CC BY
17
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2021; 66(1) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2021-66-1-22-25
ГЕМАТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2021
Дерюгина А.В.1,Иващенко М.Н.2, Игнатьев П.С.3, Белов А.А.2 Петров В.А.2
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ АНАЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ МЕТОДОМ ЛАЗЕРНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ
1 ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», кафедра физиологии и анатомии, 603950, Нижний Новгород, Россия;
2 ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства РФ, кафедра физиологии и биохимии животных, 603107, Нижний Новгород, Россия;
3 АО «Производственное объединение «Уральский оптико-механический завод им. Э.С. Яламова», 620100, Екатеринбург, Россия
Морфофункциональное состояние эритроцитов значительно изменяется при возникновении и прогрессировании различных заболеваний, а также при критических состояниях, травмах, сопровождающихся сильным повреждением тканей, что приводит к нарушению не только микроциркуляции, но и оказывает влияние на гемореологию в целом. В связи c этим возникают вопросы о потребности в развитии адекватный: методов оценки функциональной активности эритроцитов. Цель работы - исследование возможностей лазерной интерференционной микроскопии при анализе функционального состояния эритроцитов. Получены экспериментальные данные, которые позволили в количественном отношении оценить состояние фазовой высоты и фазового диаметра, а анализ наноструктуры поверхности - функциональную активность клеток. Выявлена следующая закономерность: появление эхиноцитов при действии адреналина, который сопровождается увеличением фазовой высоты и уменьшением фазового диаметра с появлением на поверхности клеток спикул. Действие кортизола приводит к уменьшению фазовой высоты и фазового диаметра с появлением многочисленных разрыгхлений структуры клеточной поверхности. При этом традиционный метод анализа распределения эритроцитов в популяции по морфологии (дискоциты, стоматоциты и дегенеративно-измененные формы клеток) не выявил статистически значимый: различий. Таким образом, результаты свидетельствуют, что применение метода лазерной интерференционной микроскопии позволяет проводить качественную оценку морфофункциональной активности на-тивных клеток, что повышает информативность анализа и приводит к объективизации данных по функциональным возможностям эритроцитов.
Ключевые слова: лазерная интерференционная микроскопия; эритроциты; морфология; наноструктура. Для цитирования: Дерюгина А.В., Иващенко М.Н., Игнатьев П.С., Белов А.А., Петров В.А. Диагностические возможности анализа эритроцитов методом лазерной интерференционной микроскопии. Клиническая лабораторная диагностика. 2021;66(1): 22-25. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2021-66-1-22-25 DeryuginaA.V.', IvashchenkoM.N.2, IgnatyevP.S 3, BelovA.A. 2, Petrov V.A.2
DIAGNOSTICS POSSIBILITIES OF ERYTHROCYTES ANALYSIS BY THE METHOD OF LASER INTERFERENCE MICROSCOPY
1 Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education «National Research Lobachevsky State University», 603950, Nizhny Novgorod, Russia;
2 Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Nizhny Novgorod State Agricultural Academy» Ministries of Agriculture of the Russian Federation, 603107, Nizhny Novgorod, Russia;
3 Production Association «E.S. Yalamov Urals Optical and Mechanical Plant», 620100, Ekaterinburg, Russia
The morphofunctional .state of erythrocytes .significantly changes by the onset and progression of various diseases, as well as in critical conditions, injuries, accompanied by severe tissue damage. This leads to a violation of microcirculation and has an effect on hemorheology in general. In connection with this, there is a need for the development of adequate methods for assessing the functional activity of erythrocytes.
