CC BY
42
УДК 616.981.452(471)
М.Е.Платонов1, В.В.Евсеева1, Д.В.Ефременко2, И.В.Кузнецова2, Е.В.Чиркова1, С.В.Дентовская1,
А.Н.Куличенко2, А.П.АНИСИМОВ1
dfr-типирование штаммов yersinia pestis из природных очагов снг
ФГУЗ «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск;
2ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт»
С помощью DFR-типирования [6] набора из 275 штаммов Y. pestis, выделенных преимущественно в природных очагах чумы стран СНГ, определены «геномовары» (DFR-типы), характерные для 27 очагов. Выявлено 64 новых DFR-типа Y. pestis (из 96, описанных к настоящему времени) и установлено, что на территории стран СНГ и в Монголии циркулирует не менее 56 геномоваров. Показано, что все исследованные методом DFR-типирования штаммы кластеризуются в соответствии с филогенетической схемой, предложенной на основании данных сочетанного SNP- и ISlOO-типирования [1], и дифференцируются до уровня подвидов, популяций и даже штаммов, циркулирующих на территории определенных природных очагов.
Ключевые слова: DFR-типирование, Yersinia pestis.
M.E.Platonov, V.V.Evseeva, D.V.Efremenko, I.V.Kuznetsova, E.V.Chirkova, S.V.Dentovskaya,
A.N.Kulichenko, A.P.Anisimov
DFR-Typing of Yersinia pestis Strains from the CIS Natural Foci
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk;
Stavropol Research Anti-Plague Institute
Different region analysis (DFR-typing) was used for characterization of 275 Y. pestis strains isolated mainly from the CIS natural plague foci. Genomovars (DFR-types) endemic for 27 natural foci were determined. In addition to 32 genomovars described previously 64 novel Y. pestis DFR-types were revealed. 56 genomovars were shown to circulate in CIS and Mongolia. All strains analyzed by DFR-typing, were clustered in accordance with the phylogenetic tree proposed on the basis of combined SNP- and ISiOO-typing data. The discriminatory ability of the method is high enough to distinguish between subspecies, populations and even strains circulating in certain natural plague focus.
Key words: DFR-typing, Yersinia pestis.
Относительно недавнее возникновение и микроэволюционирование Y pestis [1] объясняет низкую степень внутривидового разнообразия и затрудняет быструю и надежную фенотипическую дифференциацию отдельных штаммов патогена [2, 5], необходимую не только для целей молекулярной эпидемиологии, но и для лучшего понимания механизмов возникновения
Y pestis и распространения чумы. Все методы геноти-пирования основаны на анализе фрагментов нуклеиновых кислот, различающихся у близкородственных штаммов [4]. Внедрение в практику здравоохранения современных методов генотипирования обеспечивает получение воспроизводимых данных, позволяющих не только различать внутривидовые группы, но и отдельные штаммы Y pestis и даже линии штаммов, поддерживаемые в различных лабораториях.
В геноме Y. pestis с помощью сравнительного анализа полногеномных последовательностей in silico, сравнительной гибридизации геномов с помощью технологии ДНК-микроэрреев и вычитающей гибридизации было выявлено 23 локуса, по наличию которых отличаются штаммы одного вида (different region - DFR), и была разработана технология генотипирования Y. pestis, основанная на учете присутствующего в штамме набора DFR. При исследовании 909 природных изолятов было показано, что на территории 13 природных очагов Китая
циркулируют штаммы 32 «геномоваров» (DFR-типов), причем для каждого очага характерен свой основной DFR-тип [6].
В настоящей публикации описано DFR-типи-рование набора штаммов Т pestis, выделенных преимущественно в природных очагах стран СНГ и Монголии.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В работе использовали 275 штаммов Т pestis. DFR-профили 205 штаммов определены в настоящем исследовании экспериментально, аналогичные данные о 48 штаммах взяты из работы [6], а DFR-профили 22 штаммов Т pestis и штамма Т pseudotuberculosis 1Р32953 получены в результате анализа т silico полногеномных нуклеотидных последовательностей, доступных в Интернете. Так как DFR01, DFR02 и DFR03 входят в состав плазмиды pFra [8], то для генотипирования использовали только штаммы, содержащие эту плазмиду. Бактерии выращивали на агаре Хоттингера с добавлением 1 % гемолизированной крови в течение 48 ч при температуре 28 °С. Геномную ДНК выделяли в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганиз-
мами I-II групп патогенности» с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК из биопроб производства НПФ «Литех».
