CC BY
117
© О. В. Малышева 1 2, ДИАгНОСТИКА хРОМОСОМНых
А. Н. Баранов1, А. А. Пендина 1 2, НАРушЕНИй МЕТОДОМ гИБРИДИзАцИИ
Е. С. шабанова 1, В. С. баранов 1 НА МИКРОМАТРИцАх
1 ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург;
2 Санкт-Петербургское ГКУЗ «Диагностический центр (медико-генетический)»
УДК: 575
■ Метод сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах — современный высокоэффективный подход, позволяющий осуществлять полногеномное сканирование хромосомного дисбаласа.
В статье описаны возможности метода и приведены примеры диагностики наследственной патологии с его использованием.
■ Ключевые слова: сравнительная геномная гибридизация; микроцитогенетические синдромы; хромосомные перестройки; множественные врожденные пороки развития.
Введение
Метод сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах (array CGH) позволяет с высокой эффективностью выявлять различные виды хромосомного дисбаланса. При этом с одинаковой эффективностью обнаруживаются как численные аномалии кариотипа (исключая полиплоидии) и крупные структурные перестройки хромосом, выявляемые при стандартном кариотипировании, так и микроделеции и микродупликации, затрагивающие лишь отдельные сегменты хромосом [3, 8].
До недавнего времени для диагностики аномалий кариоти-па использовались преимущественно кариотипирование и метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Стандартное кариотипирование с использованием дифференциальной окраски хромосом позволяет идентифицировать многие хромосомные аномалии, но его разрешающая способность недостаточна для того, чтобы идентифицировать перестройки размером менее 4 миллионов п. о. Метод FISH обладает гораздо более высокой чувствительностью, но нацелен на исследование заранее выбранных локусов и не подходит для комплексного сканирования всего генома. Сравнительная геномная гибридизация, называемая иногда «молекулярным кариотипирова-нием», в значительной степени расширила диагностические возможности при проведении медико-генетического консультирования, а также в значительной степени изменила наши представления о генетической природе таких патологий, как задержка психомоторного развития, умственная отсталость, множественные врожденные пороки развития, аутизм [1, 7].
Для проведения сравнительной геномной гибридизации используют микроматрицу, в ячейках которой иммобилизованы ДНК-зонды. Ячейки строго упорядочены, про каждую из них известно, какой именно зонд в ней находится, и какому участку генома он соответствует. В качестве зондов могут выступать клонированные в бактериальных искусственных хромосомах фрагменты ДНК человека (чипы на основе BAC — bacterial artificial chromosome) или синтетические олигонуклеотиды (олигочипы). При постановке эксперимента используют две пробы ДНК — опытная (ДНК пациента) и контрольная (ДНК здорового индивидуума). Опытный и контрольный образцы ДНК метят разными флуоресцентными красителями (например, Су5 и Су3 соответственно), затем смешивают и проводят гибридизацию смеси меченых ДНК с зондами на микроматрице. Результаты гибридизации оценивают с помощью сканера, снимающего количественные показатели флуоресценции для каждой ячейки микроматрицы по двум каналам (длина волны
532 и 635 нм). В том случае, если в опытном образце имеется делеция какого-либо фрагмента ДНК, мы будем наблюдать преимущественную флуоресценцию Су5 (сигнал от контрольной ДНК) в соответствующих ячейках. Если, напротив, в тестовом образце имеется дупликация какого-либо участка, в определенных ячейках мы сможем зарегистрировать преимущественно сигнал флуорофора Су3. С помощью программного обеспечения производится математическая обработка полученных данных, по результатам которой может быть построен виртуальный кариотип — цифровой аналог реального кариотипа, содержащий информацию о возможных делециях и дупликациях генетического материала. Разрешающая способность молекулярного кариотипирования зависит от типа используемого чипа и может достигать 200 п. о. при использовании олигочипов высокого разрешения [6, 8].
В данной статье описаны результаты, полученные при использовании ВАС-чипов СуюСЫр 3.0 и 4.0 и программы OneQickCGH производства компании РегктЕ1тег.
Применение метода eCGH для диагностики хромосомных аномалий
1. Идентификация маркерной хромосомы и природы добавочного генетического материала, выявляемого при стандартном карио-типировании на какой-либо хромосоме, может быть довольно затруднительной. Стандартным методом уточняющей диагностики в такой ситуации является FISH, но для ее проведения может понадобиться большое число раундов гибридизации или работа с многоцветными цельнохро-мосомными зондами. Метод сравнительной геномной гибридизации позволяет легко решить эту проблему, при этом могут быть получены дополнительные сведения о характере хромосомной перестройки.
