CC BY
71
Обмен опытом
С.С. Григорян, А.М. Иванова
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва
Действие пидотимода на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов ex vivo
Контактная информация:
Григорян Седа Суреновна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией индукторов интерферона ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России
Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, тел.: (499) 193-55-66, e-mail: grig-seda@yandex.ru Статья поступила: 28.06.2011 г., принята к печати: 22.08.2011 г.
Пидотимод — пероральный иммуномодулятор, эффективность которого у детей с респираторными инфекциями обусловлена активацией различных звеньев иммунной системы. Представлены результаты исследования, в котором изучалось действие пидотимода на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов лейкоцитами цельной крови часто болеющих детей (ЧБД). Исследования проводились ex vivo с использованием 15 образцов цельной крови ЧБД в возрасте 4 лет. Определяли показатели интерферонового (ИФН) статуса, чувствительность к пидотимоду, содержание провоспалительных (ИФН у, интерлейкин [ИЛ] 1S) и противовоспалительных (ИЛ 4, 10) цитокинов до и после обработки образцов крови препаратом. Показано, что пидотимод ex vivo вызывал более чем 4-кратное повышение изначально сниженной продукции ИФН у лейкоцитами цельной крови ЧБД (с 11,5 ± 3,4 до 51S ± S,3 ед/мл), не влияя на продукцию ими ИФН а (432 ± 49 и 44S ± 30 ед/мл — до и после обработки образцов крови препаратом, соответственно). В цельной крови ЧБД ex vivo препарат стимулировал продукцию ИФН у, содержание которого по сравнению со спонтанной его продукцией (без препарата) увеличивалось с 2,3 ± 0,9 до 11,S ± 1,6 пкг/мл, соответственно. Стимуляция фитогемагглютинин-индуцированной продукции ИФН у была менее выражена и в зависимости от срока экспозиции с препаратом увеличивалась в 1,5-2,5 раза по сравнению с индукцией синтеза ИФН у в отсутствии препарата. Под действием препарата отмечено повышение уровня ИЛ 1S (спонтанного — с 23,5 ± 3,5 до 49,1 ± 2,2 пкг/мл, индуцированного — с 34,2 ± 2,4 до 47S ± 4,4 пкг/мл) и ИЛ 10 (с 6,7 ± 1,3 до 15,5 ± 0,9 пкг/мл и с 20,6 ± 1,2 до 42,7 ± 2,5 пкг/мл, соответственно). Параллельно с увеличением продукции провоспалительных цитокинов под действием пидотимода отмечалось снижение уровня ИЛ 4, как спонтанного, так и индуцированного, с 2,6 ± 0S до 0,5 ± 0,2 пкг/мл и с 1,3 ± 0S до 0,6 ± 0,1 пкг/мл, соответственно. Таким образом, пидотимод ex vivo стимулирует синтез ИФН у, ИЛ 10 и 1S, а также приводит к снижению уровня ИЛ 4. Указанные эффекты способствуют активации Th1 иммунного ответа организма.
Ключевые слова: часто болеющие дети, цитокины, пидотимод.
S.S. Grigoryan, A.M. Ivanova
N.F. Gamaleya Scientific Center of Epidemiology and Microbiology, Moscow
Effect of pidotimod on production of pro- and anti-inflammatory cytokines ex vivo
Pidotimod is per oral immunomodulator; its efficacy is conditioned by activation of different components of immune system. The efficacy of pidotimod was studied in frequently sick children; its influence on the production of pro- and anti-inflammatory cytokines with leucocytes in peripheral blood was evaluated. The study was performed ex vivo with 15 samples of peripheral blood of frequently sick children 4 years old. The rate of interferon (IFN) status, sensitivity to pidotimod, concentration of pro-inflammatory (IFN y, Interleukin [Il] 18) and anti-inflammatory (Il 4, 10) cytokines were detected before and after processing the samples with the drug. Pidotimod ex vivo induced more than 4 times increase of initially low production of IFN y with leucocytes of peripheral blood (from 11.5 ± 3.4 to 51.8 ± 8.3 U/ml). It did not influence the production of IFN a (432 ± 49 and 448 ± 30 U/ml — before and after processing the samples correspondingly). The drug stimulated production of IFN y ex vivo; the concentration of IFN y compared to its spontaneous production increased from 2.3 ± 0.9 to 11.8 ± 1.6 picogram/ml correspondingly. Stimulation of PGA-induced production of IFN y was less expressed; it increased in correlation with the time of exposition 1.5-2.5 times higher compared to induction of IFN y synthesis without the drug. The drug favored to increase of Il 18 level (spontaneous — from 23.5 ± 3.5 to 49.1 ± 2.2 pg/ml, induced — from 34.2 ± 2.4 to 47.8 ± 4.4 pg/ml) and Il 10 (from 6.7 ± 1.3 to 15.5 ± 0.9 pg/ml and from 20.6 ± 1.2 to 42.7 ± 2.5 pg/ml correspondingly). As the production of cytokines increased because of pidotimod, the level of Il 4 (as spontaneous, as induced one) decreased from 2.6 ± 0.8 to 0.5 ± 0.2 pg/ml correspondingly. Thus, pidotimod ex vivo stimulates the synthesis of IFN y, Il 10 and 18 and decreases the level of Il 4. These effects favor to the activation of Th1 immune response of organism.