The aim of the work was to study the possibilities of laser interference microscopy in the analysis of the functional state of erythrocytes. The results allowed us to quantify the state of the phase height and phase diameter of erythrocytes. Analysis of the surface nanostructure gave a qualitative assessment of the functional activity of cells. The following patterns were revealed: the action of adrenaline causes the appearance of echinocytes with an increase in phase height and decrease phase diameter and the appearance ofspicules on the surface of cells. The action of cortisol leads to a decrease in the phase height and the phase diameter with the appearance of numerous loosening of the structure of the cell surface. Moreover, the traditional method of analyzing the distribution of erythrocytes in a population by morphology (discocytes, stomatocytes, and degeneratively altered cell forms) did not reveal statistically significant differences. Thus, the results indicate that the interference microscopy method allows a qualitative assessment of the morphofunctional activity of native cells. This increases the information content of the analysis and leads to the objectification of data on the functional capabilities of erythrocytes.
Key words: laser interference microscopy; erythrocytes; morphology; nanostructure.
For citation: Deryugina A.V., Ivashchenko M.N., Ignatyev P.S., Belov A.A., Petrov V.A. Diagnostics possibilities of erythrocytes analysis by the method of laser interference microscopy. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2021; 66(1): 22-25. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2021-66-1-22-25
Для корреспонденции: Иващенко Марина Николаевна, доц. каф. физиологии и биохимии животных; е-таП: kafedra2577@mail.ru
HEMATOLOGY
For correspondence: Ivashchenko M.N., associate Professor of the Department physiology and biochemistry of animals; e-mail:
kafedra2577@mail.ru
Information about authors:
Deryugina A.V., http://orcid.org/0000-0001-8812-8559;
Ivashchenko M.N., https://orcid.org/0000-0001-6642-8518;
Ignatyev P.S., https://orcid.org/0000-0001-5075-7034;
Belov A.A., https://orcid.org/0000-0002-4869-5054;
Petrov V.A. https://orcid.org/0000-0002-9190-0914.
Conflict of interest. The authors declare absence of conflict of interest.
Acknowledgment. The research was carried out with the financial .support of the RFBR in the framework of scientific project №19-316-90066.
Received 09.07.2020 Accepted 26.07.2020
Введение. Эритроциты, будучи наиболее многочисленной фракцией клеточных элементов крови, являются основным фактором, определяющим ее реологию. Возникающие ухудшения реологических свойств крови создают условия для развития расстройств микроциркуляции - в зоне, где осуществляется газообмен. Определяют способность эритроцитов к микроциркуляции такие показатели как их агрегация и деформируемость, которые зависят от структурной организации мембран эритроцитарных клеток [1]. Жесткие, плохо поддающиеся деформации эритроциты не только блокируют микроциркуляторное русло, но и повреждают интиму сосудов, особенно крупных артерий, где скорость кровотока достаточно высока [2]. При возникновении и прогрессировании различных заболеваний, а так же при критических состояниях, травмах, сопровождающихся сильным повреждением тканей происходит нарушение мембранных структур эритроцитов и, как следствие, их функционирование [3]. В связи c этим возникает потребность в развитии адекватных методов оценки функциональной активности эритроцитов, внедрении новых способов получения информации о физиологическом состоянии клеток в целом и в условиях изменения гоме-остаза. В литературе имеется сравнительно мало работ, посвященных анализу свойств нефиксированных эритроцитов, что объясняется трудностями исследования живых клеток. Одним из эффективных современных высокоинформативных методов определения состояния биологических объектов является лазерная интерференционная микроскопия. Этот метод, без изменения натив-ных свойств клеток, наряду с построением изображения образца, позволяет изучать клеточные процессы, выяснять такие важнейшие свойства, как эластичность, мобильность поверхностных слоев, адгезия, молекулярное связывание и электростатичность.
Цель работы - исследование возможностей лазерной интерференционной микроскопии при анализе функционального состояния эритроцитов.
Материал и методы. Объектом исследования служили эритроциты периферической крови человека. Исследование проведено с разрешения локального этического комитета при Нижегородском государственно университете им. Н.И. Лобачевского. Информированное согласие доноров на участие в исследовании получено.
Кровь забирали утром натощак из локтевой вены в вакуумные пробирки, после чего из венозной крови получали эритроцитарную взвесь.