На рисунке 1 приведены результаты анализа методом aCGH у двух пациентов с выявленными ранее аномалиями кариотипа. У пациента К. при кариотипировании был обнаружен добавочный материал неизвестного происхождения на хромосоме 13; сравнительная геномная гибридиза-
б
Рис. 1. Результаты аСОН: а) пациент К., дополнительный материал на хромосоме 13. Хромосома 13, чип СуйзСЫр 3.0. Кариотип 46,ХY,dup(13)(q14.11-q34); б) пациентка Е., дополнительный материал на хромосоме 8. Хромосома 8, чип СуйзСЫр 3.0; розовым цветом выделена область делеции, зеленым — дупликации. Кариотип 46,ХХ^е1(8)(р23.2р23.3^ир(8)(рП.21р22)
а
ция позволила идентифицировать присутствие в геноме дополнительной копии участка длинного плеча q14.11-q34 хромосомы 13 (рис. 1 а). У пациентки Е. был выявлен дополнительный материал на хромосоме 8. При проведении анализа методом aCGH была выявлена сложная хромосомная перестройка. Установлена крупная интерстициальная дупликация участка короткого плеча р11.23-р24 в сочетании с концевой делецией участка р23.2-23.3 короткого плеча хромосомы 8 (рис. 1 б).
2. Уточнение границ хромосомных перестроек, выявленных при стандартном кариоти-пировании.
На рисунке 2 представлены стандартный и виртуальный кариотипы пациентки М., проходившей обследование по поводу вторичного бесплодия и планирования беременности с применением вспомогательных репродуктивных технологий. При кариотипировании была выявлена делеция
двух сегментов длинного плеча хромосомы Х, либо Xq23q24, либо Xq25q26. Сравнительная геномная гибридизация позволила уточнить границы делеции длинного плеча q25q26.3 хромосомы Х и правильно подобрать зонды для проведения преимплантационной диагностики методом FISH.
3. Выявление несбалансированных хромосомных перестроек.
Одной из сложнейших проблем при медико-генетическом консультировании является решение вопроса о сбалансированости хромосомных перестроек. В отдельных случаях разрешающая способность стандартного кариотипирования недостаточна для того, чтобы выявить возможный хромосомный дисбаланс. Для решения этой задачи можно использовать диагностику методом FISH, однако в этом случае практически каждый пациент нуждается в индивидуальном подборе нескольких зондов, которые позволяют марки-
к ;
1 I ■ #
б
Рис. 2. Результаты кариотипирования и аСОН : а) кариограмма из ФГА-стимулированного лимфоцита пациентки с кариоти-пом 46,ХХ, del(X)(q25q26). Стрелкой указана хромосома Х с интерстициальной делецией сегмента q25q26 длинного плеча, метафазные хромосомы окрашены с помощью Хехст 33258 с контрастированием актиномицином D; б) результаты аСОН, Чип СйоСЫр 3.0. Розовым цветом выделена область делеции хромосомы Х
а
Ratio Plot
Ml llllll Hill till In 1 III lllltlll 1 II 1 J... r 1..................... I i Ii 1 ■ llllllillllHill III ниши I------------ш..........11 nil T i 1 и i-l- 1 1 • .. J
« " - ■« ' " ■
•« , n ■ ■« j ' j ■ .. . . ■ i • * • ^ . ■ „,*,.•.........r................ гк r. • ; .v . ■ *.....■
■ ■
Im H| '
1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 -2,0
ГI г.
гч гч
Chromosome: X
а
б
Рис. 3. а) результаты aCGH, Чип CitoChip 4.0. Розовым цветом выделена область делеции хромосомы Х, кариотип пациентки 46,X,t(X;7)(q21;q10)del(X)(q21.31 q21.31); б) результаты флуоресцентной гибридизации in situ с цельнохромосомным зондом к хромосоме Х
ровать точки разрыва. Подобная диагностика весьма трудоемка и может не дать необходимой информации. Метод сравнительной геномной гибридизации в этом случае оказывается оптимальным — он позволяет выявить любой существующий хромосомный дисбаланс в пределах разрешающей способности микроматрицы.
