CC BY
117
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Диагностика семейной гиперхолестеринемии у детей в семьях с отягощенной наследственностью
Ф.М.Захарова1, В.И.Голубков1, Б.М.Липовецкий2, В.О.Константинов1, М.Ю.Мандельштам1, В.Б.Васильев1
’НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург;
2НИИ мозга РАН, Санкт-Петербург
Семейная гиперхопестеринемия - наследуемая форма нарушения липидного обмена, вызванная мутациями в гене рецептора липопротеинов низкой плотности, диагностика и лечение которой необходимы уже в детстве. В статье приведены результаты обследования 66 родственников пробандов с мутациями в гене рецептора липопротеинов низкой плотности, в число которых входило 35 детей. Диагноз семейной гиперхолестеринемии методами ДНК-диагностики был подтвержден у 11 детей и исключен у 24. В работе обсуждаются современные подходы к лечению семейной гиперхолестеринемии. Ключевые слова: дети, ДНК-диагностика, мутации, рецептор липопротеинов низкой плотности, семейная гиперхолестеринемии
Diagnostics of familial hypercholesterolemia in children from families with compromised inheritance
F.M.Zakharova1, V.l.Golubkov1, B.M.Lipovetsky2, V.O.Konstantinov1, M.Yu.Mandelshtam1, V.B.Vassilyev1
'Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg;
!Research Institute of Human Brain, St. Petersburg
Familial hypercholesterolemia (FH) is an inherited disorder of lipid metabolism caused by mutations in the low density lipoprotein (LDL) receptor gene. Diagnostics and treatment of FH is required already in childhood. We have studied 66 relatives of the probands with mutations in the LDL receptor gene including 35 children. Diagnosis of FH was confirmed by DNA analysis in 11 children and excluded in 24. Modern approaches to treatment of FH are discussed.
® Key words: children, DNA analysis, mutations, low density lipoprotein receptor, familial hypercholesterolemia
Многие формы нарушений липидного обмена носят наследственный характер. Наиболее хорошо изучена семейная гиперхолестеринемия - моногенное заболевание с аутосомно-доминантным типом наследования. Причиной семейной гиперхолестеринемии является снижение скорости катаболизма липопротеинов низкой плотности вследствие количественной недостаточности или дисфункции их специфического рецептора, вызываемых мутациями в кодирующем его гене. Выделяют гомозиготную и гетерозиготную формы заболевания. При первой рецепторы практически полностью не функционируют, и уровень холестерина в 4-5 раз превышает норму (800-1000 мг/дл), при гетерозиготной форме концентрация холестерина превышает норму в среднем в 2 раза (350-400 мг/дл). Частота гетерозиготной формы в большинстве этнических популяций составляет
Для корреспонденции:
Фаина Михайловна Захарова, кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела молекулярной генетики НИИ экспериментальной медицины РАМН
Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12
Телефон: (812) 234-3356
E-mail: f.zakharova@VS5518.spb.edu
Статья поступила 16.04.2004 г., принята к печати 13.12.2004 г.
1 случай на 500 человек [1]. В отличие от гетерозиготной, гомозиготная форма встречается редко (1:1 000 000 новорожденных). У гомозиготных больных уже в раннем возрасте развиваются клинические проявления атеросклероза (в частности — атеросклеротический стеноз устья аорты) и ишемическая болезнь сердца (ИБС). Многие из них умирают в подростковом возрасте. В США и Западной Европе около 5% людей, перенесших инфаркт миокарда в возрасте до 60 лет, больны семейной гиперхолестеринемией [2].
К настоящему моменту спектр мутаций гена рецептора липопротеинов низкой плотности достаточно хорошо изучен в Европе, Северной Америке и в Японии. Большинство известных мутаций гена рецептора липопротеинов низкой плотности описано именно в этих регионах [3]. Использование ДНК-диагностики в семьях больных семейной гиперхолестеринемией позволяет выявлять детей, унаследовавших заболевание, и предотвратить развитие у ребенка таких последствий семейной гиперхолестеринемии, как ранний атеросклероз, ИБС и др., своевременно начав его лечение. Однако у разных народов и этнических групп спектр мутаций значительно отличается, поэтому невозможно использовать данные, полученные в одной стране, для диагностики семейной гиперхолестеринемии в других [4]. Изучение встречаемости отдель-
ных мутаций и полиморфизмов у разных народов позволяет рационально планировать стратегию диагностики семейной гиперхолестеринемии в каждой конкретной стране.
