CC BY
21
Действие препарата Стимфорте на основные проявления воспаления при заражении экспериментальных животных вирусов простого герпеса I
Д. Г. МАЛЬДОВ', Г. А. ГАЛЕГОВ2, В. Л. АНДРОНОВА2, А. В. ИЛЬИЧЕВ', А. П. БЕЛЬКОВ'
' ЗАО «Скай ЛТД», Москва
2 ФГБУ Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского МЗ, Москва
Stimforte Action on the Main Inflammation Characteristics in Experimental Animals Contaminated by Herpes simplex-1
D. G. MALDOV, G. A. GALEGOV, V. L. ANDRONOVA, A. V. ILICHEV, A. P. BELKOV Sky Co., Ltd, Moscow
D. I. Ivanovsky Institute of Virology, Moscow
При заражении мышей вирусом простого герпеса (ВПГ-1) в мозгу и лёгких инфицированных животных наблюдается резкое увеличение количества окрашиваемых тиобарбитуровой кислотой продуктов окисления липидов и проте-олитической активности, что свидетельствует о протекании воспалительного процесса. Препарат Стимфорте снижает эти показатели воспаления до уровня, близкого таковому в мозгу незаражённых животных. Вместе с тем препарат вызывает снижение титра вируса в мозгу, лёгких и сыворотке крови у инфицированных животных и купирует инфекционный процесс благодаря стимуляции иммунной системы. Обсуждается механизм ингибирования воспалительного процесса.
Ключевые слова: экспериментальные животные, вирус простого герпеса, Стимфорте.
In the brain and lungs of the experimental animals contaminated by Herpes simplex-1 there were detected much higher levels of the thiobarbituric acid-stained lipid oxidation products and proteolytic activity, evident of the inflammation process. Stimforte lowered the inflammation indices to the level, close to that in the brain of the noninfected animals. Yet the drug provided lower titers of the virus in the brain, lungs and serum in the contaminated animals and arrested the infection process by stimulation of the immune system. The mechanism of the inflammation suppression is discussed.
Key words: experimental animals, Herpes simplex, Stimforte.
Введение
При заражении вирусами экспериментальных животных, как правило, в области развития инфекционного процесса наблюдается воспаление, которое сопровождается оксидативным стрессом [1]. Такого рода реакция характерна для инфекций, вызванных всеми типами ДНК-содержащих и РНК-содержащих вирусов [1]
Сильный оксидативный стресс характеризуется возрастанием количества активных соединений кислорода и нитросоединений. Данные соединения определяют чувствительность клеток к вирусной репликации, регулируют воспалительный процесс, иммунный ответ и поражают как вирус, так и клетки хозяина [2]. Богатая липида-ми нервная система наиболее чувствительна к образованию липидных перекисей. Её поражение
© Коллектив авторов, 2014
Адрес для корреспонденции: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16. Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского
активным кислородом наиболее характерно для остропротекающего энцефалита, вызываемого вирусом простого герпеса типа I (ВПГ-1) и рео-вирусами. Причём продукция активного кислорода происходит в самих клетках нервной системы. При определении оксидативных процессов, происходящих в нервных клетках (эмбриональной карциномы Р19), методом детекции флюоресцирующих продуктов перекисей липидов было установлено, что заражение ВПГ-1 вызывает в этих клетках оксидативный стресс [3].
Другой непременный признак воспаления — повышенная протеазная активность в зоне воспаления. Для ВПГ-1 показана активация металло-протеаз [4]. Главным образом в этом процессе участвуют сериновые протеазы гранул нейтрофилов.
Ранее нами было показано, что препарат Стимфорте является иммуностимулятором и активирует как НАДФН-оксигеназу нейтрофилов, так и экскрецию материала гранул этих клеток [5, 6]. Целью данного исследования было изучение
влияния герпесвирусной инфекции на развитие оксидативного стресса и протеолитической активности в различных органах и тканях инфицированных животных, а также влияние на эти процессы препарата Стимфорте. Ингибирование этих процессов в данном случае может служить маркёром подавления репродукции вируса в поражённых органах.
Материал и методы
Стимфорте — иммуномодулирующий препарат животного происхождения, являющийся природным конгломератом из 20 веществ. По данным гель- и ультрафильтрации, а также масс-спектрометрии молекулярная масса составляет 800-1300 Да. Препарат стимулирует выделение активного кислорода нейтрофилами, экскрецию гранул, фагоцитоз и Т- клеточный иммунный ответ [5, 6].
