CC BY
14
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ИНТЕГРАЛЬНЫХ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ТЯЖЕЛОМ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ
Винник Ю. С., Дунаевская С. С., Антюфриева Д.А
ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России
Дунаевская Светлана Сергеевна
Dunaevskaya Svetlana S [email protected]
Винник Ю. С. — д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей хирургии им. проф. М.И. Гульмана Дунаевская С. С. — д.м.н., доцент, профессор кафедры общей хирургии им. проф. М.И. Гульмана Антюфриева Д. А. — аспирант кафедры общей хирургии им. проф. М.И. Гульмана
Vinnik Y. S. — Doctor of Medicine., professor, head of a chair general surgery's department named after prof. M.I. Gulman Dunaevskaya S. S. — Doctor of Medicine., docent, professor of general surgery's department named after prof. M.I. Gulman Antufrieva D. A. — resident of general surgery's department named after prof. M.I. Gulman
Цель исследования: изучение зависимости между интегральными гематологическими показателями и хемилюми-несценцией нейтрофилов у пациентов тяжелым острым панкреатитом.
Материалы и методы: обследовано 70 пациентов с диагнозом острого панкреатита, тяжесть заболевания определяли по интегральной шкале Рагеоп, данным клинического и лабораторного обследования, подтверждали диагноз инструментальными методами диагностики. Больные были разделены на 2 клинические группы: 35 пациентов с нетяжелым острым панкреатитом и 35 с тяжелой формой заболевания. Рассчитывали интегральные гематологические показатели на основе развернутого анализа крови. Функциональная активность нейтрофилов определялась с помощью хемилюминесцентного анализа, активатором реакции был выбран люминол.
Результаты: тяжелый острый панкреатит характеризуется снижением интенсивности хемилюминесценции, с преобладанием гипооксического типа генерации АФК у 94,28% больных. Были выявлены высокие отрицательные корреляции между интегральными индексами воспалительной реакции и степени эндотоксикоза (лейкоцитарный индекс интоксикации по Кальф-Калифу, индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов, ядерный индекс Г.Д. Дашнаянца и реактивный ответ нейтрофилов) и показателями хемилюминесцентной реакции, отражающими степень генерации активных форм кислорода (интенсивность реакции и время выхода на пик реакции). Что позволяет судить о высокой степени окислительного стресса при выраженном воспалительном и некротическом процессе в ткани поджелудочной железы. Депрессия антиоксидантных ресурсов организма на фоне выраженного патологического процесса при тяжелом остром панкреатите подтверждается сильными отрицательными связями между индексом соотношения нейтрофилов и лимфоцитов и площадью под кривой хемилюминесцентной реакции (-0,62, р=0,001 при спонтанной реакции и -0,72, р=0,001 активированной).
Ключевые слова: тяжелый острый панкреатит, интегральные гематологические показатели, хемилюминесценция Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2016; 134 (10): 86-90
Research aim is estimation of dependence between integral hematological indexes and chemiluminescence of neutrophils at severe acute pancreatitis.
Materials and methods: The 70 patients with acute pancreatitis were examined, severity of disease were reviled based on integral score Ranson, results of clinical and laboratories examinations, diagnosis was confirmed by instrumentals methods of diagnostics. Patients were divided into two clinical groups: 35 patients with no severe acute pancreatitis and 35 patients with severe acute pancreatitis. Integral hematological indexes were calculated based on results of clinical blood test. Functional activity of neutrophils were estimated by chemiluminescence analysis, activator of reaction was luminal.
Results: Severe acute pancreatitis was characterized by lowering of intensity chemiluminescence with prevalence hypoxic type of active oxygen's generation 94,28% patients. High negative correlations between integral indexes of inflammatory reaction and degree of endotoxicosis (Kalf — Kalif's leukocytal index of intoxication, index of correlation between
Резюме
Summary
neutrophils and lymphocytes, G.D. Dashnayahtsa nuclear index and reactive response of neutrophils) and indexes of chemiluminescence reaction, which show type of active oxygen's generation (intensity of reaction and peak reaction time) were revealed. It allowed talking about high degree of oxidative stress at expressed inflammatory and necrotic process in pancreatic tissue. Decrease of antioxidant resources against a background expressed pathologic process at severe acute pancreatitis was confirmed by High negative correlations between u index of correlation between neutrophils and square under curve of chemiluminescence reaction (-0,62, p=0,001 at spontaneous reaction and -0,72, p=0,001 activated).
Keywords: severe acute pancreatitis, integral hematological indexes, chemiluminescence Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2016; 134 (10): 86-90
Введение
Актуальность проблемы изучения ранней диагностики тяжелых форм острого панкреатита обусловлена сохраняющейся высокой летальностью и длительными сроками госпитализации данной группы пациентов [1, 2, 3]. Основными причинами летальных исходов неизменно остаются «ранние токсические» и «поздние септические» осложнения [4].
