Научная статья на тему 'Диагностика клинического полиморфизма дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у больных с гипербилирубинемией'

Диагностика клинического полиморфизма дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у больных с гипербилирубинемией Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

CC BY
1553
119
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ДЕТИ / INFANTS / ГИПЕРБИЛИРУБИНЕМИЯ / HYPERBILIRUBINEMIA / ДЕФИЦИТ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ / GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE DEFICIENCY / ГЕН G6PD / МУТАЦИИ С.563С>Т / С.1311С>Т / G6PDGENE / С.563 С>Т AND С.1311 С>Т MUTATIONS

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Акперова Гюнай Афизовна

С целью определения природы гипербилирубинемии новорожденных исследованы две азербайджанские семьи. Материалом исследований служила кровь новорожденных с желтухой, их сибсов и родителей. Составлены и проанализированы родословные пробандов, определен уровень гемоглобина, эритроцитов, билирубина и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, проведено ДНК-секвенирование гена G6PD. У пробандов установлен дефицит фермента и гемизиготность по данному гену. В семьях пробандов у родителей и сибсов также установлены гомозиготное, гетерозиготное и гемизиготное состояние. Установлены два средиземноморских варианта гена G6PD. с.563С>Т и с.1311С>Т, влияющих на клинический полиморфизм дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в обследуемых семьях. Определение уровня общего и конъюгированного билирубина и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у новорожденных может снизить тяжелые последствия гипербилирубинемии и предотвратить риск развития необратимых неврологических нарушений, вызванных ядерной желтухой.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Акперова Гюнай Афизовна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Diagnosis of the clinical polymorphism of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in patients with hyperbilirubinemia

Two Azerbaijani families were examined to determine the nature of neonatal hyperbilirubinemia. Blood samples from neonatal infants with jaundice, their siblings, and parents were an object of this investigation. The pedigrees of the probands were compiled and analyzed. The levels of hemoglobin, red blood cells, and bilirubin and the activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) were determined; DNA sequencing of the G6PD gene was carried out. The probands were found to have G6PD deficiency and to be hemizygous for this gene. In probands’ families, the parents and siblings were also established to be homozygous, heterozygous, and hemizygous. The examined families showed two Mediterranean G6PD gene variants: c.563 C>T and c.13l1 C>T, which influenced the clinical polymorphism of G6PD deficiency. The determination of total and conjugated bilirubin levels and G6PD activity in newborn infants may reduce the severe consequences of hyperbilirubinemia and prevent the risk of irreversible neurological disorders caused by jaundice.

Текст научной работы на тему «Диагностика клинического полиморфизма дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у больных с гипербилирубинемией»

Диагностика клинического полиморфизма дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у больных с гипербилирубинемией

Г.А. Акперова

Бакинский государственный университет, Республика Азербайджан

Diagnosis of the clinical polymorphism of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in patients with hyperbilirubinemia

G.A. Akperova

Baku State University, Republic of Azerbaijan

С целью определения природы гипербилирубинемии новорожденных исследованы две азербайджанские семьи. Материалом исследований служила кровь новорожденных с желтухой, их сибсов и родителей. Составлены и проанализированы родословные пробандов, определен уровень гемоглобина, эритроцитов, билирубина и активности глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы, проведено ДНК-секвенирование гена G6PD. У пробандов установлен дефицит фермента и гемизиготность по данному гену. В семьях пробандов у родителей и сибсов также установлены гомозиготное, гетерозиготное и гемизиготное состояние. Установлены два средиземноморских варианта гена G6PD с.563С>Т и с.1311С>Т, влияющих на клинический полиморфизм дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в обследуемых семьях. Определение уровня общего и конъюгированного билирубина и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у новорожденных может снизить тяжелые последствия гипербилирубинемии и предотвратить риск развития необратимых неврологических нарушений, вызванных ядерной желтухой.

Ключевые слова: дети, гипербилирубинемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, ген G6PD, мутации с.563С>Т, с.1311С>Т.

Two Azerbaijani families were examined to determine the nature of neonatal hyperbilirubinemia. Blood samples from neonatal infants with jaundice, their siblings, and parents were an object of this investigation. The pedigrees of the probands were compiled and analyzed. The levels of hemoglobin, red blood cells, and bilirubin and the activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) were determined; DNA sequencing of the G6PD gene was carried out. The probands were found to have G6PD deficiency and to be hemizygous for this gene. In probands' families, the parents and siblings were also established to be homozygous, heterozygous, and hemizygous. The examined families showed two Mediterranean G6PD gene variants: c.563 C>T and c.1311 C>T, which influenced the clinical polymorphism of G6PD deficiency. The determination of total and conjugated bilirubin levels and G6PD activity in newborn infants may reduce the severe consequences of hyperbilirubinemia and prevent the risk of irreversible neurological disorders caused by jaundice.