Вирусы. В работе использовали эталонный штамм вируса герпеса простого тип 1 (ВПГ-1) штамм L2, полученный из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, адаптированный к мозгу мышей.
Мыши. В исследовании использовали самцов белых линейных мышей BALB/c весом 12—14 г по 18 (15+3) животных в группе, полученных из питомника «Столбовая» (пос. Столбовая, Московская обл.). Мышей заражали внутрибрюшин-но. Доза вируса составляет 5х103 БОЕ /0,2 мл на мышь, которая обеспечивала летальность животных (53,33%) в контрольной нелеченой группе. Препараты вводили внутри-брюшинно в объёме 0,2 мл двукратно: через 24 и 72 ч после заражения животных в разовой дозе 100 мкг/мышь.
Защитное действие препарата in vivo оценивали по снижению смертности животных и увеличению средней продолжительности жизни (СПЖ) в опытных группах по сравнению с контрольной. Срок наблюдения за животными составлял 14 суток.
Определение величины инфекционного титра вируса в органном материале. По 3 мыши из каждой группы забивали на 4-е сутки после заражения, органный материал (головной мозг, лёгкие) гомогенизировали при температуре 4°С и готовили 10% суспензию в изотоническом растворе хлорида натрия. Инфекционный титр в супернатанте (условия центрифугирования: 5000 об/мин в течение 10 мин, 4°С) и сыворотке крови инфицированных животных определяли путём титрования в культуре клеток в соответствии с методом бляшкооб-разования [7].
Активность протеаз. 10% суспензии органного материала в фосфатном буфере (рН 7,2) центрифугировали при 6000 об/мин. 20 мкл супернатанта смешивали с 20 мкл субстрата, добавляли 2 мкл 100 мМ раствора NN3 и инкубировали в течение 3 суток при 37°С. Определение протеазной активности производилось флуоресцентным методом по S. S. Twining [8], как описано ранее [5]. Использовали казеин, флуоресцеин изотиоцианат фирмы Sigma (Германия), спектрофлуориметр Shimadzu RF-1501 (Япония). Для калибровочной кривой использовали полностью лизированный трипсином казеин, меченный флуоресцеин изотиоцианатом.
Ингибиторный анализ. При некрозе тканей мозга, вызванном собственными протеазами, этот процесс осуществляется в основном тиоловыми (катепсины B и L) и аспарги-новыми протеазами (катепсин D), а при атаке клеток протеазами гранул клеток иммунной системы — сериновыми и металлопротеазами. Поэтому для выявления специфичности процесса некроза был проведён ингибиторный анализ. Для проведения анализа к препаратам, указанным выше, добавлялись: фенилметилсульфонила фторид (ФМСФ) фирмы Sigma — до концентрации 1 мМ в 2 мкл 96% этанола; лейпеп-тид фирмы Sigma — до концентрации 1 мМ в 2 мкл воды; пеп-статин фирмы Sigma — до концентрации 1 мМ в 2 мкл воды,
10
L
Г 9
Ь 7
- 5
S э
ffl
= 4
я
Е з
3 2
я * S
2 о
9,46
Кон три.
Kill'-!
ВПГ-1+Стнмф< >рте
Рис. 1. Количество ТБК-окрашенных продуктов в мозгу мышей, заражённых ВПП и леченных Стимфорте.
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) фирмы Sigma — до концентрации 50 мМ. Ингибирование протеаз определялось по стандартным методикам [9].
Оксвдативный стресс. Образование реактивных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК) выявляли в гомогенатах мозга методом [10] в модификации [11]. 1 мл гомогенатов тканей головного мозга с 0,5 мг белка смешивали с 1 мл смеси, содержавшей 0,67% тиобарбитуровую и 30% трихлоруксусную кислоты (в соотношении 1:1). Образцы нагревали в течение 20 мин при 100° и затем 15 мин центрифугировали при 5000 об/мин. Поглощение супернатанта определяли при 535 нм на спектрофотометре. Для вычислений использовали молярный коэффициент поглощения 8, равный 1,56 * 105 М-1 *см-1.