Пациенты и методы
Таблица 1. Сводные результаты наших исследований в семьях пробандов с мутациями в гене рецептора липопротеинов низкой плотности
Число Число семей Число родственников
мутаций (пациентов) с мутациями
с мутациями взрослые дети 32 38 (66) 16 11
Число родственников без мутаций взрослые дети
15 24
Для исследования были отобраны 66 пациентов с клиническим диагнозом семейной гиперхолестеринемии и со спорадическими случаями гиперлипидемии. Критерии для постановки клинического диагноза семейной гиперхолестеринемии были следующие: повышенный уровень холестерина и, в частности, холестерина липопротеинов низкой плотности (гиперлипидемия типа На или 116); у пациентов наличие в их семьях нескольких случаев гиперлипидемии или инфарктов миокарда в раннем возрасте, обнаружение у больных ксантом сухожилий или липоидных дуг роговицы [5]. Для установления диагноза считали достаточным три или любые два из перечисленных критериев. Отбор пациентов проводился в клиниках Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН и Института мозга РАН. В каждом случае было получено согласие пациентов и их родственников для тестирования на мутации, определяющие развитие семейной гиперхолестеринемии. Для анализа наследования мутаций в семьях использовали ДНК всех доступных для изучения родственников.
Поиск мутаций проводили с помощью скрининга всех 18 экзонов и промоторной области гена рецептора липопротеинов низкой плотности, анализируя конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК (ЗБСР) и затем секвенируя амплификаты (накопление ДНК). В работе использовали также следующие биохимические методы: полимеразную цепную реакцию (Г1ЦР), гетеродуплексный и рестрикционный анализы, различные виды электрофореза.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенной работы помимо частых полиморфизмов было идентифицировано 32 различные мутации [6]. Из них 17 были идентифицированы впервые в мире, а 27, по-видимому, явились причиной развития семейной гиперхолестеринемии у их носителей. Все 27 мутаций ведут к сдвигу рамки считывания, влияют на сплайсинг (процесс объединения экзонов в матричную ДНК) или изменяют аминокислотный остаток в полипептидной цепи рецептора липопротеинов низкой плотности. Для большинства известных ранее мутаций их роль в развитии семейной гиперхолестеринемии была уже показана в других исследованиях. Почти для всех обнаруженных нами мутаций мы разработали быстрые методы анализа: рестрикционный, гетеродуплексный и ЗБСР. Используя эти методы быстрой идентификации мутаций, мы провели анализ их наследования в семьях пробандов у всех доступных для анализа родственников. Общее число обследованных родственников составило 66 человек, среди них — 35 детей. В результате наших исследований диагноз заболевания был подтвержден у 11 детей и исключен у 24 из них (табл. 1). На рис. 1 и 2 представлены две элект-рофореграммы с результатами анализа наследования мутаций Е397Х и С74Х в отдельных семьях пробандов. В семье больной Б. с мутацией Е397Х среди 7 обследованных родст-
венников было 5 детей. Мы показали, что мутацию Е397Х, являющуюся причиной гиперхолестеринемии у пробанда, унаследовали 3 из них (дорожки 4, 8 и 9, рис. 1). Еще 2 детей не имели мутации, и признаки гиперхолестеринемии у них отсутствовали (дорожки 3 и 5, рис. 1) [7]. Анализ наследования другой мутации С74Х показал, что оба ребенка пробанда ее не имеют (дорожки 2 и 4, рис. 2) [8].
Несмотря на то, что мутации в гене рецептора липопротеинов низкой плотности приводят к нарушению удаления холестерина из кровотока и, как следствие, к увеличению уровня холестерина в крови, нельзя диагностировать признаки семейной гиперхолестеринемии у детей только биохимическими методами, так как у них клинические проявления могут отсутствовать. Если гомозиготная форма заболевания легко выявляется по высокому уровню холестерина, то
454 152 174 238 225 216 362 285 254
Уровень общего холестерина, мг/дл
Рис. 1. Анализ наследования мутации Е397Х в семье больной Б.