Пример такой диагностики приведен на рисунке 3. У пациентки Р. была выявлена неуна-следованная транслокация 46,ХДХ;7)^21; q10), по данным кариотипирования — сбалансированная. Однако у пациентки наблюдались низкий рост, множественные кисты внутренних органов и ряд микроаномалий, что заставляло усомниться в сбалансированности кариотипа. При проведении сравнительной геномной гибридизации была выявлена делеция подсегмен-та q21.31 хромосомы Х размером 3,5 млн п. о. и не было выявлено изменений копийности по-
следовательности хромосомы 7. Таким образом, была установлена частичная моносомия по под-сегменту q21.31 хромосомы Х, расположенному в точке разрыва.
4. Микроаномалии хромосом при МВПР и нормальном кариотипе.
Сравнительно недавно была выделена новая группа наследственной патологии — микроци-тогенетические синдромы, связанные с небольшими делециями и дупликациями отдельных сегментов хромосом. Во многих случаях их клиническая диагностика не вызывает сомнений, а способом подтверждающей диагностики является FISH. Однако в ряде случаев (например, при ранней диагностике) клиническая картина заболевания может быть не типична, а индивидуальные фенотипические особенности пациента могут затруднять диагностику. Кроме того, к МВПР и врожденной патологии могут приво-
2,0 1,5 1,0 0,5
о
л 0,0
а:
-0,5 -1,0 -1,5 -2,0
Рис. 4. Результаты аСОН, Чип СйоСЫр 3.0. Красным цветом выделена область делеции длинного плеча хромосомы 7
Ratio Plot
.......'"■iffifii^'fiíi'íf t—^pmfT^rawwiwwFíw
II i| I I : i I • I II I I ¡i I Г i I I I ! I ( I I 'III
l ^ '.....Ш.........I.....U * 1 ........
"14444'
I ill
I I III II I
-i—t-
IIB ■
(») t- П <N m « m CJ -
N fi Í- f iritri ^ n D H ГЧ ч- г- ч-
Г, Г, Г1 r- rr, VT CJ
Ы C4 »- ^ Í4 " " " «j Ш
i-*- 1-ч-ГМ t-í í») P5 ч- í*)
— — (N
Chromosome: 7
дить не только сравнительно распространенные аномалии, но и редкие и уникальные микроперестройки, не идентифицируемые при стандартном кариотипировании.
На рисунке 4 представлены результаты аСОН анализа пациентки К. в возрасте 1 месяца. У девочки отмечалась задержка внутриутробного развития, порок сердца, задержка психомоторного развития, дизморфичный фенотип, что не формировало клиническую картину, специфичную для какого-либо известного наследственного синдрома. При проведении анализа была выявлена делеция сегмента q11.23 хромосомы 7 размером 1,1 млн п. о., что позволило установить диагноз синдрома Вильямса. Дальнейшее наблюдение за пациенткой, действительно, позволило увидеть формирование типичной картины данного микро-делеционного синдрома.
заключение
Метод сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах позволяет обнаружить большинство несбалансированных хромосомных аномалий, таких как численные хромосомные аномалии, делеции и дупликации участков хромосом размером от 200 п. н. (при использовании олигонуклеотидных микроматриц) и от 0,5 млн п. н. (при использовании чипов на основе ВАС). Возможно выявление мозаичных анеуплоидий, если доля аномального клона не ниже 10 % [2]. При проведении аСОН невозможно установление сбалансированных хромосомных перестроек (инверсий и транслокаций, в т. ч. робертсоновских), полиплоидии, одно-родительской дисомии (ОРД) и точковых генных мутаций. Применение олигонуклеотидных микроматриц, которые позволяют тестировать SNP и одновременно проводить сравнительную геномную гибридизацию дает возможность рас-
ширить диагностические возможности метода aCGH и выявлять полиплоидию, ОРД и мажорные генные мутации.
В постнатальной диагностике причин МВПР, умственной отсталости, ЗПМР, расстройств аути-ческого спектра сравнительная геномная гибридизация является наиболее информативным методом, позволяющим выявить причину патологии в 15-20 % случаев [1, 3, 4]. Метод aCGH начинает все шире применяться при преимплантационном генетическом скрининге на клетках трофэктодер-мы, заметно повышая эффективность ЭКО [5]. Метод aCGH также применяется при проведении пренатальной диагностики, однако его повсеместное внедрение ограничивают трудности интерпретации полученных данных и достаточно высокая стоимость микрочипов.
Применение метода aCGH может быть исключительно полезным при проведении медико-генетического консультирования для уточнения диагноза и выявления причин заболевания. Этот подход имеет намного более высокую разрешающую способность, чем стандартное кариотипирование, и гораздо более универсален, чем диагностика методом FISH. Применение его ограничено высокой стоимостью оборудования и расходных материалов, Однако во многих случаях только aCGH может дать информацию о причинах заболевания и сделать возможной эффективную пренатальную диагностику.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (13-04-01978-a).
