CC BY
35
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 578.52 ГРНТИ 34.25.21
ДИАГНОСТИКА И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ТРАНСМИССИВНЫХ ПАТОГЕНОВ В ИКСОДОВЫХ КЛЕЩАХ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ И ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ
Ю.А. Панферова ООО «Надир»
Россия, 192102, г. Санкт-Петербург, наб. реки Волковки, 15
Ленинградская область и Санкт-Петербург являются территориями, эндемичными по клещевому энцефалиту и иксодовому клещевому боррелиозу. Иксодовые клещи, являющиеся основными переносчиками указанных заболеваний, могут также переносить и другие патогены, в частности Anaplasma sp., Ehrlichia sp., Rickettsia sp. и ряд других, что увеличивает риск микст-инфекции, усложняя диагностику и профилактику клещевых инфекций. В данной работе представлены результаты исследования клещей, снятых с людей на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области, на носительство ряда бактериальных инфекций и вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Исследована генетическая структура выявленных патогенов.
Ключевые слова: клещевые инфекции, распространенность, генотипы.
DIAGNOSTICS AND GENOTYPING OF VECTOR-BONE PATHOGENS OF IXODID TICKS IN SAINT-PETERSBURG AND LENINGRAD REGION
Yu.A. Panferova
OOO "Nadir"
Russia, 192102, St. Petersburg, nab reki Volkovki, 15
Leningrad region and St-Petersburg are known as endemic areas for tick-borne encephalitis and Lyme borreliosis. Ixodic ticks, which are the main vectors of mentioned diseases, can spread other pathogens, such as Anaplasma sp., Ehrlichia sp., Rickettsia sp. and other ones; it raises the risk of mixed infections and complicates tick-borne diseases diagnostics and their prevention. The article presents the detection results of some bacterial infections and tick-borne encephalitis virus in ticks, removed from the humans in St.Petersburg and Leningrad region. The authors analyse a genetic structure of identified pathogens.
Keywords: tick-borne infections, prevalence, genotypes.
Введение. Ленинградская область и ряд административных районов Санкт-Петербурга включены в перечень территорий, эндемичных по клещевым инфекциям, наиболее распространенными из которых являются вирусный клещевой энцефалит (ВКЭ) и клещевой борре-лиоз. Эпидемиологическое значение на указанных территориях имеют таежный клещ (I. persulcatus) и лесной клещ (I. ricinus) [4]. Как правило, в очагах ВКЭ на северо-западе Российской Федерации циркулируют европей-© Ю.А. Панферова, 2016
ский и сибирский подтипы вируса клещевого энцефалита [9]. Возбудители иксодового клещевого боррелиоза на данных территориях представлены видами Borrelia afzelii и B. garinii [7]. В настоящее время также установлена циркуляция иных патогенов в иксодо-вых клещах на территории России и сопредельных стран: Anaplasma sp., Ehrlichia sp., Coxiella sp., Rickettsia sp., Babesia sp. [5, 12]. Возможность инфицирования иксодовых клещей несколькими патогенами увеличивает
риск развития микст-инфекции у людей после укуса клеща и требует комплексного подхода к диагностике и профилактике клещевых инфекций.
Цель исследования - проведение индикации бактериальных патогенов (B. burgdorferi sensu lato complex, Coxiella burnetii, Rickettsia sp.) в клещах, снятых с людей, с использованием ПЦР и вируса клещевого энцефалита с использованием ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а также определение подтипа (для ВКЭ) и геномовида боррелий.
Материалы и методы исследования. Было исследовано 487 клещей рода Ixodes sp., снятых с людей в период с мая по сентябрь 2013 и 2014 гг. Во всех случаях присасывание клещей отмечали при нахождении на территории Ленинградской области и Санкт-Петер-бурга. Клещей индивидуально гомогенизировали в 100 мкл стерильного физиологического раствора. Выделение РНК и ДНК производилось с использованием набора «Амплипрайм Рибо-преп» (ООО «Интерлабсервис») согласно инструкции. Обратная транскрипция производилась с использованием наборов «Реверта L-100» (ООО «Интерлабсервис») или «Genpak RT Core» (ООО «Лаборатория Изоген») согласно инструкциям производителей. Выявление РНК ВКЭ производилось с использованием набора «Genpak DNA PCR test TBE» (ООО «Лаборатория Изоген»). Для определения ДНК B. burgdorferi sensu lato complex проводилась ПЦР с праймерами, фланкирующими фрагмент гена ospC, F: AAAGAATACATTAAGTGCGATATT и R: GGGCTTGTAAGCTCTTTAACT [10]. Для определения ДНК C. burnetii проводили ПЦР с оригинальными праймерами, фланкирующими фрагмент гена sod, F: ATGGCTTTTGAATTACCGGATT и R: AATCCCAATTGACCACTTGC. Для определения ДНК Rickettsia sp. проводили ПЦР с прайме-рами, фланкирующими фрагмент гена gltA, F: ATGGCTATTATGCTTGCGGC и R: CAGAACTACCGATTTCTTTAAGC [2]. Для определения генотипа ВКЭ проводилась ОТ-ПЦР с праймерами, фланкирующими регион 5' -NCR, Pp1 GCGTTTGCTTCGGACAGCATTAGC и Pml: GCGTCTTCGTTGCG GTCTCTTTCG [8], с последующим секвенированием полученных ампликонов в двух направлениях. Для определения геномовида боррелий проводилось секвенирование полученных ампликонов фрагмента гена ospC. Секвенирование прово-
дили с использованием набора реагентов «BigDye Terminator v3.1» согласно инструкции производителя на автоматическом анализаторе «MegaBace 1000» («GE Healthcare»).
