CC BY
53
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Використання екамуліну - активатору протромбіну із отрути ефи багатолускової - в клінічній лабораторній діагностиці / Д.С. Корольова, Р.П. Виноградова, Т.М. Чернишенко, Т.М. Платонова // Лабораторна діагностика. - 2006. - Т. 37, №3 - С. 18-22.
2. Заічко Н.В. Асоціація середнього об’єму тромбоцитів з рівнем гомоцистеїну та гідроген сульфіду в крові щурів з гіпергомоцистеїнемією // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 2. - С. 54-58.
3. Заічко Н. В. Вплив тіолактону гомоцистеїну, цистеїну та гідроген сульфіду на систему гемостазу кролів // Медична хімія. - 2009.- Т.11, №2.- С. 51-56.
4. Мевх А.Т., Басевич В.В., Варфоломеев С.Д. Изучение эндопероксидпростагландинсинтетезы мик-росомной фракции тромбоцитов человека // Биохимия. - 1982. - Т.47, №10. - С.1635-1639.
5. Патогенетичні аспекти гіпергомоцистеїнемії
та перспективи створення лікарських засобів для лікування патології, асоційованої з порушеннями обміну гомоцистеїну / О.О. Пентюк, М. Б. Луцюк, Н. В. Заічко [та ін.] // Biomedical Biosocial Anthropology. -2008. - N10. - С.297-303.
6. Blood glutathione and cysteine changes in cardiovascular disease / B. J. Mills, M. M. Weiss, C. A. Lang [et al.] // J. Lab. Clin. Med. - 2000. - Vol.135, N5.- Р.396-401.
7. Lowicka E. Hydrogen sulfide (H2S) - the third gas of interest for pharmacologists / E. Lowicka, J. Beltowski // Pharmacol. Rep. - 2007. - Vol.59, N1. - Р.4-24.
8. The role of cysteine and homocysteine in venous and arterial thrombotic disease / R. Marcucci, T. Brunelli, B. Giusti [et al.] // Am. J. Clin. Pathol. - 2001. - Vol.116, N1. - Р.56-60.
♦
УДК 616.419:616.155.392-07-036.1:66.095.12:577.112
І.В. Машейко, О. З. Бразалук
ДІАГНОСТИЧНА ЦІННІСТЬ ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ ТА ФУКОЗИЛЬОВАНОСТІ АЛЬФА-1-КИСЛОГО ГЛІКОПРОТЕЇНУ ПРИ ХРОНІЧНИХ МІЄЛОЛЕЙКОЗАХ
Дніпропетровська державна медична академія кафедра біохімії, медичної та фармацевтичної хімії (зав. - д. біол. н., проф. О.З. Бразалук)
Ключові слова: а}-кислий глікопротеїн, фукозильованість, еритремія, хронічний мієлоїдний лейкоз, сублейкемічний мієлоз, лектин-ферментний аналіз Key words: aracid glycoprotein, fucosylation, erythremia, myeloma, subleukemic myelosis, lectin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Резюме. Проведено исследование содержания и степени афинности фукозоспецифических лектинов AAL, LCA и LABA к углеводным детерминантам ai-кислого гликопротеина плазмы крови при хронических миелолейкозах (эритремия, миеломная болезнь и сублейкемический мие-лоз). Установлено, что при эритремии и миеломной болезни происходит достоверное снижение концентрации и степени фукозилированности АГП по сравнению с нормой за счёт коровой и терминальной фукозы, а при сублейкемическом миелозе, напротив, наблюдается увеличение содержания терминальной фукозы, что может свидетельствовать о постепенной миелоидной метаплазии костного мозга и паренхиматозных органов.