Интерференционную микроскопию эритроцитов проводили при модификации клеток в экспериментах in vitro. Было проведено несколько серий по 20 опытов.
Исследовали эритроциты, преинкубированные с адреналином (1-10-9г/мл) в течение 15 мин (1 серия), корти-золом (5-10-7г/мл) в течение 30 минут (2 серия).
Структурные изменения в эритроцитах изучали методом лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) на лазерном интерференционном микроскопе МИИ-340 (Екатеринбург, Россия) с объективом 30х (NA=0.65), X лазера=650 нм. Для захвата изображений использовали ПЗС видеокамеру VS-415U (NPK Videoscan, Russia) с разрешением 782x582 пикселей.
В ходе исследования биологические объекты размещались на зеркальной подложке, от которой отражается проходящий через клетку свет. В результате фиксируется двойной сдвиг фазы луча когерентного источника света в каждой точке объекта, а с помощью дополнительной волны от того же источника формируется интерференционное изображение клетки. Для исследования получали изображения 10 участков с монослойным расположением клеток в интерференционном канале и отраженном свете в каждой пробе.
Состояние эритроцитов человека оценивали, регистрируя среднюю величину оптической разности хода и площадь фазового изображения эритроцита. Для получения достоверного результата показатели рассчитывали, используя не менее 100 клеток от каждого образца.
Математическая обработка проведена методом вариационной статистики с расчетом среднего значения (М), ошибки средней (м) и определением достоверности различий по t-критерию Стьюдента. Статистический анализ полученных результатов выполняли с использованием программы Microsoft Exel и пакета прикладных программ Statistika версия 6.0.
Результаты. Анализ результатов по морфологическим критериям, таким как распределение эритроцитов в популяции по форме показал, что инкубация эритроцитов с кортизолом и адреналином не вызывала значимого различия при действии данных веществ в отношении количества дискоцитов, стоматоцитов и дегенеративно-измененных форм клеток относительно интактной группы (табл. 1). Регистрировалось только статистически значимое увеличение количества эхиноцитов при действии адреналина.
При этом следует отметить, что тенденция в изменении морфологии при действии адреналина и кортизола была разнонаправленной, но статистически значимых изменений не регистрировалось. Следовательно, традиционный метод анализа морфологии эритроцитов позволяет получать усредненные данные, что не всегда дает истинную информацию о воздействии и делает невозможным объективную оценку состояния эритроцитов.
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2021; 66(1) СЮ!: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2021-66-1-22-25
ГЕМАТОЛОГИЯ
Таблица 1
Изменение численности морфологических форм эритроцитов в зависимости от воздействия, %
Показатели Эхиноциты Стоматоциты Дегенеративно-измененные формы Дискоциты
Интактные 1,45±0,4 0,70±0,4 3,10±0,8 94,75±2,2
Адреналин 3,18±1,0* 0,98±0,1 3,70±0,2 92,14±1,3
Кортизол 1,30±0,5 0,43±0,2 2,08±0,7 96,20±1,9
Примечание Здесь и в табл. 2: *- достоверность различий между значениями с интактными клетками по критерию Стьюдента (р<0,05).
Таблица 2
Воздействие исследованных веществ in vitro на фазовый диаметр и фазовую высоту эритроцитов (M±m)
Показатели Фазовый диаметр эритроцитов, мкм Фазовая высота эритроцитов, нм
Интактные 7,55±0,03 216,8±4,66
Адреналин 7,39±0,06* 225,4±4,62*
Кортизол 7,37±0,03* 177,8±6,09*
Анализ наноструктуры эритроцитов показал, что ин-тактные эритроциты имели типичную форму двояковогнутых дискоцитов, на поверхности выделялась незначительная неоднородность, обусловленная присутствием мембранно-связанных белков. Оценка распределения оптической плотности показала равномерное распределение гемоглобина.