Key words: infants, hyperbilirubinemia, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, G6PDgene, с.563 С>Тand с.1311 С>Тmutations.

Сегодня в мире около 400 млн человек имеют ферментопатию — дефицит глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы (OMIM № 300908). Заболевание наследуется рецессивно, сцепленно с хромосомой Х, встречается преимущественно в Африке, Азии, Средиземноморье и на Ближнем Востоке [1—4]. Эта распространенная энзимопатия является основной причиной возникновения неонатальной желтухи в эндемичных популяциях. Доминирование аномальных вариантов недостаточности глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы именно в популяциях тропического пояса объясняется определенной устойчивостью носителей к характерному для этой зоны заболеванию — малярии, вследствие того, что дефицит активности фермента ведет к патологическому изменению эритроцитов [5].

Среди стран СНГ болезнь наиболее распространена в Азербайджане, где в отдельных селах зарегистрировано до 38% гемизиготных мужчин [6]. Энзимопатия широко распространена в Астаринском

© Г.А. Акперова, 2015

Ros Vestn Perinatol Pediat 2015; 3:67-70

Адрес для корреспонденции: Акперова Гюнай Афизовна — к.б.н., доц. кафедры генетики и теории эволюции Бакинского государственного университета AZ-1148 Азербайджан, Баку, ул. Халилова, д. 23

и Лерикском районах республики, с частотой встречаемости 28,9 и 36,4% соответственно [7].

При сильной выраженности дефицит глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы вызывает гиперби-лирубинемию, а прием некоторых медикаментов и определенной пищи ведет к усилению желтухи. У новорожденных с энзимопатией может развиться ядерная желтуха с поражением ЦНС, причиной чего является нарушение функции печени и повышенное образование неконъюгированного билирубина. Неонатальная желтуха часто сопровождается низкой массой тела, резус-конфликтом, поэтому требуется проведение дифференциальной диагностики с указанными состояниями [8]. Примахино-вая анемия у пациентов с гипербилирубинемией не всегда связана с дефицитом глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, что доказывает ее гетерогенность, которая может быть вызвана генетическими факторами [9]. Определение содержания гемоглобина и эритроцитов, уровня непрямого билирубина и активности энзима является значимым методом дифференциальной диагностики при недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Для уточнения диагноза часто требуются молекулярно-генетиче-ские исследования.

С целью определения природы заболевания нами обследованы две азербайджанские семьи, в которых были зарегистрированы случаи рождения детей с тяжелой гипербилирубинемией.

Материал и методы

Материалом исследований служила кровь пробан-дов с неонатальной желтухой, их сибсов и родителей. Полный анализ крови проведен на гематологическом анализаторе Coulter Counter (Sysmex KX-21N, Sysmex Corporation). Уровень общего и конъюгиро-ванного сывороточного билирубина в крови определяли на аппарате Cobas integra 400 plus (Roche, Швейцария). Определение активности фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы осуществлялось качественным методом флуоресцирующих пятен по методу Beutler—Baluda [10] и количественным анализом с применением Pointe Scientific, Inc., Бельгия, согласно протоколу [11]. Тельца Гейнца определяли по методике Дейчи [12].

При клиническом обследовании пробандов составляли и анализировали родословные [13]. В числе общих причин патологической гипербилирубинемии у новорожденных исключались несовместимость по АВО-группе и резус-показателям, сепсис, гематомы и недоношенность [14].

Для проведения молекулярно-генетического анализа ДНК экстрагировали с помощью комплекта PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Life Technologies, США) согласно протоколу [15]. Проверку качества/концентрации ДНК, экстрагированной из крови, проводили при помощи NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Х=260/230 нм, Х=260/280 нм (Thermo Fisher Scientific, США) соответственно протоколу [16]. Результаты полимеразной цепной реакции проверялись на 2% агарозном геле.

ДНК-секвенирование проведено с использованием Terminator Ready Reaction Mix of ABI PRISM® Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, v 2.0 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, СШA) на ABI PRISM™ 310 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, emA) и ABI PRISM™ 3500xL

Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi). Анализ результатов секвенирования проведен с применением программы Sequencing Analysis, v. 1.1/3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, СШA).