Summary. The plasma concentration and the degree of affinity of a1-acid glycoprotein to fucose-specific lectins AAL, LCA and LABA in proliferative blood diseases (erythremia, myeloma and subleukemic myelosis) were investigated. It was established that in erythremia and myeloma disease a reliable decrease ofplasma level and fucosylation of a1-acid as compared to norm due to core and terminal fucose content takes place, and by contrast, in subleukemic myelosis increase of terminal fucose content occurs; it may testify to a gradual myeloid metaplasia of the bone marrow and parenchymal organs.
Білок гострої фази аі-кислий глікопротеїн кулярною масою від 35-37 кБа до 41-43 кБа, що
(АГП, орозомукоїд) є одним із найбільш гете- залежить від структури вуглеводного компо-
рогенних глікопротеїнів плазми крові з моле- ненту та місця синтезу [5,9]. Єдиний поліпеп-
зв'язками (CYS5—CYS147
тидний ланцюг АГП складається із 183 амінокислот та стабілізований двома дисульфідними між залишками цистеїну та CYS72—CYS164) [14].
Структурно-функціональною особливістю АГП є значний ступінь глікозильованості — п’ять N гліканів комплексного типу, що приєднані до залишків аспарагіну та складають 41-45% від загальної молекулярної маси [9]. АГП властивий від’ємний заряд (рІ=2,8-3,8), зумовлений значним вмістом сіалових кислот (-12%) [5,15]. У крові орозомукоїд присутній у вигляді декількох молекулярних форм, ідентичних за первинною послідовністю поліпептидного ланцюга, але різних за складом вуглеводних радикалів і, відповідно, за біологічною активністю [4].
АГП синтезується переважно у печінці, в осередках пухлинного росту [11], а також мієлоцитами та поліморфноядерними нейтрофілами [10]. Посттрансляційні модифікації вуглеводної частини залежать від місця синтезу та характеру патологічного процесу і зумовлюють гетерогенність глікозилювання АГП. Так, орозомукоїд, що секретується активованими нейтрофілами, має більшу молекулярну масу за рахунок підвищення фукозильованості гліканів та наявності полілактозамінних залишків [13]. У нормі вуглеводні детермінанти АГП містять бі-, три- та тетраантенні К-глікани. При новоутвореннях відбувається підвищення експресії 1,4- та 1,6-розгалужених три- та тетраантенних структур [8].
Таким чином, концентрація і співвідношення глікоформ АГП, що циркулюють у крові, залежить від джерел його синтезу та у певній мірі відображає характер патологічного процесу.
Метою даної роботи було дослідження змін
концентрації та фукозильованості а1-кислого глікопротеїну при хронічних мієлолейкозах (еритремія, хронічний мієлоїдний лейкоз та суб-лейкемічний мієлоз).
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Загалом обстежено 27 хворих із хронічними мієлолейкозами. Клінічне обстеження пацієнтів проводили у відповідності до стандартів медичної допомоги в умовах спеціалізованого стаціонару — гематологічного відділення комунального закладу "Міська багатопрофільна клінічна лікарня №4", м. Дніпропетровськ. Обстежені хворі були розподілені на такі групи: 1 -
поліцитемія (еритремія) (n=16), 2 - хронічний мієлоїдний лейкоз (мієломна хвороба) (n=14), 3 -сублейкемічний мієлоз (n=18). До групи контролю ввійшли 22 здорові донори (група 4).
Концентрацію АГП визначали методом іму-нодоту з використанням поліклональних специфічних антитіл (Lifespan Bioscience, USA) та подальшою обробкою отриманих даних за допомогою програми GelProAnalyser.0.32. Характер фукозильованості вуглеводних детермінант АГП досліджували лектин-ферментним аналізом, використовуючи фукозоспецифічні лектини (табл.): алеврії оранжевої (Aleuria aurantia lectin, AAL), сочевиці (Lens culinaris agglutinin, LCA) та кори золотого дощу (Laburnum anagyroides bark agglutinin, LABA), що були кон'юговані з пе-роксидазою хрону в нашій лабораторії за методикою Nakane у модифікації Луцика [2]. Ступінь взаємодії фукозоспецифічних лектинів з вуглеводними детермінантами АГП оцінювали як відсоток зв'язування відповідного лектину відносно норми у перерахунку на концентрацію даного глікопротеїну.