Учитывая, что повышение функциональной деятельности гипоталамо-гипофизарно -надпочечниковой системы является своего рода пусковым механизмом для сложной перестройки организма при развитии стрессового состояния, возникающего под воздействием различных неблагоприятных факторов [4], нами были проведены исследования действия адреналина и кортизола на эритроциты. Для количественной оценки морфофункционального состояния живых эритроцитов использовали параметр, называемый фазовой высотой клетки, который определяли как максимальную высоту профиля относительно уровня подложки. По фазовому профилю эритроцита можно измерить фазовый диаметр клетки.
Регистрация фазовой высоты эритроцитов выявила, что после инкубации клеток с адреналином фазовая высота увеличивалась на 4%, после инкубации с кортизо-лом — снижалась на 18% относительно интактных значений (табл. 2). Фазовый диаметр эритроцитов после инкубации эритроцитов с адреналином, кортизолом достоверно снизился на 2% и 3% соответственно, по сравнению со значениями интактной группы клеток.
Таким образом, лазерная интерференционная микроскопия позволяет очень точно оценить изменения фазовой высоты, которые связаны с изменениями показателя преломления клеток и, таким образом, зависит от концентрации и соотношения количества веществ в растворе. Полученное различие в величинах фазовой высоты обусловлено наличием воды и, следовательно, меньшим изменением фазовой высоты образца [5].
Фазовое изображение эритроцитов, инкубированных с адреналином, кортизолом, имело «шероховатую» форму с выпуклостями и выростами, резко контрастирующими по отношению к поверхности образца. Менялась геометрия клетки, изменялось соотношение «поверхность/объем», происходила сферуляция эритроцитов.
При инкубации эритроцитов с кортизолом на поверхности клеток появлялись многочисленные разрыхления структуры клеточной поверхности. Инкубация клеток
с адреналином вызывала больший эффект деформации эритроцитарных мембран, который выражался появлением на поверхности выпуклых уплотнений и спикул.
Наблюдаемые эффекты, возможно, вызваны перенасыщением адреналином гормональных рецепторов с последующей модификацией свойств мембран и функционального состояния клеток [6]. Вполне вероятно и то, что обнаруженные изменения при инкубации клеток с адреналином частично опосредуются и через активацию свободнорадикального окисления, интенсификация процессов перекисного окисления липидов влечет за собой нарушение структуры и свойств эритроцитарных мембран. Данные процессы могут опосредовать увеличение количества гемина, о чем свидетельствуют образование спикул и формирование эхиноцитов, что так же отмечено в ряде исследований [7].
При действии стероидных гормонов на эритроцитар-ные мембраны изменяются механизмы их структурной самоорганизации, активные группы гормона взаимодействуют с CO- и NH-группами белков, и фосфолипидов мембраны. Это приводит к образованию в мембране сложных белок-липидных доменов, вытеснению диполи воды из доменов и как результат разрыхлению мембраны [8].
Заключение. По результатам работы показано, что на основе простого способа пробоподготовки можно получать интерференционное изображение живых эритроцитов с детализацией морфологических параметров и использовать их для качественной оценки морфо-функциональной активности клеток. При этом анализ наноструктуры мембраны эритроцитов, являющейся их специфической реакцией на внешнее воздействие, повышает информативность анализа и приводит к объективизации данных по функциональным возможностям эритроцитов.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-316-90066.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мороз В.В., Голубев А.М., Афанасьев А.В., Кузовлев А.Н., Сер-гунова В.А., Гудкова О.Е., Черныш А.М. Строение и функция эритроцита в норме и при критических состояниях. Общая реаниматология. 2012; 8(1): 52.
2. Соколова И.А. Агрегация эритроцитов. Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2010; 9 (4): 4-26.
3. Дерюгина А.В., Иващенко М.Н., Игнатьев П.С., Лодяной М.С., Самоделкин А.Г. Изменение фазового портрета и электрофорети-ческой подвижности эритроцитов при различных видах заболеваний. Современные технологии в медицине. 2019; 11(2): 63-8.
