВИНОГРАДОВА, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник
Научный центр «Биоинженерия» РАН Н.А. НИКОЛАЕВ, научный сотрудник Оренбургский ГАУ E-mail: [email protected]
Резюме. Исследование проводили с целью определения распространенности проявления симптомов вирусных болезней и перспективности сортообразцов из фондов ВНИИР им. Н.И. Вавилова в селекционном процессе. Идентификацию вирусов, потенциально поражающих растения пшеницы, в том числе, принадлежащих к родам Tritimovirus, Furovirus, проводили методами визуального агроэкологи-ческого мониторинга и обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Из растений пшеницы с симптомами инфекции выделяли тотальную РНК по методу, описанному Rott and Jelkman (1990), которую использовали для ОТ-ПЦР в качестве матрицы. Для детекции были подобраны праймеры на области белков оболочки SBWMV, WSMV. В результате исследований визуально выявлена группа сортообразцов без признаков поражения вирусными заболеваниями. Для дальнейшего использования в селекции предложены формы со стандартным количеством общих стеблей (до 7, 5 шт., 0 баллов): Choc, Rafale (Франция); Leopold (Австрия); Susquehanna, Norkan (США); Казачок, Волга-Дон (Волгоград); КНИИСХ 756, Быстрица, Селянка, КНИИСХ8 (Краснодар); Мироновская 34, Василина (Украина); Оренбургская 14, Безор 2 (Оренбург); Северодонская 14 (Ростов). В условиях степной зоны Южного Урала впервые методом ОТ-ПЦР проведена достоверная идентификация возбудителей вируса полосатой мозаики пшеницы (ВПМП - WSMV) и почвообитающего вируса мозаики пшеницы (ПВМП - SBWMV).
Ключевые слова: коллекция ВНИИР, вирусы, устойчивость, идентификация.
В условиях Оренбургского Предуралья в последние годы расширилась зона распространения вирусов с высокой степенью вредоносности, которые поражают злаковые и в особенности зерновые культуры. Причины их распространения - глобализация сельского хозяйства, интенсификация выращивания зерновых, расширение международного обмена семенным материалом. Смешанные инфекции разного происхождения и этиологии наносят еще более значительный ущерб. Среди обнаруженных за последнее десятилетие новых (emerging) инфекционных болезней растений почти половина имеет вирусную природу [1-3].
Зерновые культуры в России поражаются в основном вирусом желтой карликовости ячменя, вирусом мозаики костра, вирусом полосатой мозаики пшеницы, вирусом штриховатой мозаики ячменя, вирусом мозаики злаков и вирусом закукливания злаков. В Европе диагностировано более 60 вирусов. А в мире число вирусов, поражающих злаки, уже превысило 90 [4].
Источник инфекции вирусных заболеваний - многолетние злаковые травы и сорняки, озимые и их падали-
ца. Передача патогенов осуществляется насекомыми, нематодами, грибами, механическим путем, специфическими переносчиками.
Наряду с химическими средствами защиты растений необходимо уделять внимание селекционногенетическим и биологическим методам, как элементам интегрированной защиты от патогенных комплексов. Задача достаточно сложная, потому что одни виды патогенов передаются насекомыми, другие - нематодами и грибами, третьи - механическим путем.
Цель наших исследований провести визуальную диагностику вирусоподобных симптомов у сортообразцов озимой пшеницы коллекции ВНИИР, выявить наиболее перспективные из них для использования в селекции, определить возбудителей вирусных болезней молекулярно-генетическим методом.
Условия, материалы и методы. Объект исследований - сортообразцы коллекции ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова.
Полевую диагностику осуществляли на естественном инфекционном фоне в период развития вирусных заболеваний. Исследования проводили на опытном поле Оренбургского ГАУ, в коллекционном питомнике, в 4-х польном селекционном севообороте, площадь делянки 2 м2. Агротехника общепринятая для зоны, норма высева 4,0 млн всхожих семян на 1 га, почва - чернозём южный. По степени проявления симптомов вирусного заболевания сортообразцы разделяли на 5 групп: условно устойчивые; с признаками поражения до 5 %; от 5 до 25 %; от 25 до 50 %; более 50 %.