Характеристика фукозоспецифічних лектинів AAL, LCA та LABA (за Антонюк В.О. [1])
Назва лектина Моносахаридна специфічність Олігосахаридна специфічність
Лектин насіння сочевиці (Lens culinaris agglutinin, LCA) L-фукоза (a^6) триманозид Man(ai^3)-Man(ßi^4)- Мап(аЬ6) Gal(ßi^4)-GlcNAc(ßi^2)-Man(ai^3) Fuc(a^6) Man(ß^4)- GlcNAc (ßw)-GlcNAc-R Gal(ß^4)-GlcNAc(ß^2)-Man(a^6)
Лектин алеврії оранжевої (Aleuria aurantia lectin, AAL ) L-фукоза (а^з) L-фукоза (аі^6) Gal(ßi^4)-Fuc(ai^3)-Gal(ßi^4)-Glc GlcNAc(ß^4)-Fuc(a^6)-GlcNAc
Лектин кори золотого дощу (Laburnum anagyroides bark agglutinin, LABA ) термінальні залишки L-фукози (а^2) Fucia^aKß^lcNAcfßw) Gal(ß^)-GalNAc-R / Fuc(aw)-Gal(ßM)-GlcNAc(ßM)
Всі обстежені давали письмову інформовану згоду на участь у дослідженні. Статистична обробка даних виконана за допомогою пакета програм "Статистика 6.0”. Достовірність відмінностей оцінювали за ^критерієм Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ При мієломній хворобі та еритремії було встановлено достовірне зниження концентрації АГП плазми крові у порівнянні з нормою. Навпаки, при сублейкемічному мієлозі концентрація АГП перебуває у межах норми (рис.1.).
Ступінь взаємодії фукозоспецифічних лекти-нів з N-гліканами АГП залежав від типу патології та афінності відповідного лектину. Так, при сублейкемічному мієлозі ступінь взаємодії з AAL практично не змінювався, але знижувався при еритремії та мієломній хворобі на 22,19% та 28,97% відповідно. Також для сублейкемічного мієлозу характерним було посилення взаємодії з фукозоспецифічними лектинами LCA та LABA (на 19,09% та 15,03%) порівняно з нормою.
1,00
норма еритремія мієломна хвороба сублейкемічний мієлоз
Рис. 1. Концентрація АГП у плазмі крові при хронічних мієлолейкозах
Дещо інша картина спостерігалась у першій та другій групах. Так, у хворих на еритремію ступінь взаємодії з LCA та LABA знижувався на 21,51% та 27,92%, при мієломній хворобі — знижувався на 25,85% та 29,73% відповідно (рис.
2.).
Таким чином, при еритремії та мієломній хворобі профілі фукозильованості за лектинами AAL, LCA та LABA подібні.
Молекула АГП містить п’ять сайтів приєднання N-гліканів комплексного типу, що становлять до 45% від загальної молекулярної маси й зумовлюють його біологічну активність. Відомо, що характер глікозильованості а1-кислого глікопротеїну залежить від видової приналежності, місця синтезу та фізіологічного стану організму.
Для дослідження ступеня фукозильованості АГП при мієлопроліферативних захворюваннях крові було обрано найбільш інформативні фукозоспецифічні лектини: AAL, LCA та LABA.
Згідно з отриманими даними, можна зробити висновок, що при еритремії та мієломній хворобі вміст та ступінь фукозильованості АГП значно знижується, що є характерним для даної патології.