4. Дерюгина А.В., Иващенко М.Н., Игнатьев П.С., Самоделкин А.Г., Белов А.А., Гущин В.А. Оценка генотоксичных эффектов в буккаль-ном эпителии при нарушениях адаптационного статуса организма. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63 (5): 290-2.
5. Юсипович А.И., Берестовская Ю.Ю., Шутова В.В., Левин Г.Г., Герасименко Л.М., Максимов Г.В., Рубин А.Б. Новые возможности исследования микробиологических объектов методом лазерной интерференционнной микроскопии. Биофизика. 2011; 56 (6): 1091-8.
6. Голенда И.Л., Казин Э.М., Галеев А.Р. Поиск взаимосвязей между параметрами кинетики кислотного гемолиза эритроцитов и функциональным состоянием организма. Физиология человека. 1996; 4: 130-6.
7. Сергунова В.А., Черняев А.П., Козлов А.П., Близнюк У.А., Бор-щеговская П.Ю., Козлова Е.К., Черныш А.М. Наноструктура мембран эритроцитов при интоксикации крови. Исследование с помощью атомной силовой микроскопии. Альманах клинической медицины. 2016; 44 (2): 234-41.
8. Панин Л.Е., Мокрушников П.В., Куницын В.Г., Панин В.Е., Зайцев Б.Н. Основы многоуровневой мезомеханики наноструктур-ных переходов в мембранах эритроцитов и их разрушения при взаимодействии с гормонами стресса. Физическая мезомехани-ка. 2011; 14: 5-17.
REFERENCES
1. Moroz V.V., Golubev A.M., Afanas'ev A.V., Kuzovlev A.N., Sergu-nova V.A., Gudkova O.E., Chernysh A.M. Structure and function of
HEMATOLOGY
the red blood cell in normal and critical conditions. Obshchaya re-animatologiya. 2012; 8(1): 52. (in Russian)
2. Sokolova I.A. Aggregation of red blood cells. Regionarnoe krovoo-brashchenie i mikrocirkulyatsiya. 2010; 9 (4): 4-26. (in Russian)
3. Deryugina A.V., Ivashchenko M.N., Ignatiev P.S., Lodyanoy M.S., Samodelkin A.G. Alterations in the phase portrait and electrophoretic mobility of erythrocytes in various diseases. Sovremennye tekhnolo-gii v medicine. 2019; 11(2): 63-8. (in Russian)
4. Deryugina A.V., Ivashchenko M.N., Ignat'ev P.S., Samodelkin A.G., Belov A.A., Gushchin V.A. Assessment of genotoxic effects in buccal epithelium in disorders of the adaptive status of the organism. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2018; 63 (5): 290-2. (in Russian)
5. Yusipovich A.I., Bepestovskaya Yu.Yu., Shutova V.V., Levin G.G., Gerasimenko L.M., Maksimov G.V., Pubin A.B. New possibilities for studying microbiological objects by laser interference microscopy. Biofizika. 2011; 56 (6): 1091-8. (in Russian)
6. Golenda I.L., Kazin E.M., Galeev A.R. Search for relationships between the parameters of the kinetics of acid hemolysis of red blood cells and the functional state of the body. Fiziologiya cheloveka. 1996; 4: 130-6. (in Russian)
7. Sergunova V.A., Chernyaev A.P., Kozlov A.P., Bliznyuk U.A., Bor-shchegovskaya P.Yu., Kozlova E.K., Chernysh A.M. Nanostructure of erythrocyte membranes in blood intoxication. Research using atomic force microscopy. Al'manakh klinicheskoy meditsiny. 2016; 44 (2): 234-41. (in Russian)
8. Panin L.E., Mokrushnikov P.V., Kunitsyn V.G., Panin V.E., Zaytsev B.N. Fundamentals of multilevel mesomechanics of nanostructured transitions in erythrocyte membranes and their destruction in interaction with stress hormones. Fizicheskaya mezomekhanika. 2011; 14: 5-17. (in Russian)
Поступила 09.07.20 Принята к печати 26.07.20