По нашему мнению, в селекционном процессе необходимо учитывать и количество нормальных стеблей (побегов) на одном растении. Поэтому сортообразцы без признаков поражения вирусами мы дополнительно разделили по такому признаку с использованием следующей шкалы: 0 баллов -стандартное количество общих стеблей (до 7, 5 шт.);
1 балл - от 7,5 до 12 стеблей; 2 балла - 12...20 стеблей; 3 балла - 20.50 стеблей; 4 балла - более 50 стеблей или отсутствие продуктивных стеблей. При этом мы сразу учитывали, что образцы, получившие
1 балл, необходимо изучать более внимательно, поскольку после своеобразной адаптации к местным условиям они вполне могут послужить донорами для создания перспективных линий и сортов. Поэтому указанную группу делили еще на две части (10,8±1 и 8,5 ± 1 шт.). Поскольку в суровых условиях Южного Урала (суровая зима, острозасушливое лето, резкие перепады температур весенне-осеннего периода), поэтому многочисленное стеблеобразование приносит только потери для озимой пшеницы. Пригодными для дальнейшей селекции считали образцы, получившие 0 баллов.
Определение вирусов родов Tritimovirus, Furovirus проводили методами агроэкологического мониторинга и обратной полимеразной цепной реакции.
РНК из растений озимой пшеницы выделяли методом, изложенным Яойапсиектап (1990). Навеску
листьев массой 0,3 г растирали в 3 мл буфера для выделения (4 М гуанидинтиоционат, 0,2 М CH3COONa pH 5,2, 25 мМ ЭДТА, 1 M CH3COOK, 2,5 % PVP-40, 1 % 2-меркаптоэтанол) с использованием пакетов для экстракции Bioreba. К 350 мкл жидкой фазы добавляли 100 мкл 10 % лаурил-саркозил натрия и 5 мкл 2-меркаптоэтанола. Смесь инкубировали 10 мин. при температуре 70 °С на шейкере, 5 мин. во льду и центрифугировали 10 мин. при 13000g. 300 мкл супернатанта переносили в пробирку, содержащую 150 мкл 96 %-ного этанола, 300 мкл NaI (6 М Na2SO3, 4,8 М NaI) и 25 мкл частиц SiO2, перемешивали и инкубировали на шейкере при комнатной температуре 10 мин. После этого центрифугировали и дважды промывали полученный осадок буфером (10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 50 % этанол). Затем осадок высушивали, ресуспендировали в 60 мкл воды MQ. Полученную смесь инкубировали 5 мин. при температуре 70 °С, центрифугировали 3 мин. при 13000g. Супернатант отбирали и хранили при -20 °С.
Синтез одноцепочечной кДНК проводили с помощью обратной транскриптазы RevertAid H Minus M-MuLV (Fermentas). Состав реакционной смеси: 2 мкг РНК; 0,1 мкг Randomprimer; Н2О до 5 мкл. Инкубировали ее в течение 10 мин. при температуре 70 °С, затем осаждали капли в центрифуге при +4 °С и добавляли: 5х буфера для обратной транскриптазы; 1 мМ dNTPs; 200 ед. RevertAidHMinusM-MuLV; Н2О до 30 мкл.
ПЦР осуществляли с помощью полимеразы фирмы Fermentas на амплификаторе Eppendorf Master cycler personal. Состав реакционной смеси для ПЦР (объем 15 мкл): 10х буфер для Taq полимеразы; 2,5 мМ MgCl2; 1 пмоль/мкл - прямой праймер; 1 пмоль/мкл - обратный праймер; 0,2 мМ dNTPs; 0,375 ед Taq полимеразы; 2 мкл кДНК-матрицы; MQ до общего объема 15 мкл.
Полученные ПЦР-продукты анализировали в
2 %-ном агарозном геле.