Важное место занимает анализ активности неспецифического иммунного ответа, определяемый путем оценки функциональной активности нейтрофилов. При анализе хемилюминесцен-ции фагоцитов выявляется образование активных кислородных радикалов, что также может
использоваться как критерий интенсивности дыхания клетки при фагоцитозе [5]. Используя хемилюминесценцию можно судить косвенным образом о многих ключевых признаках клеточного метаболизма, и, следовательно, об ее интегральном состоянии. Отмечено, что 2-3 кратное увеличение показателей метаболической активности нейтрофилов в ферментативную фазу острого панкреатита является критерием благоприятного исхода заболевания [6, 7].
Целью работы явилось изучение зависимости между интегральными гематологическими показателями и хемилюминесценцией нейтрофилов у пациентов тяжелым острым панкреатитом.
Материал методы исследования
Обследовано 70 пациентов обоего пола, в возрасте от 22 до 71 г., медиана 46 лет (ДИ 42,4-49,3), поступивших в 2013-2015 годах в I хирургическое отделение НУЗ «Дорожная клиническая больница на ст. Красноярск» ОАО РЖД, по скорой медицинской помощи с диагнозом острый панкреатит в ферментативную фазу заболевания. Больные были разделены на две группы клинического наблюдения, первая группа составляла 35 пациентов с острым панкреатитом, у которых при оценке тяжести острого панкреатита по шкале Яап80п было менее 3 баллов. Вторая группа — 35 пациентов, у которых оценка по шкале Яап80п была более 3 баллов, и были выявлены клинические проявления тяжелого острого панкреатита. Группу контроля составили 20 практически здоровых лиц.
На момент поступления у пациентов проводился забор крови для проведения развернутого анализа крови с определением лейкоцитарной формулы на анализаторе SYSMEX Х88001, использующим технологию проточной цитометрии для подсчета лейкоцитарной формулы. Производился расчет следующих интегральных гематологических показателей: лейкоцитарный индекс интоксикации по Я.Я. Кальф-Калифу (ЛИИ по Я. Я. Кальф-Калифу), лейкоцитарный индекс интоксикации по В. К. Островскому (ЛИИ по В.К. Островскому), индекс стресса (ИС), индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов (ИСНЛ), индекс соотношения нейтрофилов и моноцитов (ИСНМ), лимфоцитарно-гранулоцитарный
индекс (ИЛГ), Ядерный индекс Г.Д. Даштаянца (ЯИ Г.Д. Даштаянца), реактивный ответ нейтрофилов (РОН).
Выделение нейтрофилов проводили одномоментным центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографин. Остаточные эритроциты удаляли с помощью осмотического шока. Жизнеспособность суспензии нейтрофилов в тесте с трепановым синим была не менее 97%.
Для регистрации скорости образования активных форм кислорода (АФК) использовался метод люминол-зависимой хемилюминесценции, основанный на фиксации потока фотонов, образующихся при окислении люминола. Для измерения генерации АФК применяли полистироловые кюветы «Clinicol». Подсчет вели на автоматизированном шести канальном хемилюминометре, управляемом микро ЭВМ. В кювету вносили 200 мкл люминола («Sigma», США), 100 мкл нейтрофилов крови человека, разведенной в 10 раз неокрашенным раствором Хенкса; 50 мкл взвеси частиц латекса размером 2,4 мкм, опсонированных инактивированной сывороткой от 10 доноров. Время инкубации клеток крови для записи кинетики хемилюминисцентной реакции при фагоцитозе частиц латекса составляло 104 минуты при температуре 37° С.
В число информативных анализируемых параметров хемилюминесцентной кривой входили: S -светосумма, I тах-амплитуда, Tmax-время достижения I max, Simtr-симметричность ХЛ кривой, Shape1 и Shape 2- показатели степени остроты кривой на уровне У и Уз величины I max.
Рисунок 1.
Типы хемилюминесцентных реакций у пациентов в зависимости от степени тяжести острого панкреатита.
30 25 20
нормоксическии гипероксический гипооксическиИ
35
33
2
0
0
ОП
ТОП
Таблица 1.