Праймеры и ПЦР. Последовательности 23 пар DFR-праймеров и pFra-специфичных праймеров, а также условия проведения ПЦР детально описаны Y.Li et al. [6].
Анализ результатов. DFR-анализ штаммов
Y pestis проводили, как описано ранее [6]. Положительные и отрицательные результаты амплификации фиксируют как «1» и «0» соответственно, что
свидетельствует о наличии или отсутствии определенного DFR. Полученные результаты вносят в базу данных программы Bionumerics 5.1 (Applied Math NV, Бельгия). Для построения дендрограмм используют метод Neighbor-Joining с коэффициентом Dice для бинарных данных с представлением отдельных DFR-профилей в виде кубиков. При построении дерева в качестве корневого вида использовали штамм
Y pseudotuberculosis IP32953. Наименования природных очагов чумы даны в соответствии с публикациями [2, 6].
Рис. і. NJ-дендрограмма и DFR-профили 9б геномоваров Y. pestis:
gv - геномовар; bv - биовар; ANT - antiqua (заглавные буквы обозначают, что геномовар описан ранее); INT- intermedium; med - medievalis; mic -microtus; ori - orientalis; ssp - подвид (обозначены первой буквой названий, а в случае subsp. angola — двумя первыми буквами); no - количество штаммов, проанализированных в нашей работе; ? - нет данных. Черные квадраты указывают на наличие DFR (Yersinia DFR Оі-23)
Результаты и обсуждение
На основании анализа DFR-профилей 275 штаммов Y. pestis нам удалось подразделить все исследованные к настоящему моменту изоляты на 96 DFR-типов (64 из них описаны нами впервые). На территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют, как минимум, 56 геномоваров. DFR-профили и NJ-дендрограмма 96 геномоваров представлены на рис. 1. Большинство геномоваров вошли в состав трех кластеров: A, B и C [6], соответствующих основным ветвям 1, 2 и 0 дендрограммы, построенной M.Achtman et al. [1] на основании данных SNP- и ISyOO-типирования. Более поздняя версия SNP-дендрограммы, по данным A.Derbise et al. [3], представлена на рис. 2. В нашем исследовании вне кластеров остался африканский «полевочий» штамм subsp. angola - Angola, что может свидетельствовать как о его относительно древнем происхождении, так и об отсутствии среди анализируемых изолятов других филогенетически близких ему штаммов. Как и в публикации наших китайских коллег [6], все штаммы биовара orientalis (24 штамма в составе 10 гено-моваров) вошли в состав кластера A/1, все штаммы биовара medievalis (98 штаммов в составе 29 гено-моваров) - в кластер B/2, а представители биова-ра microtus (неосновные подвиды Y pestis [5]) (91 штамм в составе 27 геномоваров), за исключением геномовара 85, представленного штаммом Angola, -в кластер C/0. Штаммы биовара antiqua (64 штамма в составе 29 геномоваров) распределились по различным ветвям кластеров A/1, B/2 и C/0.
В состав кластера B/2 входят две основные ветви (рис. 1). Одна из ветвей соответствует ветви 2.ANT на рис. 2 и представлена в основном геномоварами, циркулирующими на территориях Китая и Монголии (например, 10-13, 26-28, 62 и др.), а также геномо-варом 19 - основным DFR-типом в граничащем с Китаем и Монголией природном очаге 38 и минорным для Монголии, Китая и Непала, а также отдаленно расположенного Центрально-Кавказского высокогорного очага. В эту же ветвь входят минорные геномовары 57 и 59 из природного очага 1.