Key words: frequently sick children, cytokines, pidotimod.
129
Обмен опытом
130
Пидотимод — синтетическая дипептидная молекула, состоящая из 2 связанных иммуноактивных аминокислот: пироглутаминовой (5-оксипролин) и тиазолидин-карбоксиловой (тиопролин). Пидотимод является пероральным иммуномодулятором, один из немногих, отвечающий требованиям доказательной медицины и входящий в классификацию ВОЗ по показанию «иммунотерапия респираторных инфекций у детей».
Пидотимод детально изучен в доклинических исследованиях на моделях различных вирусных и бактериальных инфекций животных [1, 2] и в широкомасштабных международных контролируемых клинических и иммунологических исследованиях у детей и взрослых [3-5]. Исследования эффективности пидотимода выполнены и в различных регионах России на базе ведущих профильных медицинских университетов и центров здоровья с участием детей с рецидивирующими острыми респираторными заболеваниями [6-8].
В ряде научных публикаций, в том числе последних лет, было неоднократно показано, что фармакологическая активность пидотимода при различных формах инфекционной патологии опосредована его модулирующим действием как на врожденный, так и на адаптивный иммунный ответ. В основе этих эффектов — действие препарата на моноцитарно-макрофагальное звено иммунитета и активация основных антиген-представляющих дендритных клеток [9-11]. Вместе с тем участие пидотимода в направленной регуляции и коррекции Th1/Th2 иммунного ответа на различные инфекционные агенты остается малоизученным.
Цель исследования — изучить действие пидотимода в условиях ex vivo на продукцию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов лейкоцитами цельной крови часто болеющих детей (ЧБД).
Исследования проводились в лаборатории индукторов интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва) с использованием образов цельной крови ЧБД в возрасте 4 лет, поступавших из различных медицинских центров Москвы.
В исследованиях ex vivo пидотимод (Имунорикс, Эбботт Продактс) применяли в дозе 100 мкг/мл, что соответствует разовой дозе препарата, применяемой в педиатрической практике. Действие препарата на продукцию про-и противовоспалительных цитокинов оценивали через 24 ч после его добавления к образцам цельной крови при t 37°C в атмосфере с 5% СО2. Полученные показатели сравнивали со спонтанной продукцией цитокинов без предобработки препаратом. Фитогемагглютинин (ФГА)-индуцированную продукцию цитокинов определяли в отсутствии пидотимода, при его введении одновременно с ФГА и после 30-минутной предобработки образцов крови препаратом и последующим введением ФГА. Предварительно в образцах цельной крови ЧБД исследовали показатели интерферонового статуса и чувствительность лейкоцитов крови к пидотимоду по разработанной нами ранее методике [12, 13]. Интерфероновый статус анализировали по 4 основным показателям:
• уровню продукции лейкоцитами крови спонтанного ИФН 7 ex vivo при отсутствии какой-либо дополнительной индукции;
• уровню продукции лейкоцитами крови ИФН a ex vivo при его индукции эталонным индуктором ИФН a — вирусом болезни Ньюкасла (источник: музей вирусов Института вирусологии);
• уровню продукции лейкоцитами крови ИФН 7 ex vivo при его индукции эталонным индуктором — ФГА (Difco; США);
• количественному содержанию ИФН в сыворотке крови — уровню сывороточного ИФН.