литература
1. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals — results from four years' clinical application for over 8.700 patients / Ahn J. W. [et al.] //Molecular Cytogenetics. — 2013. — Vol. 6, N 1. — P. 16.
2. Comparative genomic hybridization on microarray (a-CGH) in constitutional and acquired mosaicism may detect as low as 8 % abnormal cells / Valli R. [et al.] // Molecular Cytogenetics. — 2011. — Vol. 4. — P. 4-13.
3. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies / Miller D. T. [et al.] //Am. J. Hum. Genetics. — 2010. — Vol. 86, N 5. — P.749-764.
4. EdelmannL., HirschhornK. Clinical utility of array CGH for the detection of chromosomal imbalances associated with mental retardation and multiple congenital anomalies // Annales New York Acad. Sci. — 2009. — Vol. 1151. — P. 157-166.
5. Genetic analysis of human embryos by metaphase comparative genomic hybridization (mCGH) improves efficiency of IVF by increasing embryo implantation rate and reducing multiple pregnancies and spontaneous miscarriages / Sher G. [et al.] // Fertil. Steril. — 2009. — Vol. 92, N 6. — P. 1886-1894.
6. KerenB., Le Caignec C. Oligonucleotide microarrays in constitutional genetic diagnosis // Expert Revue Mol. Diagn. — 2011 — Vol. 11, N 5. — P. 521-532.
7. Molecular karyotyping by array CGH in a Russian cohort of children with intellectual disability, autism, epilepsy and congenital anomalies / lourov I. Y. [et al.] // Molecular Cytogenetics. — 2012. — Vol. 5, N 1. — P. 46.
8. ShinawiM., Cheung S. W. The array CGH and its clinical applications // Drug Discovery Today. — 2008. — Vol.13(17-18). — P. 760-770.
Статья представлена Э. К. Айламазяном, ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург
DIAGNOSTICS OF CHROMOSOMAL ABBERATIONS BY ARRAYCGH
Malysheva O. V., Baranov А. N., Pendina А. А., Shabanova Е. S, Baranov V. S.
■ Summary: aCGH is a modern and highly efficient approach for full-genomic scanning of wide spectrum of chromosomal disbalance. Here, we discuss diagnostic capabilities of aCGH and give examples of diagnostic cases.
■ Key words: comparative genomic hybridization; chromosomal aberrations; microdeletion syndrome; multiple congenital anomalies.
■ Адреса авторов для переписки-
Малышева Ольга Викторовна — к. б. н., врач-лабораторный генетик. Санкт-Петербургское ГКУЗ «Диагностический центр (медико-генетический)». 194944, Россия, Санкт-Петербург, Тобольская ул., д. 5. E-mail: omal99@mail.ru.
Баранов Александр Николаевич — к. б. н., старший научный сотрудник. ФБГУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН. 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: alexbar@mail.ru.
Пендина Анна Андреевна — к. б. н., врач-лабораторный генетик. Санкт-Петербургское ГКУЗ «Диагностический центр (медико-генетический)». 194944, Россия, Санкт-Петербург, Тобольская ул., д. 5. E-mail: pendina@mail.ru.
Шабанова Елена Сергеевна — врач-генетик. ФБГУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН. 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: le_shaja@mail.ru.
Баранов Владислав Сергеевич — д. м. н., з. д. н., профессор, член-корр. РАМН. Заведующий лабораторией пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека. ФБГУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН. 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: baranov@VB2475.spb.edu.
Malysheva Olga Viktorovna — geneticist, PhD. City Diagnostic center of medical genetics. 194944, St. Petersburg, Tobolskaya St., 5, Russia. E-mail: omal99@mail.ru.
Baranov Aleksandr Nikolayevich — senior researcher, PhD. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. 199034, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3, Russia. E-mail: alexbar@mail.ru.
Pendina Anna Andreyevna — cytogenetics, PhD. City Diagnostic center of medical genetics. 194944, St. Petersburg, Tobolskaya St., 5, Russia. E-mail: pendina@mail.ru.
Shabanova Yelena Sergeyevna — regular doctor geneticist. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. 199034, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3, Russia. E-mail: le_shaja@mail.ru.
Baranov Vladislav Sergeyevich — PhD, professor. Head of laboratory for Prenatal Diagnosis. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. 199034, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3, Russia. E-mail: baranov@VB2475.spb.edu.