Интегральные гематологические показатели у пациентов с острым панкреатитом при поступлении в хирургический стационар
Примечание:
р достоверность различия между группами пациентов р1 достоверность различия исследуемого показателя с контрольной группой
Показатели
Группа контроля
ОП
ТОП
ЛИИ Я.Я. Кальф-Калифу 1,16±0,54 2,12±0,16 р,=0,037 4,98±0,73 р1=0,001 р=0,013
ЛИИ В.К. Островскому 1,26±0,34 2,67±0,98 р]=0,048 5,46±1,15 р1=0,001 р=0,026
Индекс стресса 0,51±0,17 0,85±0,34 р1=0,671 2,39±0,91 р1=0,001 р=0,001
ИСНЛ 8,14±0,18 9,36±1,34 р1 = 0,322 15,40±2,78 р1=0,018 р=0,001
ИСНМ 13,01±1,62 15,64±3,14 р1=0,248 27,36±4,41 р1=0,022 р=0,011
ЛГИ 3,14±0,84 3,24±1,62 р1=0,641 5,18±2,13 р1=0,034 р=0,015
ЯИ Г.Д. Даштаянца 0,097±0,016 0,32±0,13 р1=0,001 1,45±0,36 р1=0,001 р=0,018
РОН 10,64 ± 2,18 20, 46±3,14 р1=0,035 42,17±5,33 р1=0,001 р=0,001
р
Полученный в исследованиях материал был обработан методами статистического анализа, используемыми в биологии и медицине. Для оценки характера распределения применялся тест Шапи-ро-Уилкса. Для величин подчиняющихся нормальному распределению описательная статистика представлена в виде среднее арифметическое значение
(М), среднего квадратического отклонения (а). Для сравнения двух групп применялся критерий Стью-дента (1 -критерий) для независимых выборок. Критический уровень статистической значимости при проверке нулевой гипотезы принимали равным 0,05. На основании полученных данных рассчитан коэффициент корреляции по Спирману (гё).
Результаты исследования
Анализируя полученные показатели, обращает внимание повышение ЛИИ по В.К. Островскому и ЛИИ по Я.Я. Кальф-Калифу у пациентов тяжелым острым панкреатитом (4,98±0,73, р=0,013 и 5,46±1,15, р=0,026), что позволяет судить о высокой степени эндогенной токсемии. Соотношение нейтрофилов к моноцитам при тяжелом панкреатите превышало норму в 1,7 раза выше, что являлось неблагоприятным прогностическим признаком и позволяло судить об интенсивности воспалительной реакции. Возрастание показателя лимфоцитарно-гранулацитарного индекса при тяжелом остром панкреатите (5,18±2,13) позволяет выявить высокий уровень аутоинтоксикации, при нетяжелом панкреатите это показатель остается в пределах нормальных значений. Ядерный индекс Г.Д. Даштаянца позволяет определить тяжесть состояния больного по уровню эндогенной
интоксикации, при тяжелом панкреатите это показатель был равен 1,45±0,36, что в 4,5 раза выше показателя при нетяжелом панкреатите. Данные представлены в таблице № 1.
Хемилюменисцентный анализ позволяет судить о функциональном состоянии клеток неспецифической иммунной защиты. Спонтанная и активированная люминолом хемилюминисценция нейтрофилов у пациентов с нетяжелым острым панкреатитом выявила нормооксический тип генерации АФК в 15 случаях (42,85%) и гипероксический в 20 (57,15%). При тяжелом остром панкреатите преобладал гипооксический тип 33 (94,28%). Данные представлены на рисунке № 1.
Интенсивность перекисного окисления липидов оценивали по значению показателя 1тах, а антиокси-дантные резервы организма по 8диаг. Рассматривая, полученные данные можно сделать вывод о том, что
Показатели Группа контроля ОП ТОП р
Imax спон., имп/с 1544,33±35,98 6139,25±125,52 р1=0,001 166,34±10,97 р1=0,001 Р= 0,001
Squar спон., имп 2,76E+06±0,82 7,04E+06±2,28 р,=0,001 3,80Е+05±0,93 р1 = 0,288 Р= 0,001
Tmax спон., мин. 13,66±4,25 4,58±1,53 р]=0,001 4,02±0,83 р1=0,001 Р= 0,253
Shap1 спон. 2,73E+00±0,58 6,80Е+00±2,23 р1=0,001 2,90Е+00±0,85 р1=0,665 Р= 0,001
S/лейкоцит спон., имп./кл. 170,25±10,69 455,38±4,62 р1=0,001 6,90±1,58 р1=0,001 Р= 0,001
8156,52±537,83 295,23±13,41
Imax акт., имп/с 3188,25±132,63 р1=0,001 р,=0,079 р1=0,001 р,=0,001 Р= 0,001
3,50Е+07±0,94 1,10Е+06±0,27
Squar акт., имп 1,98E+06±0,46 р1=0,041 р,=0,019 р1=0,814 р,=0,038 Р= 0,001
32,41±7,15 45,32±5,26
Tmax акт., мин. 27,93±5,47 р1=0,451 р,=0,001 р1=0,033 р12=0,001 Р= = 0,521
1,40Е-01±0,36 3,70Е-01±0,92
Shap1 акт. 5,14E+00±1,38 р1=0,022 р2=0,073 р1=0,330 р12=0,189 Р= 0,001
S/лейкоцит акт., имп./кл. 2153,84±132,21 20,20±3,15
350,58±30,03 р1=0,001 р,=0,001 р1=0,001 р21=0,001 Р= 0,001
Таблица 2.