Праймеры к Soil-borne wheat mosaic virus (SBWMV):
SBVMV_F: GAC GGT GAC GAG ATT TTC TGC,
SBVMV_R: CCG TCA ACT CGA ACC TTC CCA.
Размер продукта - 300 нуклеотидов. Условия проведения ПЦР: один цикл 95 °C - 2 мин.; 40 циклов 95 оС - 35 сек.; 40 циклов 54.62 оС - 35 сек.; 40 циклов 72 оС - 35сек.; один цикл 72 оС - 5 мин.
Результаты и обсуждение. В период исследований в посевах отмечали достаточно много переносчиков вирусов, в том числе цикадки, тли, трипсы, клоп вредная черепашка, блошки, мухи, хлебные жуки, кузнечики и др. Например, количество цикад весной в фазе кущения (1-я декада мая) составляло 31,5±10,5 шт., а при кошении 122±18 шт. на 25 взмахов энтомологическим сачком.
Распространенность вирусоподобных признаков от 50 до 100 % отмечали у сортообразцов Garmil, Logor, Famulus (Франция); КоЬга (Польша); Maris Huntsman, Encore (Англия); McNair 1587, John (США); Samara (Чехия); Верна, 193 Р3, 145 Р2, Колос 47, Наследница, 193 Р1, Вольница (Краснодар); Зарница, Дон 93 (Зер-ноград); Маяк 267, Безор 1, Пионерская 32 (Оренбург); Мироновская 28, Мироновская 32, Мироновская 63, Хлебодарка (Украина); Родник тарасовский, Донская 50 (Ростов);
от25до 50 % - Alcan (Франция); Avir (Нидерланды); Cherokee, Кау (США); Georg (Австрия); Rialto, Sarasen (Англия); Sarka, Livia (Чехия); Taras, Roti (Германия);
Горянка (Адыгея); Краснодарская 90, 146 Р6, Княжна, Лютесценс 660, Хуторянка, Дея (Краснодар); Светоч (Безенчук); Северодонецкая юб., Тарасовская ост., Августа (Ростов);
от5до 25 % - Century, ТАМ 107; Purcam, KS89WGRC6, Cimarron (США); Chieftain, Alert (Англия); Saskia, Samanta (Чехия); Satsukei 131 (Япония); Быстрица, 177 Р2, (Краснодар); Ермак (Зерноград); Лютесценс 321 (Воронеж); Лютесценс 80-08 (Саратов); Мироновская 31 (Украина); Престиж, Росинка тарасовская (Ростов); Сплав (Владимир);
не более 5 % - Aviesan (Румыния); Bersy (Нидерланды); KS90WGRC10, Andrews (США); Livius, Hubertus (Австрия); Louvre (Франция); Viscount (Англия); Дон 85, Зерноградка 11, Ростовчанка 3 (Зерноград); Зимородок (Краснодар); Криста (Латвия); Лютесценс 47-01 (Саратов); Мироновская 33, Мироновская 64 (Украина); Мироновская 5/5 (Эстония); Московская 39 (Москва); Оренбургская 105 (Оренбург).
Практическую селекционную ценность имеет группа без признаков поражения, которая дает надежду на получение селекционным путем новых сортов, устойчивых к болезни, хотя среди них могут быть сортообразцы индуктивно устойчивые, с латентной формой, бессимптомно зараженные, толерантные и действительно устойчивые.