Результаты. Было исследовано 487 особей клещей, снятых с людей, в том числе 275 особей в 2013 г. и 202 особи в 2014 г. Ви-русофорность клещей ВКЭ составила 1,08 %, присутствие ДНК B. burgdorferi sensu lato complex отмечено в 4,72 %. Данные по распространенности генетических маркеров исследованных патогенов по годам представлены в таблице 1. ДНК C. burnetii и Rickettsia sp. в исследованных образцах не выявлена. Микст-инфекция ВКЭ и боррелиями не обнаружена.
Таблица 1
Результаты исследования клещей на наличие РНК ВКЭ и ДНК боррелий
Количество клещей Всего 2013 г. 2014 г.
487 275 202
Обнаружена РНК ВКЭ 5 (1,08 %) 2 (0,73 %) 3 (1,48 %)
Обнаружена ДНК B. burgdorferi s.l. 23 (4,72 %) 13 (4,72 %) 10 (4,95 %)
По результатам секвенирования фрагментов 5' - NCR региона, все положительные в ОТ-ПЦР образцы содержали ВКЭ, относящийся к европейскому подтипу. Было отсеквени-ровано 16 фрагментов гена ospC боррелий, во всех случаях был выявлен геномовид B. afzelii.
Обсуждение. Вирусный клещевой энцефалит и иксодовый боррелиоз являются распространенными природно-очаговыми заболеваниями умеренных широт Северного полушария. Усиливающаяся антропогенная нагрузка на природные ландшафты и изменение климата обусловливают повышение риска укуса клещами и заражения вирусными и бактериальными инфекциями [1, 3]. Данная ситуация является актуальной и для северозападных регионов России [6]. Установлено наличие сочетанных природных очагов инфекций, переносимых клещами, на территории России. Помимо достаточно хорошо изученных патогенов (ВКЭ, возбудители иксодового боррелиоза), в них могут циркулировать другие микроорганизмы, вызывающие заболевания человека (эрлихии, анаплазмы, риккетсии) [5]. Структура бактериальных клещевых инфекций в северо-западных регионах России
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
к настоящему моменту остается недостаточно изученной. В данной работе дана оценка распространенности вирусных (ВКЭ) и бактериальных (B. burgdorferi s.l., Coxiella burnetii, Rickettsia sp.) патогенов в клещах, снятых с людей, на территории Ленинградской области и Санкт-Петербурга. Было установлено, что вирусофорность клещей ВКЭ за исследованный период варьирует в пределах 0,73-1,48 % (в среднем составляет 1,08 %). Обнаружена циркуляция европейского подтипа ВКЭ, хотя на данных территориях возможно обнаружение также и сибирского подтипа [9]. Возбудители иксодового клещевого боррелиоза обнаружены в 4,72 %, значительных различий по распространенности за период исследований не отмечено. Установлена циркуляция геномо-
вида В. afzelii в клещах, что свидетельствует об ассоциации инфицированных клещей с наземными прокормителями, в частности, мелкими млекопитающими. Стоит отметить, что выявленная распространенность боррелий в иксодовых клещах является относительно невысокой по сравнению с данными других исследователей [11]. Не была обнаружена микст-инфекция исследованных переносчиков боррелиями и ВКЭ. ДНК коксиелл и риккет-сий в клещах, снятых с людей, не была обнаружена; вероятно, данные патогены имеют меньшее значение в инфицировании населения на исследованных территориях, что не отрицает возможности их циркуляции в природных очагах и возможности передачи с укусом клеща.