Биологическую активность ИФН определяли общепринятым методом путем титрования в диплоидной культуре фибробластов эмбрионов человека. В качестве тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ВЭМ). За единицу активности ИФН (ед/мл) принимали величину, обратную его максимальному разведению, задерживающему цитопатическое действие ВЭМ на 50%. Результаты цитопатического действия ВЭМ оценивали с помощью инвертированного микроскопа.
Продукцию провоспалительных (ИФН 7, интерлейкина [ИЛ] 18) и противовоспалительных (ИЛ 4, 10) цитоки-нов лейкоцитами цельной крови ex vivo определяли методом иммуноферментного анализа с помощью имму-ноферментных тест-систем (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) в 3 повторах по прилагаемым инструкциям. При исследовании синтеза цитокинов определяли:
1) уровень продукции ИФН 7, ИЛ 18, 4, 10 лейкоцитами цельной крови ex vivo в отсутствии (спонтанный) и присутствии препарата пидотимод;
2) уровень ФГА-индуцированного синтеза ИФН 7, ИЛ 18, 4, 10 лейкоцитами цельной крови ex vivo в отсутствии и присутствии препарата пидотимод.
Обработка полученных данных выполнена с помощью пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc, США). При описании количественных признаков использовали среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение.
Всего в исследовании проанализированы 15 образцов крови ЧБД. Со слов родителей, частые острые респираторные инфекции отмечались у 7 пациентов, ринит и рино-фарингит — у 4, отит и фаринготонзиллит — по 2 случая каждого заболевания.
В исследовании ex vivo было установлено, что характерной особенностью ЧБД является низкая способность лейкоцитов крови продуцировать ИФН 7, средний уровень которого составил 11,5 ± 3,4 ед/мл (при норме 96,0 ± 32 ед/мл). ИФН a-синтетическая способность лейкоцитов цельной крови ЧБД определялась в среднем на уровне 432 ± 49 ед/мл (при норме 480 ± 160 ед/мл) и достигала в ряде наблюдений уровня верхней границы возрастной физиологической нормы [13]. Введение пидотимода в цельную кровь детей в условиях ex vivo в дозе 100 мкг/мл вызывало более чем 4-кратное повышение уровня продукции ИФН 7 — в среднем до 51,2 ± 8,3 ед/мл (рис. 1) и повышение продукции спонтанного ИФН 7 до 12,3 ± 0,1 ед/мл. Вместе с тем уровень продукции лейкоцитами крови ИФН а практически не изменялся (рис. 2).
Результаты проведенных исследований суммированы в табл. Показано, что пидотимод в цельной крови ЧБД ex vivo стимулирует продукцию ИФН 7, содержание кото-
Рис. і. Влияние пидотимода в условиях ex vivo на синтез интерферона у лейкоцитами цельной крови часто болеющих детей
Рис. 2. Влияние пидотимода в условиях ex vivo на синтез интерферона а лейкоцитами цельной крови часто болеющих детей
Ед/мл
140 -|
120 -100 -S0 B0 40 20 0
Норма До введения После введения
в ex vivo ex vivo
Имунорикса Имунорикса
Ед/мл
700 B00 500 400 300 200 100 0
432
Норма До введения После введения
в ex vivo ex vivo
Имунорикса Имунорикса
рого по сравнению со спонтанной его продукцией без препарата увеличивается в 5 раз. Вместе с тем стимуляция индуцированной продукции ИФН 7 с помощью ФГА приводила к менее выраженному ответу, интенсивность которого зависела от срока экспозиции с препаратом. В итоге было отмечено 1,5-2,5-кратное увеличение продукции ИФН 7 по сравнению с индукцией этого цитоки-на в отсутствии препарата. Пидотимод вызывал менее значительное увеличение продукции ИЛ 18 лейкоцитами цельной крови ЧБД, уровень которого (спонтанного и индуцированного) превышал таковой без препарата только в 2 и 1,3 раза, соответственно.