Вторая ветвь соответствует ветви 2.MED на
Рис. 2. Дендрограмма микроэволюции 21 штамма Y. pestis по данным SNP типирования [4]
рис. 2 и образована, в основном, DFR-типами, характерными для природных очагов стран СНГ. Она включает геномовар 15 - основной DFR-тип штаммов биовара medievalis, циркулирующих в природных очагах Средней Азии.
Все изученные нами штаммы биовара orientalis вошли в состав кластера A/1 и были выделены за пределами СНГ, Монголии и Китая. В этот же кластер вошли штаммы биовара antiqua, циркулирующие на территории Монголии (геномовар 01b (минорный DFR-тип для китайских очагов B1, C, D, G и K2) - четыре штамма, геномовар 62 - один штамм) и стран СНГ в природных очагах: 31 (основной для соседнего китайского очага A [6] геномовар 04 -один штамм), 33 (геномовар 60, отличающийся от геномовара 04 отсутствием DFR18, - один штамм) и 37 (геномовар 61 - девять штаммов, геномовар 01b - один штамм), 40 (геномовар 01b - два штамма, геномовар 04 - один штамм, геномовар 93 - один штамм, 94 - один штамм), 46 (геномовар 01b - один штамм). В состав этого кластера входят и штаммы геномовара 03 биовара intermedium, циркулирующие в китайском очаге B3. Кластер включает две основные ветви, одна из которых (DFR-типы: 07-09, 32-35, 56, 86-89) соответствует ветви 1.ORI на рис. 2, а остальные геномовары в составе второй ветви - 1.ANT.
Кластер C/0 формировали две основные ветви (рис. 1), одна из которых включала геномовар 90 (ветвь 0.PE2 на рис. 2), а вторая DFR-типы 14 и 80 (ветвь 0.PE4 на рис. 2).
В 0.PE2 ветвь, кроме DFR-типа 90, входили геномовары: 24 (минорный геномовар штаммов bv. antiqua subsp. pestis из китайского очага C; основной -для subsp. ulegeica (семь штаммов из Монголии) и минорный для subsp. caucasica (по одному штамму из очагов 5 и 7)); 63, 67, 70, 71, 74, 72, 76 (по одному штамму subsp. caucasica из очагов 6, 7, 4, 4, 39, 39, 5 соответственно); 64 (по одному штамму subsp. caucasica из очагов 6 и 7), 92 (пять штаммов из очага 39) и основной для очага 39 геномовар 73 (семь штаммов subsp. caucasica).
Ветвь 0.PE4 более разнообразна по входящим в нее подвидам. Сюда вошли геномовары 62, 23, 30 основного подвида биовара antiqua из Монголии и Китая. Большинство входящих в группу 0.PE4 штаммов биовара microtus обладало DFR-типом 14 - основным геномоваром китайских подвидов qinghaiensis и xilingolensis, который также оказался характерным для трех монгольских штаммов, относимых к подвиду altaica. В случае выявления близкого родства этих штаммов и с помощью других методов молекулярного типирования следует поставить вопрос о тщательной проверке всех коллекционных штаммов подвида altaica, выделенных в Монголии, на предмет их перевода в соответствующий внутривидовой таксон. Геномовар 80 - основной для штаммов подвида altaica, выделенных в очаге 36 (12 штаммов) и в Монголии (один штамм). К этому же
геномовару относится и единственный в нашем исследовании представитель подвида talassica A-1820. Штамм Pestoides A относится к этому же DFR-типу и, вероятно, является представителем подвида alta-ica или talassica. Штаммы subsp. caucasica геномо-вара 69 циркулируют в очагах 4 (два штамма), 5 (два штамма) и 7 (один штамм). Остальные входящие в ветвь 0.PE4 геномовары представлены одним - двумя штаммами подвидов hissarica, altaica, caucasica и ulegeica.