На дорожках №1-9 представлены продукты гидролиза эндонуклеазой А1и I амплифицированных последовательностей экзона 9 больной Б. и ее родственников. В результате мутации Е397Х в этом эк-зоне возникает новый сайт для рестриктазы А1и I. Наличие дополнительных фрагментов (156 п.н. и 117 п.н.) на дорожках №1, 4, 7, 8, 9 свидетельствует о наличии у соответствующих членов семьи мутации Е397Х в гетерозиготном состоянии. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага I, полностью гидролизованную рестриктазой Рэ11 (дорожка М). Перечеркнутыми фигурами на схеме обозначены умершие родственники. Электрофорез проводили в 8% ПААГ, ДНК окрашивали серебром.
семьях
>в низ-
нников
ИЙ
дети
24
Е397Х, банда, э2 де-;мии у наслега про-
проте-
1ИЯ хо-чению ь при-биохи-мения элева-1на, то
м
■
юй Б.
'клеа-боль->м эк-опол-,7, 8, ,и му-а мо-лизо-'рами рово-
175 197 371 140
Уровень общего холестерина, мг/дл
Рис. 2. Анализ наследования мутации С74Х в семье больного 3.
На дорожках №1-4 представлены продукты гидролиза эндонуклеазой Рс1е I амплификатов экзона 3 гена рецептора липопротеинов низкой плотности больного 3. и членов его семьи. Мутация С74Х приводит к появлению нового сайта для эндонуклеазы Рс1е I. На дорожке №3 видна дополнительная зона (31 п.н.), свидетельствующая о наличии у пациента 3. мутации С74Х. Дополнительный фрагмент и, соответственно, мутация С74Х отсутствуют у жены, сына и дочери пробанда. Электрофорез проводили в 8% ПААГ, гель окрашивали серебром.
при гетерозиготной форме уровень холестерина может сильно варьировать (табл. 2). На рис. 1 видно, что общий уровень холестерина в крови у детей с мутацией (дорожки 4, 8 и 9) и у детей, ее не имеющих (дорожки 3 и 5), отличается, но не очень сильно. Так, у ребенка без мутации (дорожка 5) он составляет 225 мг/дл, а у детей с мутациями 238 и 254 мг/дл (дорожки 4 и 9, соответственно). Анализ ДНК позволяет однозначно решить вопрос, унаследовал ли ребенок
Таблица 2. Содержание холестерина и триглицеридов ("ГГ) в плазме крови у членов семьи с ребенком, гомозиготным по семейной гиперхолестеринемии (1-4)
№ Возраст, хс, тг, ХС ЛВП, Симптомы Примечания
пациента лет мг/дл мг/дл мг/дл семейной гипер- холестеринемии
1-1, отец 49 451 81 51 Дуги роговицы, ксантомы Умер от инфаркта
1-2, мать 48 480 104 66 Нет
1-3. дочь 13 280 158 35 Нет
1-4, сын 17 700 120 35 Дуги роговицы, ксантомы, стеноз устья аорты Умер в 17 лет
мутации в гене рецептора липопротеинов низкой плотности и, как следствие, семейной гиперхолестеринемии.
В настоящее время разработан ряд правил коррекции нарушений липидного обмена у детей и подростков. Прежде всего, рекомендуется определять липидный профиль детей, у родителей которых ИБС развилась в возрасте 45-55 лет или имеются наследственные нарушения липидного обмена. Это же исследование необходимо провести детям с диагнозом «сахарный диабет», с подозрением на семейную гиперхолестери-немию или другие врожденные нарушения липидного обмена. В случаях выраженной клинической картины семейной гиперхолестеринемии и высокого риска развития ИБС у ребенка решение о медикаментозной терапии (см. ниже) должно приниматься после обследования ребенка в специализированной клинике с обязательным проведением генетического анализа. Своевременно поставленный диагноз позволяет предотвратить развитие у ребенка таких последствий семейной гиперхолестеринемии, как ранний атеросклероз, ИБС и связанные с ними инфаркты миокарда. Диетологическая и лекарственная терапии не должны использоваться у детей младше 2 лет.