Показатели спонтанной и активированной хемилю-менисценции нейтрофилов у пациентов с острым панкреатитом при поступлении
Примечание:
р — достоверность различия между группами пациентов; р1 — достоверность между показателями клинических групп от группы контроля; р2 достоверность между показателями спонтанной и индуцированной хемилю-минесценции
Показатели ЛИИ 1 ЛИИ 2 ИС ИСНЛ ИСНМ ЛГИ ЯИ РОН Таблица 3.
1тах спон., имп/с -0,52* -0,48 0,40 -0,58* -0,46 0,50* -0,57* -0,64* Коэффициенты корреляции
Squar спон., имп -0,56* -0,54* 0,51* -0,62* -0,50* 0,59* -0,71** -0,78** между ИГП и показателями
Ттах спон., мин. -0,48 -0,36 0,39 -0,50* -0,39 0,44 -0,51* -0,55* спонтанной и активированной хемилюменисценции
Shap1 спон. -0,21 -0,18 0,09 -0,29 -0,20 0,06 -0,51* -0,52* нейтрофилов у пациентов
S/лейк.спон., имп./кл. -0,19 -0,20 0,08 -0,38 -0,12 0,08 -0,82** -0,50* с острым панкреатитом при
1тах акт., имп/с -0,72** -0,58* 0,52* -0,63* -0,76** 0,69* -0,85** -0,83** поступлении
Squar акт., имп -0,66* -0,52* 0,54* -0,72** -0,80** 0,50* -0,56* -0,84** Примечание: гБ — коэффицент корреля-
Ттах акт., мин. -0,53* -0,48 0,42 -0,56* -0,70** 0,48 -0,51* -0,76**
Shap1 акт. -0,32 -0,14 0,26 -0,51* -0,54* 0,18 -0,52* -0,68* ции по Спирману
S/лейк. акт., имп./кл.
-0,32 -0,16 0,38 -0,44 -0,58* 0,22 -0,50* -0,32 ** — высокая корреляция
*** — очень высокая корре-
ляция.
более интенсивная генерация АФК происходила у пациентов с нетяжелым острым панкреатитом. И анти-оксидантный потенциал у этих пациентов был выше. Кроме того, при тяжелом панкреатите снижается антиоксидантный потенциал организма, таблица № 2.
При проведении корреляционного анализа было выявлено наличие высоких отрицательный корреляций между наиболее ярко иллюстрирующими интенсивность патологического процесса интегральными гематологическими показателя (ЛИИ по Кальф-Калифу, ИСНЛ, ЯИ Г.Д. Дашнаянца и РОН) с показателями, характеризующими выраженность
окислительных процессов (1тах и Ттах). Это может означать, что при выраженном воспалительном процессе в поджелудочной железе велика доля не-доокисленных метаболитов. На фоне интенсивного патологического процесса так же происходит снижение собственных антиоксидантных ресурсов организма, о чем свидетельствует сильные отрицательные корреляции между ИСНЛ и Squar. Таким образом, изменение интегральных гематологических показателей косвенно свидетельствует о процессах клеточного метаболизма. Данные представлены в таблице № 3.
Обсуждение полученных результатов
Интегральные гематологические показатели у пациентов с острым панкреатитом позволяют охарактеризовать состояние неспецифической реактивности организма. При тяжелом остром панкреатите регистрируются изменения неспецифической реактивности организма, выражающиеся относительной лимфопенией и аутоинтоксикацией. Важную
роль в течении патологического процесса несет накопление недоокисленных метаболитов в сочетании со снижением антиоксидантного потенциала. Хемилюменисценция характеризует неспецифические иммунные реакции при воспалительном процессе и позволяет определить активность продуктов кислородного метаболизма, что напрямую
связанно с перикисным окислением липидов, как одним из механизмов аутоинтоксикации. Выявлено, что при тяжелом остром панкреатите активные формы кислорода формируются в недостаточном
количестве, что обуславливает длительное циркулирование в крови недоокисленных метаболитов, обеспечивающих высокий уровень эндогенной интоксикации.
Выводы
1. Тяжелый острый панкреатит характеризуется высокой степенью эндотоксемии, о чем свидетельствует повышение ЛИИ и Ядерного индекса Г.Д. Дашнаянца.
2. Прогностически неблагоприятным фактором можем считать снижение генерации АФК, так
как гипооксический тип превалировал при тяжелом остром панкреатите.
3. Учитывая корреляционный связи, можем предположить, что степень воспалительного процесса в поджелудочной железе напрямую взаимосвязана со снижением антиоксидантных ресурсов.