Результаты и обсуждение
Конечными стабильными (в течение нескольких суток) продуктами окисления липидов являются малоновый альдегид и сходные с ним продукты, окрашиваемые тиобарбитуровой кислотой (ТБК-окрашиваемые продукты). Заражение мышей ВПГ-1 вызывало резкое увеличение количества ТБК-окрашиваемых продуктов в мозге животных (9,46±3,86 нМ/ мг белка по малоновому альдегиду) во время пика заболевания (на 6-е сутки) по сравнению с соответствующим показателем для группы неинфицированных животных — 3,49+0,11 нМ/мг белка, принятым в наших исследованиях за норму (рис. 1). Это указывает на значительный оксидативный стресс в тканях заражённых животных, приведший к образованию большого количества окисленных продуктов. В группе животных, получавших иммуностимулятор Стимфорте, количество ТБК-окрашиваемых продуктов в мозгу мышей не превышало нормы — 3,26+0,08.
Аналогичные результаты были получены при изучении лёгких мышей (рис. 2). При этом усиление образования продуктов окисления липидов у инфицированых мышей было менее выражено, по сравнению с неинфицированными, чем в головном мозге — всего в 1,5 раза. При введении
Таблица 1. Влияние Стимфорте на репродукцию ВПГ-1 в различных органах и тканях белых мышей BALB/c
Препарат Инфекционный титр вируса, ^ БОЕ/мл
головной мозг лёгкие кровь
Контроль вируса (п=3) 3,40 2,30 1,65
3,54 1,70 1,74
3,60 2,18 1,54
Тср 3,51+0,01 Тср 2,06+0,40 Тср 1,65+0,06
Стимфорте старый (п=3) 2,30 0,70 0,70
2,30 1,00 1,00
1,70 1,30 0,70
Тср 2,10+0,20 Тср 1,00+0,22 Тср 0,80+0,10
Стимфорте новый (п=3) 2,30 0,70 0
2,40 1,40 1,00
2,18 1,00 0,70
Тср 2,29+0,06 Тср 1,03+0,20 Тср 0,57+0,30
Рис. 2. Количество ТБК-окрашенных продуктов в лёгких мышей, заражённых ВПГ-1 и леченных Стимфорте.
и н
Э 7
1 I 6 - £
9 Я а
3 2 = | *
2 я - -
11 а ¡2 I и
_г __т _
1
3 7,15
Рис. 4. Количество лизированного белка при протео-лизе в лёгких мышей, зараженных ВПГ-1 и леченных Стимфорте.
Рис. 3. Количество лизированного белка при протео-лизе в мозге мышей, заражённых ВПГ-1 и леченных Стимфорте.
Стимфорте количество ТБК-окрашиваемых продуктов также не превышало норму. Полученные данные согласуются с результатами изучения репродукции ВПГ в мозге и лёгких инфицированных животных (табл. 1). В мозге репродукция ви-
руса протекает эффективнее, о чем свидетельствует величина инфекционного титра.
Протеолиз казеина в мозге заражённых мышей во время пика заболевания (на 6-е сутки) почти в 2.5 раза выше, чем в мозге контрольных мышей (рис. 3): 3,0±0,835 и 7,15±0,35 нг/мкг го-могената в 1 час соответственно. При введении им Стимфорте протеолитическая активность значительно снижается и достигает нормы (2,85+1,65). В лёгких мышей, которые также поражаются при герпесвирусной инфекции, наблюдаемое усиление протеолиза значительно слабее, чем в мозге (рис. 4). При введении Стимфорте количество ТБК-окрашенных продуктов также снижается до нормы. Таким образом, Стимфорте оказывает противовоспалительное действие, понижая в мозге заражённых мышей как окислительные процессы, так и протеолитическую активность.
Таблица 2. Результаты ингибиторного анализа протеазной активности (в %) в лёгких мышей
Показатель Контроль ВПГ-1 ВПГ-1 + Стимфорте
Без ингибиторов 0 0 0
ФМСФ 42 43 41
Лейпептин 20 29 26
Пепстатин 20 33 27
ЭДТА 27 36 33
Таблица 3. Влияние препаратов Стимфорте на развитие инфекционного процесса ВПГ-1 в различных орга-
нах и тканях белых мышей BALB/c
Препараты Смертность Защита в % от контроля СПЖ, сутки
отношение числа погибших животных % погибших
к общему числу животных в группе животных
Контроль вируса 8/15 53,33 — 12,07+2,24
Стимфорте * 6/15 40,00 13,33 15,00+1,97
Стимфорте ** 7/15 46,67 6,66 14,27+1,94
Примечание. * - опытно-промышленная партия V; ** - опытно-промышленная партия !Х. Партия !Х проходит по всем критериям (индукция фактора некроза опухолей и интерлейкина 1в [12], стимуляция активности 1\1Д0РН-зависи-мой оксигеназы нейтрофилов[6], торможение роста миеломы) по минимуму, наиболее активная по тем же критериям из полученных партий - партия V.