При гомозиготной форме семейной гиперхолестеринемии у детей старше 10 лет доказана необходимость периодического, с интервалом 3-4 нед, плазмафереза или иммуносорбции липопротеинов низкой плотности, без которых медикаментозное лечение неэффективно. Их необходимо комбинировать с приемом статинов [9, 10]. Использование ста-тинов для лечения гиперхолестеринемических состояний в качестве основных лекарств у взрослых и детей с гетерозиготной формой семейной гиперхолестеринемии уже вошло в повседневную практику [11]. Однако в связи с отсутствием данных о последствиях длительного их применения у детей начинать прием статинов обычно рекомендуют по достижении ими половой зрелости [12]. Для лечения гомозиготной формы семейной гиперхолестеринемии как у взрослых, так и у детей в настоящее время успешно используется комбинация статинов и ингибитора сорбции холестерина в кишечнике - эзетимиба [13]. В целом, использование эзетимиба в педиатрической практике выглядит предпочтительнее в сравнении с применением статинов и холестерин-связываю-щих смол (например, холестирамина), зачастую плохо переносимых пациентами. Однако, результаты полномасштабных клинических испытаний, доказывающих эффективность и безопасность применения эзетимиба у детей с семейной гиперхолестеринемией, еще неизвестны.
Радикальной терапией для детей с гомозиготной семейной гиперхолестеринемией считается лишь пересадка печени [14-16], поскольку даже перенос таким детям функционального гена рецептора липопротеинов низкой плотности с помощью генотерапии не дает длительной нормализации уровня холестерина в крови [17].
Еще одним важным аспектом применения генетического анализа является пренатальная диагностика. В отличие от гетерозиготных носителей мутации в гене рецептора липопротеинов низкой плотности, гомозиготы умирают в детстве или в подростковом возрасте. В табл. 2 и 3 представлены данные о семьях с детьми-гомозиготами. В первом случае сын (пациент 1-4) наследовал, по-видимому, разные мутации от гетерозиготных родителей, которые не являлись родственниками (табл. 3) и умер в 17 лет. Уровень холестерина
Таблица 3. Содержание липидов плазмы крови у нескольких детей с гомозиготной и гетерозиготной формами семейной гиперхолестеринемии
№ пациента Пол Возраст, Тип семейной хс, тг,
лет гиперхолистеринемии мг/дп мг/дп
1^1 М 17 гомозиготная 700 120
4-1 Ж 11 гомозиготная 825 95
3-1 Ж 10 гетерозиготная 254 134
3-2 м 10 гетерозиготная 285 67
3-3 м 12 гетерозиготная 238 68
7-1 м 11 гетерозиготная 385 69
18-2 ж 12 гетерозиготная 302 74
в его крови составлял 700 мг/дп. Во втором случае (табл. 3) гомозиготным носителем мутации была девочка (пациентка 4-1), родившаяся в близкородственном браке. Общий уровень холестерина в ее крови в 11 лет составил 825 мг/дп. Проведя пренатальную ДНК-диагностику, рождение детей с гомозиготной формой семейной гиперхолестеринемии у ро-дителей-гетерозигот можно было бы предотвратить. В мире уже имеются случаи пренатальной диагностики для выявления или исключения мутаций в гене рецептора липопротеи-нов низкой плотности у плода [18-20].
Таким образом, выявление клиническими методами пациентов, гетерозиготных по семейной гиперхолестеринемии, идентификация у них мутаций в гене рецептора липо-протеинов низкой плотности позволяет в дальнейшем методами ДНК-диагностики идентифицировать генетические нарушения у детей пробандов, и, следовательно, начать своевременное лечение и предотвратить развитие у них атеросклеротической болезни. Подобную ДНК-диагностику существенно облегчает знание спектра мутаций, распространенных в отдельных регионах России [6].
Работа была поддержана грантами Президента РФ №МК-899.2003.04 и Совета по поддержке Ведущих научных школ России HLLI-1730.2003.4.
Литература
1. Brown M.S., Goldstein J.L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science 1986; 232(4746): 34-47.
2. Goldstein J.L., Schrott H.G., Hazzard W.R., et al. Hyperlipidemia in coronary heart disease. II. Genetic analysis of lipid levels in 176 families and delineation of a new inherited disorder, combined hyperlipidemia. J Clin Invest 1973; 52; 544-68.
3. http://www.ucl.ac.uk/fh/
4. Мандельштам М.Ю. Что дало изучение семейной гиперхолестеринемии для
МЕЖДУНАРОДНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ПЕЧАТЬ
понимания генетики дислипидемий? Медицинская генетика 2003; 2(12): 509-19.
5. Липовецкий Б.М. Клиническая липидология. СПб.: Наука, 2000; 119.