Таким образом, определение профилей 23 DFR позволило сгруппировать 275 штаммов
Y pestis в 96 геномоваров. Для штаммов биоваров orientalis, medievalis и microtus характерны биовар-специфичные DFR-профили, и каждый из биоваров образует свой отдельный кластер. В то же время штаммы разных геномоваров биовара antiqua распределены по различным ветвям кластеров A/1, B/2 и C/0. Маловероятно, что совпадение DFR-типов (03 и 24) у штаммов из географически изолированных природных очагов и разных внутривидовых групп (рис. 1) связано с их заносом с одной территории на другую. Скорее это совпадение можно объяснить независимой утратой амплифицируемых локусов или участков «посадки» праймеров и даже ошибками, допущенными при проведении коллекционной работы со штаммами. С другой стороны, совпадение DFR-типов у представителей фенотипически близких подвидов xilingolensis и qinghaiensis (DFR14), а также al-taica и talassica (DFR30) [5] может свидетельствовать и об их близком генетическом родстве. Верификация полученных нами результатов с помощью других методов мультилокусного генотипирования (MLVA, CRISPR-типирование и др.) поможет ответить на эти вопросы. Косвенным подтверждением высокой разрешающей способности метода молекулярного типирования с использованием 23 DFR-локусов и корректности распределения отдельных внутривидовых групп Y. pestis по кластерам и отдельным ветвям дендрограммы является недавняя публикация G.Morelli et al. [7], в которой сходное по структуре филогенетическое дерево для 282 штаммов Y pestis было построено на основании типирования по 933 SNP-локусам. И на их филограмме значительное разнообразие характерно именно для входящих в состав ветви 0 наиболее древних внутривидовых групп Y. pestis.
Работа выполнена по государственному контракту № 53-Д от 29.06.2010 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».
Выражаем глубокую благодарность Иркутскому научно-исследовательскому противочумному институту Сибири и Дальнего Востока за предоставленные штаммы возбудителя чумы (использованные ранее в совместных исследованиях по мультилокусному VNTR-типированию).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Achtman M., Morelli G., Zhu P., Wirth T., Diehl I., Kusecek B. et al. Microevolution and history of the plague bacillus, Yersinia pestis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 10Г(5Г):17837-42.
2. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. Clin. Microbiol. Rev. 2004; 17(2):434-64.
3. Derbise A., Chenal-Francisque V., Huon C., Fayolle C., Demeure C.E., Chane-Woon-Ming B. et al. Delineation and analysis of chromosomal regions specifying Yersinia pestis. Infect. Immun. 2010; 78(9):3930-41.
4. Foley S.L., Lynne A.M., NayakR. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of Gram-negative bacterial foodborne pathogens. Infect. Genet. Evol. 2009; 9(4):430-40.
5. Li Y., Cui Y., Hauck Y., PlatonovM.E., Dai E., Song Y. et al. Genotyping and phylogenetic analysis of Yersinia pestis by MLVA: insights into the worldWide expansion of Central Asia plague foci. PLoS ONE 2009; 4(6):e6000.
6. Li Y., Dai E., Cui Y., Li M., Zhang Y., Wu M. et al. Different region analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China. PLoS One 2008; 3(5):e2166.
7. Morelli G., Song Y., Mazzoni C.J., EppingerM., Roumagnac P., Wagner D.M. et al. Yersinia pestis genome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity. Nat. Genet. 2010; 42(12):1140-3.
8. Zhou D., Han Y., Song Y., Tong Z., Wang J., Guo Z. et al. DNA microarray analysis of genome dynamics in Yersinia pestis: insights into bacterial genome microevolution and niche adaptation. J. Bacteriol. 2004; 186(15):5138-46.
Authors:
Platonov M.E., Evseeva V.V., Chirkova E.V., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russia. E-mail: info@obolensk.org
Efremenko D.V., Kuznetsova I.V., Kulichenko A.N. Stavropol Research Anti-Plague Institute. Sovetskaya St., 13-15, Stavropol, 355035, Russia. E-mail: snipchi@mail.stv.ru
Об авторах:
Платонов М.Е., Евсеева В.В., Чиркова Е.В., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. 142279, Оболенск, Московская обл. E-mail: platonov@obolensk.org
Ефременко Д.В., Кузнецова И.В., Куличенко А.Н. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15. E-mail: snipchi@mail.stv.ru
Поступила 02.02.11.