Параллельно с увеличением продукции провоспалитель-ных цитокинов под действием пидотимода происходило снижение продукции ИЛ 4, уровень которого, как спонтанный, так и индуцированный, снижался в 5 и 1,6-2,2 раза, соответственно. Вместе с тем спонтанный и индуцированный синтез другого противовоспалительного цитокина — ИЛ 10 под действием пидотимода ex vivo в цельной крови этих же детей повышался в среднем в 2 раза. Описанная закономерность повышения спонтанного и индуцированного синтеза ИФН 7, ИЛ 18, 10 и снижение синтеза ИЛ 4 определялась в пробах цельной крови: соответственно, 73 и 93, 67 и 87, 100 и 93, 93 и 87% ЧБД.
131
Особенностью интерферонового статуса ЧБД, образцы крови которых изучали в настоящем исследовании, явился низкий уровень продукции лейкоцитами крови ИФН 7, ключевого цитокина, характеризующего напряженность Т1п1-клеточного противовирусного иммунного ответа. Подобное состояние иммунной системы свидетельствует о снижение врожденной противовирусной и противоинфекционной резистентности ЧБД, способствует их повышенной восприимчивости к различным инфекционным агентам, повторному и затяжному течению заболеваний.
В условиях ex vivo пидотимод продемонстрировал корригирующее действие только на ослабленное ИФН 7-про-дуцирующее звено иммунной системы, не затрагивая процесса синтеза ИФН а, что является показателем выраженной чувствительности лейкоцитов крови ЧБД к препарату пидотимод. Кроме того, пидотимод в условиях ex vivo повышал ИФН 7-продуцирующую способность лейкоцитов крови в среднем в 2 раза, вызывая, кроме того, 5-кратную стимуляцию образования ИФН 7, источником которого, как известно, являются NK клетки, дендритные клетки, CD4+ и CD8+ лимфоциты. Повышение под действием препарата уровня продукции другого провоспалительного цитокина —
Таблица. Спонтанная и индуцированная продукция про- и противовоспалительных цитокинов лейкоцитами цельной крови часто болеющих детей (п = 15) под действием пидотимода (100 мкг/мл)
Цитокин, пкг/мл Спонтанный + пидотимод + ФГА ФГА + пидотимод Пидотимод (ЗО мин) + ФГА
ИФН у 2,3 і 0,9 11,8 і 1,6 32,2 і 1,2 48,2 і 2,1 80,9 і 2,0
ИЛ 18 23,5 і 3,5 49,1 і 2,2 34,2 і 2,4 39,8 і 3,2 47,8 і 4,4
ИЛ 4 2,6 і 0,8 0,5 і 0,2 1,3 і 0,8 0,8 і 0,6 0,6 і 0,1
ИЛ 10 6,7 і 1,3 15,5 і 0,9 20,6 і 1,2 39,8 і 2,9 42,7 і 2,5
Примечание. ФГА — фитогемагглютинин; ИФН — интерферон; ИЛ — интерлейкин.
ВОПРОСЫ СОВРЕМЕННОЙ ПЕДИАТРИИ /2011/ ТОМ 10/ № 4
Обмен опытом
132
ИЛ 18 свидетельствует об активации под действием пидотимода Т1п1-связанного противовирусного иммунного ответа и повышении резистентности организма в целом [14, 15].
Наряду со стимуляцией продукции Th1 цитокинов — ИФН 7 и ИЛ 18 пидотимод в условиях ex vivo подавлял продукцию ключевого противовоспалительного цитоки-на — ИЛ 4, источником которого являются преимущественно Th2 лимфоциты. Этот результат указывает на то, что суммарный эффект при назначении пидотимода ЧБД выражается в стимуляции Th1 (противовирусного) и подавлении Th2 (аллергического) иммунных ответов.
Однако, под влиянием пидотимода в образцах цельной крови ЧБД было зафиксировано увеличение синтеза противовоспалительного цитокина — ИЛ 10, источником которого в основном являются Т-регуляторные и В лимфоциты, NK и дендритные клетки, моноциты, макрофаги и тучные клетки. Являясь ключевым регуляторным цитокином Th1 и Th2 эффекторных звеньев иммунных ответов, ИЛ 10 подавляет экспрессию большинства про-воспалительных цитокинов и опосредует толерантность к аллергенам [16]. Стимуляция синтеза ИЛ 10, как показали наши исследования, ограничивает и предупреждает
гиперпродукцию провоспалительных цитокинов ИФН 7 и ИЛ 18, т.е. оказывает, с одной стороны, противовоспалительное действие, с другой — препятствует развитию изначально имеющихся в анамнезе возможных аллергических синдромов.