6. http://www.iemrams.spb.ru/russian/molgenru/fh
7. Chakir Kh., Mandelshtam M.Ju., Shevtsov S.P., et al. Two novel low density lipoprotein receptor gene mutations (E397X and 347delGCC) in St.Petersburg familial hypercholesterolemia. Mol Genet Metab 1998; 65: 311-4.
8. Захарова Ф.М., Голубков В.И., Мандельштам М.Ю. и др. Идентификация новой миссенс-мутации G571E, новой молчащей мутации Н229Н, нонсенс-мутации С74Х и четырех однонуклеотидных полиморфизмов в гене рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейной гиперхолестерине-мией Санкт-Петербурга. Биоорганическая химия 2001; 27(5): 393-6.
9. Алиджанова Х.Г., Кухарчук В.В., Творогова М.Г. Опыт длительного лечения симвастатином больных наследственной гиперхолестеринемией. В сб. Актуальные вопросы клинической медицины. М., 1996; 15.
10. Волкова Э.Г. Руководство по коррекции липидных нарушений и атеросклероза у больных сахарным диабетом. 1995; 13.
11. De Jongh S., Ose L., Szamosi Т., et al. Efficacy and safety of statin therapy in children with familial hypercholesterolemia: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with simvastatin. Circulation 2002; 106(17): 2231-7.
12. Tonstad S. Treatment of children with familial hypercholesterolemia. Expert Rev Cardiovasc Ther 2003; 1(1): 135^11.
13. Gagne C., Gaudet D., Brucker E., et al. Eficacy and safety of ezetimibe coadministered with atorvastatin or simvastatin in patients with homozygous familial hypercholesterolemia. Circulation 2002; 105(21): 2469-75.
14. Bilheimer D.W., Goldstein J.L., Grundy S.M., et al. Liver transplantation to provide low-density-lipoprotein receptors and lower plasma cholesterol in a child with a homozygous familial hypercholesterolemia. N Engl J Med 1984; 311(26): 1658-64.
15. Bilheimer D.W. Portacaval shunt and liver transplantation in treatment of familial hypercholesterolemia. Arteriosclerosis 1989; 9(1): 158-63.
16. Revell S.P., Noble-Jamieson G„ Johnston P., et al. Liver transplantation for homozygous familial hypercholesterolemia. Arch Dis Child 1995; 73(5); 456-8.
17. Grossman М., Raper S.E., Kozarsky K., et al. Successful ex vivo gene therapy directed to liver in a patient with familial hypercholesterolemia. Nat Genet 1994; 6(4): 335-41.
18. Reshef A., Meiner V., Dann E.J., et al. Prenatal diagnosis of familial hypercholesterolemia caused by the «Lebanese» mutation at the low density lipoprotein receptor locus. Hum Genet 1992; 89(2): 237-9.
19. Stefanutti C., Vivensio A. First prenatal diagnosis of familial hypercholesterolemia by a molecular biology technique. Clin Ter 1993; 143(2): 99-103.
20. Vergotine J., Thiart R., Langenhoven E., et al. Prenatal diagnosis of familial hypercholesterolemia: importance of DNA analysis in the high-risk South African population. Genet Couns 2001; 12(2): 121-7.
Клиническая дерматология 2006
Clinical Dermatology 2006
6-8 апреля 2006 г.
Вена, Австрия
Оргкомитет: Organising Secretariat, ССТ Postgraduate Education Limited, 50-52 Union Street, London SE1 1TD United Kingdom Телефон: +44-171-407-9731 Факс: +44-171-378-9268 or +44-171-403-0066 E-mail: d2000@cctltd.u-unet.com
7-й Международный конгресс по детской пульмонологии
7th International Congress on Pediatric Pulmonology 8-11 июля 2006 г.
Монреаль, Канада Оргкомитет: Annie Bidart, MD Телефон: 33-0-497-038-597 Факс: 33-0-497-038-598 E-mail: cipp@cipp-meeting.com
25-й Международный конгресс по педиатрии
25th International Congress
of Pediatrics
25-30 августа 2007 г.
Афины, Греция
Оргкомитет: С & С International S.A., 16 Paradisou street, Athens Телефон: 30-2-106-889-100 Факс: 30-2-106-844-777 E-mail: icp2007@cnc.gr