Порівнюючи ступінь зв’язування АГП з лектинами LCA та AAL, ми виявили, що лектин сочевиці мав більшу афінність до АГП. Це явище можна пояснити тим, що лектин сочевиці має два сайти зв’язування з N-гліканами — з коровим триманозидом та з коровою а^6 фукозою [12], а лектин алеврії оранжевої має специфічність тільки до фукози в положенні а1^6 та а1^3. Згідно
з літературними джерелами (Matsumura K., пов’язане із підвищенням активності фукозил-
2007), збільшення вмісту корової а^6 фукози трансферази VIII при малігнізації [7].
Рис. 2. Ступінь взаємодії АГП з фукозоспецифічними лектинами при хронічних мієлолейкозах
Примітка: ***р<0,001 **р<0,01 *р<0,05 - достовірна різниця у порівнянні з показниками контрольної групи
Дослідженнями взаємодії LABA, який специфічно реагує з термінальною а^2 фукозою, було виявлено зниження ступеня зв’язування даного лектину з АГП при еритремії та мієломній хворобі й підвищення при сублейкемічному мієлозі. Виходячи з цього, є підстави стверджувати про зміну активності відповідної фуко-зилтрансферази при хронічних мієлолейкозах. Слід зазначити, що поява у складі вуглеводних детермінант Н- та Льюіс антигенів (Leb та Ley), які містять термінальну а^2 фукозу, свідчить про несприятливий клінічний прогноз при онкопа-тології [6].
Зважаючи на специфічність використаних лектинів (таб. 1), для встановлення характеру фукозильованості АГП найбільш інформативним є аналіз його взаємодії з AAL та LABA. Так, при еритремії та мієломній хворобі рівень термінальної, а1^6, а1^з та корової фукози N-гліканів АГП знижується. Навпаки, при сублейкемічному мієлозі вміст термінальної та корової фукози збільшується, а рівень фукози, розташованої у положенні а1^6 та а1^3, знаходиться в межах
норми.
Еритремія та мієломна хвороба
доброякісні
пухлини крові з тривалим перебігом. На відміну від них, сублейкемічний мієлоз відноситься до лейкозів, що характеризуються підвищеною поліморфно-клітинною мієлопроліферацією за типом панмієлозу, який супроводжується прогресуючим мієлофіброзом та остеомієлосклерозом з мієлоїдною метаплазією кісткового мозку та паренхіматозних органів [3]. Незважаючи на те, що еритремія, хронічний мієлоїдний лейкоз та сублейкемічний мієлоз є доброякісними пухлинами, профілі взаємодії фукозоспецифічних лек-тинів з орозомукоїдом за даної патології різняться. Таким чином, ми дійшли висновку, що зміни у К-гліканах АГП подібні при еритремії та хронічному мієлоїдному лейкозі. Ґрунтуючись на отриманих даних, можна зробити висновок, що зниження фукозильованості олігосахаридного компоненту АГП є характерною рисою доброякісних мієлолейкозів. У свою чергу, підвищення експресії термінальних залишків а1-2 та корової фукози може свідчити про прогресуючу мієлоїдну метаплазію кісткового мозку та паренхіматозних органів при сублейкемічному мієлозі. Таким чином, урахування даних показників може бути використано як додатковий інформа-
ційний критерій у диференціальній діагностиці хронічних мієлолейкозів.
ВИСНОВКИ
1. Концентрація АГП у плазмі крові знижується при еритремії та хронічному мієлоїдному лейкозі.
2. Підвищення експресії термінальної а 1^-2 та корової фукози на К-гліканах АГП є корисним показником мієлоїдної метаплазії кісткового мозку та паренхіматозних органів.
3. Профілі фукозильованості гліканів АГП подібні при еритремії та хронічному мієлоїдному лейкозі.
4. Визначення ступеня зв'язування вуглеводних детермінант АГП з лектинами алеврії оранжевої, сочевиці та кори золотого дощу може бути використано як додатковий інформаційний критерій у диференціальній діагностиці хронічних мієлолейкозів.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Антонюк В.О. Лектини та їх сировинні джерела. - Львів: Кальварія, 2005.- 554с.