Заключение
У ЧБД независимо от клинических проявлений заболевания определяется недостаточная функциональная активность ИФН 7, которая частично компенсируется сохранением активности ИФН a на уровне возрастной физиологической нормы. В условиях ex vivo пидотимод восстанавливает исходно низкую продукцию ИФН 7, практически влияя на уровень ИФН а, что характеризует модулирующее действие препарата на систему ИФН, обеспечивающую врожденную резистентность к различным инфекционным агентам. Повышение под действием пидотимода концентрации в крови не только ИФН 7, но и ИЛ 18 (спонтанного и индуцированного) происходит на фоне снижения синтеза ИЛ 4 и повышения ИЛ 10. Полученные результаты являются научным обоснованием целесообразности применения препарата Имунорикс при различных формах патологии у ЧБД.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Coppi G., Falcone A., Manzardo S. Protective effects of pidotimod against experimental bacterial infections in mice // Arzneim. Forsch. Drug. Res. — 1994; 44: 1417-1421.
2. Dianzani C., Colangelo D., Tonso E. et al. In vivo antiviral effects of pidotimod // Arzneim. Forsch. Drug. Res. — 1994; 44: 1431-1433.
3. Caramia G., Clemente E., Solli R. et al. Efficacy and safety of pidotimod in the treatment of recurrent recpiratory infections in children // Arzneim. Forsch. Drug. Res. — 1994; 44: 1480-1484.
4. Carreddu R, Venturosi V., Corsini A. Pidotimod in the treatment of recurrent respiratory infections in pediatric patients // Arzneim. Forsch. Drug. Res. — 1994; 44: 1485-1489.
5. Aivasis V., Hatzimichail A., Rapachristou A. et al. Clinical evaluation and changes of the respiratory epithelium function after administration of pidotimod in children with recurrent respiratory tract infections // Minerva. Rediatr. — 2002; 54: 345-349.
6. Харламова Ф. С., Учайкин В. Ф., Кладова О. В., Бевза С. Л. Применение препарата пидотимод при острой респираторной инфекции у часто болеющих детей // Вопросы современной педиатрии. — 2009; 8 (2): 21-27.
7. Намазова-Баранова Л. С., Харит С. М., Тузанкина И. А. и др. Результаты многоцентрового исследования применения препарата пидотимод для профилактики острых респираторных инфекций у часто болеющих детей // Вопросы современной педиатрии. — 2010; 9 (2): 40-44.
8. Сорока Н. Д. Повторные респираторные заболевания в детском возрасте: иммунотерапия с помощью препарата пидотимод
(Имунорикс) // Consilium Medicum (Педиатрия). — 2010; 3: 88-92.
9. Benetti G. R, Fugazza L., Stamba B. M. et al. Ex vivo evaluation of pidotimod activity on cell-mediated immunity // Arzneim. Forsch. Drug. Res. — 2004; 44: 1476-1479.
10. Aw D., Silva A. B., Palmer D. B. Immunose nescence emerging challenger for an aging population // Immunology. — 2007; 120: 435-446.
11. Giagulli C., Noerber M., Avolio M. еt al. Pidotimod promotes functional maturation of dendritic cells and displays adjuvant properties at the nasal mucosa level // Inter. Immunopharm. — 2009; 9: 1366-1373.
12. Григорян С. С., Майоров И. А., Иванова А. М., Ершов Ф. И. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови // Вопросы вирусологии. — 1988; 4: 433-436.
13. Григорян С. С., Арутюнян Р. А. Способ определения индивидуальной чувствительности лейкоцитов крови людей к лекарственному препарату. Патент РФ 2009 г. № 2324705.
14. Schoenborn J. R., Wilson C. B. Regulation of interferon gamma during innate and adaptive immune responses // Adv. Immunol. — 2007; 96: 41-101.
15. Nakanishi K., Yoshimoto T., Tsutsui H., Okamura H. Interleukin 18 is unique cytokine that stimulates both Th1 and Th2 responses // Cytokine Growth Factors Rev. — 2001; 12 (1): 53-72.
16. Meiler F., Zumkehr J., Klunger S. et al. In vivo switch to IL 10 secreting T-regulatory cells in high dose allergen // J. Exp. Med. — 2008; 205: 2887-2898.