Наибольшим числом стеблей на растение среди образцов мировой коллекции озимой пшеницы без проявления симптомов вирусных возбудителей отличался Willi (Австрия) - 34±5 шт. В следующую группу с числом стеблей 15±3 шт. были отнесены Charmany, Chiefkan (США); Coquelles (Франция); Pitko (Jo 3063) (Финляндия); Губерния (Саратов); Зiрница (Украина); 10,8±1 шт./раст. - Горная поляна (Волгоград); Mosa (США); Sofia (Чехия); 8,5±1
- Brigadier, Amelio (Франция); Mandat (Англия); TCEP 9038, Nelson (США); Безор 3 (Оренбург); Дон 95 (Зерноград); Лютесценс 310 (Воронеж); Лютесценс 31-98 (Саратов); Ника Кубани, Офелия (Краснодар); Поволжская 86 (Самара); Ресурс (Безенчук); 5,5 ±
2 шт./раст. - Choc, Rafale (Франция); Leopold (Австрия); Susquehanna, Norkan (США); Казачок, Волга-Дон (Волгоград); КНИИСХ 756, Быстрица, Селянка, КНИИСХ 8 (Краснодар); Мироновская 34, Василина
WSMV РНК
1-^-* * і \ ■ t
0 0RT 12 3 -к +к м 1 2 3 -к м
Рис. 1. Результаты диагностики вирусов на сортоо-бразцах озимой пшеницы с питомника испытаний сортов и сортообразцов на естественном инфицированном фоне с праймерами на WSMV: О - ПЦР без ДНК матрицы; 0RT - ОТ-ПЦР без РНК; 1...3 - ОТ-ПЦР на препарате РНК, выделенной из анализируемых образцов; -к - ОТ-ПЦР на препарате РНК, выделенной из неинфицированного растения; +к - положительный контроль на прохождение ПЦР (детекция вируса некротического пожелтения жилок свеклы); М - маркер молекулярной массы (Fermentas, GeneRuler™ 1ОО bp DNA Ladder); далее соответствующие препараты РНК.
(Украина); Оренбургская 14, Безор 2 (Оренбург); Северодонская 14 (Ростов).
Отсутствие или слабое проявление признаков поражения вирусоподобными организмами может быть генетически обусловлено устойчивостью к другим патогенам, индуцирующей устойчивость и к вирусному поражению (например, сотообразец Brigadier имеет ген устойчивости к ржавчине Lr37) [5], к повреждаемости переносчиками, климатическим и другим факторам. В то же время, например, сортообразец Московская 39 имеет ген устойчивости к ржавчинным возбудителям Lr1, однако вирусоподобные симптомы у него проявляются на уровне 5 %, что свидетельствует о его восприимчивости к таким заболеваниям. По результатам наших исследований к перспективным для селекции можно отнести сортоо-бразец Norkan. Наряду с наличием гена устойчивости к ржавчине Lr24, на его растениях не наблюдаются визуально диагностируемые вирусоподобные признаки поражения.
Специализированные исследования по идентификации вирусных инфекций злаков позволили впервые в степной зоне Южного Урала достоверно определить методом ПЦР наличие вируса полосатой мозаики пшеницы (ВПМП - WSMV) и почвообитающего вируса мозаики пшеницы (ПВМП - SBWMV).
Вирус полосатой мозаики пшеницы (рис. 1) подробно охарактеризован в литературе. Его циркуляция в природе происходит посредством вредителей (клеща Aceriatulipae и др.). Ранее считалось, что вирус ВПМП не передается контактно между растениями и очень слабо с семенами, однако в последние годы эти сведения частично опровергаются [6].
В образце №4 (рис. 2) детектирован почвообитающий вирус мозаики пшеницы (SBWMV). Устранение источников вирусной инфекции пшеницы не реально из-за огромного количества растений-хозяев (например, у вирусов группы желтой карликовости более 150 растений-хозяев из 5 подсемейств Poaceae) и
отсутствия практической возможности пространственной изоляции посевов пшеницы и ячменя от лугов и пастбищ [4]. Поэтому для интегрированной защиты озимой пшеницы от вирусного паткомплекса наиболее эффективно создание и освоение устойчивых сортов.
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 2. Детекция SBVMV в растениях озимой пшеницы: 1 - маркер молекулярной массы (Fermentas, GeneRuler™ 1ОО bp DNA Ladder); 2 - продукт ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы; 3...5 - продукт ПЦР на исследуемых образцах пшеницы; В - продукт ПЦР на незараженном образце пшеницы (отрицательный контроль); 7 - контроль прохождения ПЦР реакции на матрице BNYVV (с праймерами к белку оболочки).