2. Луцик М.Д., Детюк Е.С., Луцик Н.Д. Лектины в гистохимии / Под ред. Е.Н. Панасюка. - Львов: Вища школа, 1989.- 144 с.
3. Особенности структурной организации костного мозга при различных стадиях миелофиброза с миелоидной метаплазией / Кабаченко И.Н., Бебеш-ко В.Г., Грабовой А.Н. [и др.] // Вісник морфології.-2005.- №2.- С. 164-168.
4. Роль углеводной части а1-кислого гликопротеина в структурной организации его полипептидной цепи. Исследование методами спектроскопии кругового дихроизма и комбинационного рассеяния / Олейников В.А., Ковнер М.А., Куделина И.А. [и др.] // II съезд биофизиков России. Раздел 1: Структура и динамика белков и их комплексов.- 1999.
5. a1-Acid glycoprotein: an acute phase protein with inflammatory and immunomodulating properties / Hoche-pied T., Berger F, Baumann H, Libert C.// Cytokine Growth Factor Reviews. - 2003. - Vol.11. - P.25-34.
6. Becker D., Lowe J.Fucose: biosynthesis and biological function in mammals / // Glycobiology.- 2003.-Vol.13, N 7.- P. 41-53.
7. Carbohydrate binding specificity of a fucose-specific lectin from Aspergillus oryzae: a novel probe for core fucose / Matsumura K., Higashida K., Ishida H. [et al.] // J. Biol. Chem.- 2007.- Vol.282, N 21.- P. 1570015708.
8. Dennis J.W., Granovsky M., Warren C.E. Glycoprotein glycosylation and cancer progression // Biochimica Biophysica Acta.- 1999.- Vol. 1473.- P. 2134.
9. Glycosylation of a1-Acid Glycoprotein (Oro-
somucoid) in Health and Disease: Occurrence, Regulation and Possible Funtional Implications / Van Dijk Willem, Brinkman-Van der Linden, Els C.M. [et al.] // Trends in Glycoscience and Glycotechnology.- 1998.- Vol. 10, №53.- P.235-245.
10. Highly glycosylated a1-acid glycoprotein is synthesized in myelocytes, stored in secondary granules, and released by activated neutrophils / Kim Theilgaard-Monch, Lars C. Jacobsen, Thomas Rasmussen [et al.] // J. Leukocyte Biology.- 2005.- Vol.78.- P. 462-470.
11. Fournier T., Medjoubi N., Porquet D. Alpha-1-acid glycoprotein // Biochim. Biophys. Acta.- 2000.-Vol.1482.- P.157-171.
12. Improvement of the lectin-antibody enzyme immunoassay of the alphafetoprotein carbohydrate chain for automation with the enzyme immunoassay robot / Tamano K., Sugiura M., Natsuki J. [et al.] // Biosci. Biotechnol. Biochem.- 2005.- Vol.69, N 8.- P. 1616-1619.
13. Poland D.C. Neutrophils synthesize and can release a specifically fucosylated gly coform of alpha-1-acid glycoprotein which is a very potent inhibitor of the classical route of complement. Tissue specific fuco-sylation of alpha-1-acid glycoprotein and its potency to inhibit the classical route of complement // Amsterdam: PhD thesis, Vrije Universiteit, 2002.- P. 71-88.
14. Structure of human a1-acid glycoprotein and its high-amnity binding site / KopecKy V., Ettrich R, Hof-bauerov K., Baumruka V. // Biochemical and Biophysical Research Communications.- 2003.- Vol.300.- P. 41-46.
15. Zsilaa F., Iwao Y. The drug binding site of human a1-acid glycoprotein: Insight from induced circular dichroism and electronic absorption spectra // Biochimica Biophysica Acta.- 2007.- Vol.1770.- P. 797-809.
♦