С целью определения значимости различий сопоставляемых величин применялся критерий t Стью-дента [17].

Результаты и обсуждение

Проведены исследования в двух многодетных семьях, где новорожденные мальчики в возрасте 5 дней (А.) и 7 дней (К.) имели выраженную желтуху.

Установлено, что у пробанда А. активность энзима составляла <10% от нормы (см. таблицу). Однако у него не наблюдались тяжелые гемолитические кризы, что, вероятно, связано со свойствами мутантного фермента, а также с другими генетическими факторами.

Каждодневное наблюдение показало, что на 2-й день жизни уровень общего билирубина повышал -ся почти до 11 мг/дл и впоследствии постепенно возрастал, что свидетельствовало о патологической желтухе. Как правило, этот показатель повышается до 12 мг/дл у доношенных детей на 5-й день жизни, при отсутствии аномалий метаболизма билирубина дальнейшее увеличение происходит максимум до 15 мг/дл. Повышение уровня общего билирубина выше 17 мг/дл и пропорциональное снижение содержания конъюгированного билирубина ниже 0,1 мг/дл свидетельствуют о гипербилирубинемии новорожденных. Это заболевание может быть последствием тяжелой формы дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, ведущего к патологическому ограничению поглощения билирубина печенью вследствие мутации гена G6PD.

Пробанд А. родился в многодетной (семеро детей) семье, в которой супруги — двоюродные сибсы. Установлено, что А. и его отец являются гемизиготами по дефициту глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, мать и две сестры — гетерозиготы, три другие сестры — гомозиготы, у брата определяется нормальная активность фермента.

У матери и ее дочерей, гетерозиготных по недостаточности фермента, имеются слабовыраженные клинические проявления дефицита глюкозо-6-фос-

Лабораторные показатели пробандов

Параметры Контроль Пробанд А. К.

Гемоглобин, г/дл 16,2±2,1 8,7+2,1 5,4+3,1

Ретикулоциты, % 0,4+0,035 5,7+2,9 6,6+3,4

Эритроциты, 106/мкл 5,7±1,04 2,9+1,2 3,3+1,4

Билирубин, мг/дл 3,6+1,1 17,1+5,3 18,7+5,7

Г6ФД, Е/г НЬ 9,8+1,5 0,5+0,09 0,3+0,09

Общий билирубин, мг/дл 0,67+0,29 22,2+5,01 24,0+5,36

Конъюгированный билирубин, мг/дл 0,18+0,09 0,04+0,01 0,03+0,01

Примечание. Г6ФД — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Акперова Г.А. Диагностика клинического полиморфизма дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у больных с гипербилирубинемией

фатдегидрогеназы с 50% активностью фермента (5,3 Е/г НЬ). При этой форме болезни энзимопатия проявляется только при приеме определенных лекарственных препаратов и нивелируется вскоре после прекращения их приема.

В результате опроса установлено, что у девочек, гомозиготных по дефициту энзима (возраст 5, 10, 12 лет), в первые дни после рождения имели место желтушность, увеличение селезенки, выраженная анемия с резким снижением количества эритроцитов, нечастыми гемолитическими кризами. Активность фермента у них составила в среднем 2,7±1,5 Е/г НЬ.

Активность фермента у отца (2,1±1,0 Е/г НЬ) составила 15% от нормы. Этот показатель не соответствовал умеренной тяжести клинических проявлений, что, возможно, связано с отсутствием приема лекарственных средств окислительного действия. При опросе выяснилось, что у родного брата отца после приема некоторых препаратов наблюдались гемолитические кризы, а в семье матери пробанда наблюдались спонтанные выкидыши, что еще раз свидетельствует о наследственном характере заболевания.

В семье К., родители которого не являются кровными родственниками, недостаточность фермента в гемизиготном состоянии наблюдалась только у самого пробанда, гетерозиготность — у двух сестер. Кроме того, в данном браке зарегистрирован случай мертворождения ребенка мужского пола. Мать является гомозиготной по заболеванию с 10% (1,3 Е/г НЬ) активностью фермента, но не имеет явно выраженных клинических признаков.

У гетерозиготных девочек выявлена 60% активность фермента (4,5 Е/г НЬ) от нормы. У них наблюдались умеренные проявления болезни, что обусловлено наличием в организме популяции нормальных и мутантных эритроцитов. Незначительные отклонения в лабораторных показателях от нормы объясняются превалированием циркулирования в крови нормальных эритроцитов. Такое явление имеет место у гетерозиготных носителей мутантного гена при неравной инактивации несущей дефект хромосомы Х на ранних стадиях эмбриогенеза. В анамнезе у сестер пробанда (возраст 4,5 и 2 года) наблюдались периодические гемолитические кризы во время вирусных инфекционных заболеваний. Кризы сопровождались снижением показателя гемоглобина и повышением уровня билирубина в крови, что, вероятно, являлось следствием подавления вирусом кроветворной функции костного мозга и нарушением функций печени.