Изменяются и типы протеаз: кроме ингиби-руемых ФМСФ и ЭДТА сериновых и металло-протеаз, активация которых наблюдается при воспалительных процессах при заражении ВПГ-1 под влиянием иммунной системы, выявляются характерные для лизосом тиоловые протеазы, ин-гибируемые лейпептином, и ингибируемые пеп-статином аспарагиновые протеазы (табл. 2). Следовательно, поражение мозга и лёгких ВПГ-1 сопровождается некрозом ткани. Добавление Стимфорте значительно снижает выраженность некротического процесса.
Так как Стимфорте снимает признаки воспаления, можно было ожидать и усиления инфекционного процесса. Однако при введении Стимфорте наблюдалось ингибирование репродукции вируса (статистически значимое снижение титра в мозге, лёгких и сыворотке крови) по сравнению с контрольной группой (см. табл. 1) и соответственно увеличение как продолжительности жизни, так и количества выживших животных (табл. 3), что указывает на подавление инфекционного процесса.
Если благотворное действие Стимфорте на остроту течения заболевания можно объяснить ослаблением воспалительных процессов, то снижение титра вируса в органном материале инфицированных животных может быть результатом иммуностимулирующего действия препарата, так как собственным этиотропным противовирусным действием Стимфорте не обладает. При пассировании ВПГ-1 на клетках vero, ингибирование процесса репликации этого вируса (по показателю БОЕ/мл) в присутствии Стимфорте (100 мкг/мл) не превышает 15%. Таким образом, Стимфорте действует одновременно как иммуностимулятор и как противовоспалительное
средство. Естественно, действия эти обуславливаются различными механизмами.
В самых общих чертах механизм токсического действия ВПГ-1 in vivo состоит в следующем. В мозге инфицированных экспериментальных животных активизируется синтез хинолиновой кислоты, под действием которой поражается гипо-камп [13]. Непосредственное введение животным антиоксидантов (мелатонина и изопренила) [14], одновременно с хинолиновой кислотой препятствует этому токсическому действию, причём авторами доказан нерецепторный путь действия обоих препаратов. Поражающее действие ВПГ ослабляется при высоком содержании в питании мышей обладающего антиоксидантным действием витамина Е и значительно усиливается при дефиците этого витамина [15], что также указывает на то, что основным поражающим действием обладают в данном случае кислородные радикалы.
Кроме антиоксидантов, токсическое действие ВПГ-1 снимается препаратом ацикловир (Зови-ракс), оказывающего этиотропное противовирусное действие (непосредственно ингибирует репликацию вирусной ДНК). Действие ацикловира носит дозозависимый характер [16] и проявляется в блокировании процессов разрушения гипо-кампа, что указывает на то, что воздействие на репликацию ВПГ не менее эффективно, чем на сам процесс оксидативного стресса.
Другой возможный механизм действия Стим-форте может быть связан с TLR 4 (основа действия Стимфорте [11]), как это показано для TLR 2 и TLR 4 в эпителии поджелудочной железы [17].
Причиной снижения выраженности воспалительных процессов и снижения риска их развития может быть активность ряда цитокинов, таких как IL5 [18] и IL10 [19]. Стимфорте явля-
ется индуктором не только провоспалительных цитокинов, но и IL10. Кроме того, при клинических испытаниях Стимфорте было показано быстрое снятие воспаления в группе пациентов с рецидивирующим герпесом, получавших препарат [20]. Таким образом, применение Стим-
ЛИТЕРАТУРА
1. Schwarz KB. Oxidative stress during viral infection. Free Radic Biol Med 1996; 21: 5: 641-649.
2. Valyi-Nagy T., Dermody T.S. Role of oxidative damage in the pathogenesis of viral infections of the nervous system. Histol Histopathol 2005; 20: 3: 957-967.