Автор выражает благодарность ООО «Диагностика»» и ООО «Руссил-Центр» за финансовую поддержку и ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера за техническую помощь.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Конькова-Рейдман А.Б., Злобин В.И. Изучение геновидов боррелий в природных очагах и биологическом материале больных иксодовыми клещевыми боррелиозами в Южно-Уральском регионе России // Сибирский медицинский журнал. 2011. Т. 101, № 2. С. 24-26.
2. Ливанова Н.Н., Рар В.А., Ливанов С.Г., Иголкина Я.П. Разнообразие паразитарных систем с участием мелких млекопитающих и Ixodes persulcatus Schulze на Северном Урале // Сибирский экологический журнал. 2005. Т. 10, № 5. С. 1079-1084.
3. Нафеев А.А., Шемякина Г.Б. Социальная значимость клещевых инфекций в городе // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2009. № 15. С. 127-129.
4. Ракитин И.А., Мельцер А.В., Парков О.В., Чхинджерия И.Г., Богачкина С.И., Антыкова Л.П., Дацкевич А.М. Значение акарицидных обработок в профилактике природно-очаговых заболеваний -клещевого энцефалита и клещевого иксодового бор-релиоза в Санкт-Петербурге // Дезинфекционое дело. 2011. № 3. С. 3-6.
5. Рудакова С.А., Коломеец А.Н., Самойленко И.Е., Кузьминов А.М., Рудаков Н.В. Экспресс-индикация трансмиссивных патогенов как основа дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающимися иксодовыми клещами // Сибирский научный медицинский журнал. 2007. № 4 (126). С. 116-119.
6. Субботина Н.С., Доршакова Н.В., Петрова А.В. Эпидемиологическая характеристика клещевого энцефалита в Северо-Западном регионе России // Экология человека. 2007. № 7. С. 15-19.
7. Alekseev A.N., Dubinina H.V., Antykova L.P., Dzhivanyan T.I., Rijpkema S.G., Kruif N.V., Cinco M.
REFERENES
1. Kon'kova-Reydman A.B., Zlobin V.I. Izuchenie genovidov borreliy v prirodnyh ochagah i bio-logicheskom material bol'nyh iksodovymi kleschevymi borreliozami v Yuzhno-Ural'skom regione Rossii// Sibir-skiy meditsinskiy zhurnal. 2011. T. 101, № 2. S. 24-26.
2. Livanova N. N., Rar V.A., Livanov S.G., Ig-olkina Ya. P. Raznoobrazie perezitarnyh system s uchas-tiem melkih mlekopitayuschih i Ixodes persulcatus Schulze na Severnom Urale // Sibirskiy Ekologicheskiy Zhurnal. 2005. T. 10. №5. S. 1079-1084.
3. Nafeev A.A., Shemyakina G.B. Sotsial'naya znachimost' kleschevyh infektsiy v gorode// Dal'nevos-tochny zhurnal infektsionnoy patologii. 2009. № 15. S. 127-129.
4. Rakitin I.A., Mel'tser A.V., Parkov O.V., Chhindzheriya I.G., Bogachkina S.I., Antykova L.P., Datskevich A.M. Znachenie akaritsidnyh obrabotok v profilaktike prirodno-ochagovyh zabolevaniy -kleschevogo entsefalita i kleschevogo iksodovogo bor-relioza v Sankt-Peterburge // Dezinfektsionnoe delo. 2011. № 3. S. 3-6.
5. Rudakova S.A., Kolomeets A.N., Samoylenko I.E., Kuz'minov A.M., Rudakov N.V. Ekspress-indikatsiya transmissivnyh patogenov kak osnova differ-entsirovannogo podhoda k profilaktike infektsiy, peredayuschimisya iksodovymi kleschami // Sibirskiy nauchny meditsinskiy zhurnal. 2007. № 4 (126). S. 116-119.
6. Subbotina N.S., Dorshakova N.V. Petrova A.V. Epidemiologicheskaya harakteristika kleschevogo entsefalita v Severo-Zapadnom regione Rossii // Ekologiya cheloveka. 2007. № 7. S. 15-19.
7. Alekseev A.N., Dubinina H.V., Antykova L.P., Dzhivanyan T.I., Rijpkema S.G., Kruif N.V., Cinco M. Tick-borne borrelioses pathogen identification in Ixodes
Tick-borne borrelioses pathogen identification in Ixodes ticks (Acarina, Ixodidae) collected in St. Petersburg and Kaliningrad Baltic regions of Russia // J Med Entomol. 1998. V. 35, № 2. P. 136-42.