Как следует из предыдущих исследований, клинический полиморфизм дефицита глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы зависит от типа и места мутаций гена G6PD, состоящего из 13 экзонов и 12 интронов, общей протяженностью более 18 кб. Молекулярный анализ гена G6PD выявил около 200 различных мутаций, вызывающих до 400 биохимических вариантов энзимопатии [18].

Методом полного секвенирования ДНК с целью определения варианта мутации гена G6PD, ведущей к дефициту глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и установления корреляция типа мутации с тяжестью клинических проявлений, проанализированы образцы ДНК пробандов и членов их семей. В результате установлены две подгруппы дефицита фермента — средиземноморский вариант мутаций с.563С>Т и с.1311С>Т (см. рисунок).

Мутация с.563С>Т характеризуется субституцией серина на фенилаланин в позиции 188 в 6-м экзоне, ведущей к резкому снижению активности фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (<1 Е/г НЬ) [19]. В семье пробанда А. данный вариант мутации гена G6PD установлен у пробанда, его гомозиготных сиб-сов и отца. В семье пробанда К. данный вариант мутации обнаружен у пробанда и его матери.

У матери пробанда А., его гетерозиготных сестер установлен полиморфизм с.1311С>Т в 11-м экзо-не гена G6PD. При указанном полиморфизме цитозин метилируется в 5'-метилцитозин, который, в свою очередь, спонтанно дезаминируется в тимидин. Данная модификация экзона также обнаружена у гетерозиготных сестер пробанда К. и у его матери. В последнем случае полиморфизму с.1311С>Т сопутствует мутации с.563С>Т. При с.1311С>Т варианте аминокислотных изменений не происходит, поэтому данная сайленс-мутация часто сопровождает мутацию с.563С>Т в 6-м экзоне. Присутствие двух гаплотипов средиземноморского варианта мутации гена гена G6PD одновременно возможно является следствием как смешения популяций, так и самостоятельного повторения мутаций различными генетическими путями.

У лиц с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогена-зы и вариантом с.1311С>Т без мутации с.563С>Т при-

( ( (,(.( И. I < I .< < < 4 1« 1С < I !<,; к С (.!<.'(.«:

шш

э

( гс.чтячлрл I' (,< т г < г: с: I (,< № с: I с

б

Средиземноморский вариант мутации гена G6PD с.563 С>Т (а) и с.1311 С>Т (б).

сутствие полиморфизма объясняется моноцентрич-ным происхождением средиземноморского варианта мутаций гена G6PD, а отсутствие данного полиморфизма в остальных случаях является следствием вну-тригенной рекомбинации. По активности фермента вариант с.1311С>Т показал практически 50%-й уровень. Присутствие кодонов ТАС и ТАТ, согласно Gene Bank, у человека встречается в 15,3 и 12,1% случаев соответственно. Среди вариантов гена G6PD дикого типа частота кодона ТАС — 14%, ТАТ — 7%. Таким образом, присутствие полиморфизма с.1311С>Т ведет к небольшому снижению активности фермента, вызывая легкий вариант энзимопатии.

Таким образом, определение уровня общего и конъюгированного билирубина и активности глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы у новорожденных способствует ранней диагностике наследственной недостаточности фермента, может снизить тяжелые последствия гипербилирубинемии и предотвратить риск развития необратимых неврологических нарушений, вызванных ядерной желтухой.

Проведенные исследования демонстрируют доминирующий эффект действия вариантов с.563С>Т

и с.1311С>Т на экспрессию гена ОбРБ у гемизигот-ных мужчин и гомозиготных женщин. У гетерозиготных женщин обычно экспрессия гена не изменяется, однако в результате искажения Х-инактивации ведет к дефициту фермента глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы. Последнее объясняется возможным наличием мутаций за пределами регионов, охваченных анализом секвенирования, и множественностью мутаций в гене ОбРБ у женщин. Установление гетерозиготных лиц позволяет выявить наследственные аномалии фермента для успешной дифференциальной диагностики гемолитических анемий у новорожденных. Осведомленность гетерозиготных носителей о наличии у них данной патологии поможет избежать излишних диагностических исследований при гемолитических реакциях, возникающих во время инфекционных заболеваний, а также правильно назначить лечение с исключением лекарственных препаратов, являю -щихся потенциальными гемолитическими агентами.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке Фонда развития науки при Президенте азербайджанской республики — Грант № Е1 ¥-ИоЬ-2-2013-4(10)-13/0б/3.