3. Kavouras J.H., Prandovszky E, Valyi-Nagy K, Kovacs S.K., Tiwari V., Kovacs M., Shukla D, Valyi-Nagy T. Herpes simplex virus type 1 infection induces oxidative stress and the release of bioactive lipid peroxidation by-products in mouse P19N neural cell cultures. J Neurovirol 2007; 13: 5: 416-425.
4. Pham C. T. N. Neutrophil serine proteases fine-tune the inflammatory response. Int J Biochem Cell Biol 2008; 40: 6-7: 1317-1333.
5. Ильичев A.B., Бельков А.П., Малъдов Д.Г., Асташкин Е.И. Секреция гранул нейтрофилов человека под действием формил пептида и препарата «Стимфорте». Иммунология 2009; 3: 159—161
6. Малъдов Д.Г., Бельков А.П., Ильичев A.B., Асташкин Е.И. Влияние комплексного гидрофильного низкомолекулярного препарата «Стимфорте» на функциональную активность фагоцитов крови человека. Иммунология 2009; 2: 95-97.
7. Sarisky R.T., Nguyen T.T., Duffy K.E., Wittrock R.J., Leary J.J. Difference in incidence of spontaneous mutations between Herpes simplex virus types 1 and 2. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 6: 1524-1529.
8. Twining S.S. Fluorescent isothiocyanate-labeled casein assay for proteolytic enzymes. Anal Biochem 1984; 143: 1: 30—34.
9. Ramachandran R, Hollenberg M.D. Proteinases and signalling: patho-physiological and therapeutic implications via PARs and more. Br J Pharmacol 2008; 153: S1: S263-S282.
10. Buege J.A., Aust S.D. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol 1978; 52: 302-310.
11. Малъдов Д.Г., Чирвон Е.А., Ильичев A.B., Бабаян С.С. Активация препаратом «Стимфорте» моноцитов и макрофагов. Иммунология 2011; 4: 105-112.
форте, особенно с учётом чрезвычайно широкого распространения герпесвирусных инфекций и лёгкости развития их хронизации, обеспечивает не только непосредственный лечебный эффект, но и предотвращает развитие тяжёлых осложнений.
12. Дерябин П.Г, Исаева Е.И., Малъдов Д.Г., Ильичев A.B., Пичугина Л.В., Львов Д.К. Действие Стимфорте на устойчивый к интерферону генотип штамма вируса гепатита С. Вопр вирусологии 2009; 2: 17—20.
13. Stone T.W., Behan W.M., MacDonald M, Darlington L.G. Possible mediation of quinolinic acid-induced hippocampal damage by reactive oxygen species. Amino Acids. 2000; 19: 1: 275—281.
14. Behan W.M., McDonald M, Darlington L.G., Stone T.W. Oxidative stress as a mechanism for quinolinic acid-induced hippocampal damage: protection by melatonin and deprenyl. Br J Pharmacol 1999; 128: 8: 1754—1760.
15. Sheridan P.A., Beck M.A. The immune response to Herpes simplex virus encephalitis in mice is modulated by dietary vitamin E. J Nutr 2008; 138: 1: 130—137.
16. Müller A.C., Maharaj H., Maharaj D.S., Daya S. Aciclovir protects against quinolinic acid-induced oxidative neurotoxicity. J Pharm Pharmacol 2005; 57: 7: 883—888.
17. Messlik A., Schmechel S., Kisling S., Bereswill S., Heimesaat M.M., Fischer A., Göbel U., Haller D. Loss of Toll-like receptor 2 and 4 leads to differential induction of endoplasmic reticulum stress and proapoptotic responses in the intestinal epithelium under conditions of chronic inflammation. J Proteome Res 2009; 8: 10: 4406—4417.
18. Chandler W. L, Loo S.-C., Nguyen S.V., Schmer G, Stratton JR. Standardization of methods for measuring plasminogen activator inhibitor activity in human plasma. Clin Chem 1989; 35: 5: 787—793.
19. Caligiuri G., RudlingM., Ollivier V., Jacob M.P., Michel J.B., Hansson G.K., Nicoletti A. Interleukin-10 deficiency increases atherosclerosis, thrombosis, and low-density lipoproteins in apolipoprotein E knockout mice. Mol Med 2003; 9: 1—2: 10—17.
20. Зыкова И.Н., Шулъженко A. Е., Пинегин Б.В., Малъдов Д.Г., Ильичев A.B. Применение препарата «Стимфорте» в комплексной терапии рецидивирующей герпес-вирусной инфекции. Герпес 2009; 2: 30—36.