8. Bormane A., Zeltina A., Lucenko I., Mavcutko V., Duks A., Pujate E., Ranka R., Baumanis V. Tickborne encephalitis - pathogen, vectors and epidemiological situation in Latvia 2002-2003 // Acta Universitatis Latviensis. 2004. V. 676. P. 27-37.
9. Jaaskelainen AE, Sironen T, Murueva GB, Subbotina N, Alekseev AN, Castran J, Alitalo I, Vaheri A, Vapalahti O. Tick-borne encephalitis virus in ticks in Finland, Russian Karelia and Buryatia // J Gen Virol. 2010. V. 91, № 11. P. 2706-12.
10. Kim C., Yi Y., Yu D., Llee M., Ccho M., De-sai A., Shringi S., Klein T., Kim H., Song J., Baek L., Chong S., O'Guinn M., Lee J., Lee I., Park J., Foley J., Chae J. Tick-borne rickettsial pathogens in ticks and small mammals in Korea // Appl Envir Microbiol. 2006. V. 72, № 9. P. 5766-5776.
11. Korenberg E., Kovalevskii Y., Levin M., Shchyogoleva T. The prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes persulcatus and I. ricinus ticks in the zone of their sympatry // Foplia Parasitologica. 2001. V. 48. P. 63-68.
12. Reye A.L., Stegniy V., Mishaeva N.P., Velhin S., Hübschen J.M., Ignatyev G., Muller C.P. Prevalence of tick-borne pathogens in Ixodes ricinus and Dermacentor reticulatus ticks from different geographical locations in Belarus // PLoS One. 2013. V. 8. P. e54476.
ticks (Acarina, Ixodidae) collected in St. Petersburg and Kali-ningrad Baltic regions of Russia // J Med Entomol. 1998. V. 35, № 2. P. 136-42.
8. Bormane A., Zeltina A., Lucenko I., Mavcutko V., Duks A., Pujate E., Ranka R., Baumanis V. Tickborne encephalitis - pathogen, vectors and epidemiologi-cal situa-tion in Latvia 2002-2003 // Acta Universitatis Latviensis. 2004. V. 676. P. 27-37.
9. Jaaskelainen A.E., Sironen T., Murueva G.B., Sub-botina N., Alekseev A.N., Castran J., Alitalo I., Vaheri A., Vapalahti O. Tick-borne encephalitis virus in ticks in Fin-land, Russian Karelia and Buryatia // J Gen Virol. 2010. V. 91, № 11. P. 2706-12.
10. Kim C., Yi Y., Yu D., Llee M., Ccho M., De-sai A., Shringi S., Klein T., Kim H., Song J., Baek L., Chong S., O'Guinn M., Lee J., Lee I., Park J., Foley J., Chae J. Tick-borne rickettsial pathogens in ticks and small mammals in Korea // Appl Envir Microbiol. 2006. V. 72, № 9. P. 5766-5776.
11. Korenberg E., Kovalevskii Y., Levin M., Shchyogoleva T. The prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes persulcatus and I. ricinus ticks in the zone of their sympatry // Foplia Parasitologica. 2001. V. 48. P. 63-68.
12. Reye A.L., Stegniy V., Mishaeva N.P., Velhin S., Hüb-schen J.M., Ignatyev G., Muller CP. Prevalence of tick-borne pathogens in Ixodes ricinus and Dermacentor reticulatus ticks from different geographical locations in Belarus // PLoS One. 2013. V. 8. P. e54476.
Панферова Юлия Александровна - медицин- Panferova Yulia Aleksandrovna - Medical Ad-
ский советник ООО «Надир», г. Санкт-Петербург; viser at OOO "Nadir", St. Petersburg; e-mail: e-mail: ersvart@inbox.ru ersvart@inbox.ru
УДК 578.52 ГРНТИ 34.25.21
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВИРУСА КЕМЕРОВО
М.В. Сафонова1, В.Г. Дедков1'2, А.П. Гмыль3, Г.Г. Карганова3,А.С. Сперанская1, А.Д. Неверов1, Г.Г. Федонин1, А.В. Валдохина1, Е.В. Пимкина1, М.Л. Маркелов2, Г.А. Шипулин1
1 Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора Россия, 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а
2 ФГБНУ «НИИМедицины труда» Россия, г. Москва, Проспект Буденного, 31
3 ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» Россия, 142782, г. Москва, поселение Московский поселок Института полиомиелита
© М.В. Сафонова, В.Г. Дедков, А.П. Гмыль, Г.Г. Карганова, А.С. Сперанская, А.Д. Неверов, Г.Г. Федонин, А.В. Валдохина, Е.В. Пимкина, М.Л. Маркелов, Г.А. Шипулин, 2016