Выводы. Выявлена группа сортообразцов коллекции ВНИИР без визуальных признаков поражения вирусными заболеваниями, среди которых для дальнейшей селекции в условиях Южного Урала рекомендованы Choc, Rafale (Франция); Leopold (Австрия); Susquehanna, Norkan (США); Казачок, Волга-Дон (Волгоград); КНИИСХ 75В, Быстрица, Селянка, КНИИСХ 8 (Краснодар); Мироновская 34, Василина (Украина); Оренбургская 14, Безор 2 (Оренбург); Северодонская 14 (Ростов).
В изучаемой популяции растений впервые в регионе достоверно методом ПЦР идентифицированы возбудители вируса полосатой мозаики пшеницы (ВПМП
- WSMV) и почвообитающего вируса мозаики пшеницы (ПВМП - SBWMV).
Литература.
1. Белошапкина О.О., Насролланеджад С., Романенко Н.Д. К вопросу разработки экологически безопасных способов контроля ассоциаций нематодопереносимых и других наиболее опасных групп вирусов на картофеле. // Тезисы IV международного нематологического симпозиума. - М., 2001. - С. 138-139.
2. Чирков С.Н. Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. - М.: МГУ, 2009. - с. Б1.
3. Можаева К.А. Итоги изучения жёлтой карликовости ячменя. // Известия ТСХА. - 2011. - №1. - с. 24-32.
4. Шпаар Д., Робенштайн Ф., Кастир Р., Хабескус А. Вирусные болезни — серьезная угроза для выращивание зерновых культур в Европе // Весці Нацыяналнай АкадэмН Навук Беларусі. — 2006. — № 3. — С. 60-Т0.
Б. Интернет атлас McIntosh et al., 199Б WHEAT RUSTS. http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/symbolClassList.
jsp
6. Юхименко А. І. Патогенні та мутагенні властивості вірусів озимої пшениціі можливістьїх використання в селекційнійпрактиці: Дис... канд. с.-г. наук: 06.01.0Б. — К.: Миронівський ін-тпшениці ім. В.М.Ремесла, 2000. - 20 р.
DIAGNOSIS OF VIRUS SYMPTOMS IN WINTER WHEAT ACCESSIONS FROM THE VNIIR A.P. Glinushkin, O.O. Beloshapkina, S.V. Vinogradova, N.A. Nikolaev
Summary. Selection of accessions and sowing of winter wheat collection of funds N.I.Vavilov Research Institute of Plant Industry was conducted with the objectives of the definition: the productivity and quality of grain, phytosanitary characteristics (damage by pests (vectors), the prevalence of symptoms of viral, bacterial, fungal diseases), promising accessions in the selection process. Identification of viruses, potentially affecting the wheat plants including belonging to the genera Tritimovirus, Furovirus performed by visual agroecological monitoring and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Of wheat plants with symptoms in the total RNA was isolated using the method described Rott and Jelkman (1990), which was used for RT-PCR as a template. Were selected for detection by using information on the field genebank primer coat proteins SBWMV, WSMV and synthesized by "Synthol" Moscow. As a result, a group of visually identified accessions with no signs of defeat viral diseases: Choc, Rafale (France); Leopold (Austria); Susquehanna, Norkan (USA), Cossack, Volga-Don (Volgograd); KNIISKH 756, Bystrica, villager, KNIISKH 8 ( Krasnodar); Mironovskaya 34 Vasilina (Ukraine), Orenburg 14, Besouro 2 (Orenburg) Severodonskaya 14 (Rostov) and had a score of 0 on the proposed grade (tillering) - being the prime candidates for selection. In the steppe zone of the Southern Urals, the first time RT-PCR positive identification of pathogens - virus wheat streak mosaic (WSMV) and soil-wheat mosaic virus (SBWMV).
Keywords: collection of winter wheat, viruses, stability, identification.