ЛИТЕРАТУРА

1. CappelliniM., Fiorelli G. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Lancet 2008; 371: 9606: 64-74.

2. Frank J. Diagnosis and management of G6PD deficiency. Am Fam Physician 2005; 72: 7: 1277-1282.

3. Mason P., Bautista J., Gilsanz F. G6PD deficiency: the geno-type-phenotype association. Blood Rev 2007; 21: 5: 267-283.

4. Minucci A., Concolino P., Vendittelli F. et al. Glucose-6-phos-phate dehydrogenase Buenos Aires: a novel de novo missense mutation associated with severe enzyme deficiency. Clin Bio-chem 2008; 41: 9: 742-745.

5. Эфендиев А.М., Мусаев М.А., Аскерова Т.А. Вторичное нарушение активности фермента глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы у больных с первичным метгемоглобином. Аллергол и иммунол 2006; 3: 7: 357. (Efendiyev A.M., Mu-sayev M.A., Askerova T.A. Secondary violation of glucose-6-phosphatdehidrogenase enzyme activity at patients with primary met-hemoglobin. Állergol i immunol 2006; 3: 7: 357.)

6. Гречанина Е.Я. Наследственные нарушения метаболизма. Медицинская газета «Здоров'я Украши» 2003; 80-84. (Grechanina E.Ya. Hereditary violations of a metabolism. Medical newspaper "Zdorov'ya Украши" 2003; 80-84.)

7. Мухтаров З.Я. Медико-генетические исследования, регистр наследственных заболеваний и генетический груз популяции Астаринского и Лерикского районов Азербайджанской Республики. Современные достижения медицины и практического здравоохранения в Азербайджане 2002; 1: 186-192. (Mukhtarov Z.Ya. Medical-genetic researches, the register of hereditary diseases and genetic freight of population of Astara and Lerik regions of Azerbaijan Republic. Sovremennye dostizheniya meditsiny i praktichesk-ogo zdravookhraneniya v Ázerbajdzhane 2002; 1: 186-192.)

8. Tikmani S.S., Warraich H.J., Abbasi F. et al. Incidence of neonatal hyperbilirubinemia: a population-based prospective study in Pakistan. Trop Med Int Health 2010; 15: 5: 502-507.

9. Minucci A., Moradkhani K., Hwang M.J. et al. Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) mutations database: Review of the "old" and update of the new mutations. Blood Cells Mol Dis 2012; 48: 154-165.

10. Beutler E. G6PD deficiency: a historical perspective. Blood 2008; 111: 16-24.

11. Glucose-6-phosphate dehydrogenase reagent set. Pointe Scientific, Inc., USA 2004.

12. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии, 5-е изд. София 1966; 389. (Todorov I. Clinical laboratory trials in pediatrics, the 5th ed. Sofia 1966; 389.)

13. Никитин Ю.П., Лисиченко О.В., Коробкова Е.Н. и др. Клинико-генеалогический метод в медицинской генетике. Новосибирск: Наука 1983; 101. (Nikitin Yu.P., Lisi-chenko O.V., Korobkov E.N. et al. The Clinical genealogical method in medical genetics. Novosibirsk: Nauka 1983; 101.)

14. Goldstein B., Giroir B., Randolph A. International pediatric sepsis consensus conference: definitions for sepsis and organ dysfunction in pediatrics. Pediat Crit Care Med 2005; 6: 1: 2-8.

15. PureLink Genomic DNA Mini Kit, User Guide, Document Part Number 25-1012.

16. NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer, V 1.0 User Manual, 2009, Thermo Fisher Scientific Inc.

17. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М: Практика 1999; 459. (Glants S. Medical biological statistics. M: Praktika 1999; 459.)

18. Al-Ali A.K., Al-Mustafa Z.H., Al-Madan M. et al. Molecular Characterization of Glucose-6-phosphate Dehydrogenase Deficiency in the Eastern Province of Saudi Arabia. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 814-816.

19. Al-Musawi B.M., Al-Allawi N., Abdul-Majeed B.A. et al. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydroge-nase deficient variants in Baghdad city — Iraq. BMC Blood Disord 2012: 12: 4.

Поступила 10.12.14

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.