CC BY
50
action of the drugs on the peripheral blood was determined as moderate. Basing on the investigations’ results it can be suggested to test clinical effectiveness of cortifen against uterine cancer, chorionepithelioma, fibrosarcoma, renal and colon cancer. Oxoplatin and cycloplatam are supposed to have activity against melanoma, kidney cancer and Burkitt’s lymphoma.
© Ю. М. ВАСИЛЬЕВ, И. Д. КАРАВАНОВА УДК 576.535.5:576.311.577.271.37
Ю. М. Васильев, И. Д. Караванова
ДЕЙСТВИЕ ОПУХОЛЕВОГО ПРОМОТОРА, 12-0-ТЕТРА-ДЕКА НО ИЛ ФОРБОЛ-13-АЦЕТАТА НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
НИИ канцерогенеза
12-0-тетрадеканоилфорбол- 13-ацетат (ТФА) — наиболее мощный из известных в настоящее время агентов, способных вызывать промоцию экспериментального химического канцерогенеза кожи, т. е. активировать и доводить до конца развитие папиллом и карцином из эпидермиса после первоначального (индуцирующего) воздействия канцерогенных веществ [5, 8]. Многие данные указывают на то, что действие агентов-промоторов играет важную роль в развитии опухолей человека. Поэтому исследование механизмов действия ТФА представляет значительный интерес. Недавно выяснен молекулярный механизм действия ТФА: оказалось, что это вещество является мощным и весьма специфичным активатором фермента протеинкиназы С, одного из ключевых звеньев в цепи химических процессов, участвующих в проведении сигналов из внешней среды клетки к внутренним ее структурам и определяющих реакцию клетки на эти сигналы [13]. Установлено, что активация протеинкиназы С — важнейшая часть механизма действия по крайней мере 40 типов разных сигнальных молекул-, в том числе многих гормонов и факторов роста. Заменяя нормальные стимуляторы протеинкиназы С, ТФА обратимо приводит клетку в состояние, характеризующее комплекс изменений пролиферации, дифференци-ровки и морфологии [И, 14, 15, 16]. Во многих случаях такие обратимые изменения, вызываемые ТФА, оказались сходными с необратимыми изменениями, типичными для опухолевой трансформации, возникающей в результате изменений генома. Поэтому их иногда обозначают как «фенотипическую трансформацию».
К числу типичных эффектов, вызываемых ТФА, относятся изменения формы клетки, реорганизации межклеточных контактов и цитоскелета [8]. Нашим коллективом [3, 7, 9] был обнаружен и описан новый тип таких реорганизаций, вызываемых ТФА при действии на культивируемые фибробласты: этот эффект выражается в резком усилении разделения клетки на два типа участков: а) подвижные уплощенные (ламеллярные) участки, богатые сетью актиновых микрофила-ментов, и б) неподвижные отростки, бедные актином, но богатые другими цитоскелетными структурами — микро-трубочками и промежуточными филаментами.
Мы высказали предположение, что обнаруженный нами новый механизм — «сегрегация» цитоскелета в результате активации протеинки-
назы С — может играть важную роль в нормальных процессах морфогенеза, например при образовании ' отростков у нервных клеток; многие структурные особенности опухолевых клеток могут быть результатом патологической активации этого механизма.
Важно было выяснить, является ли описанный тип реорганизаций цитоскелета характерным только для фибробластов или общим для различных типов клеток. Поэтому мы исследовали действие ТФА на культивируемые эпителиальные клетки. Результаты этих экспериментов приводятся ниже.
Материалы и методы. В работе использованы клетки эпителия почки собаки линии MDCK. Клетки вели на среде ДМЕМ с 10 % эмбриональной сыворотки (Ин-т им. Гамалеи, Москва). Клетки культивировали в пластиковых чашках (Ленинград) на покровных стеклах. Использован колцемид в концентрации 0,5 7/мл (Serva, ФРГ). 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТФА) (Serva, ФРГ) растворяли в DMSO в концентрации 100 v/мл, хранили при —70 °С, пользовались конечной концентрацией 50 нг/мл.
Морфологические исследования проводили на клетках, фиксированных формалином. Для иммунофлуоресценции клетки предварительно обрабатывали экстрагирующим раствором, содержащим 1 % тритона Х-100 [1], а затем фиксировали 4 % формалином. Поликлональные антитела против тубулина и моноклональные против виментина любезно предоставлены И. С. Тинт. F-актин выявляли с помощью родамин-меченого фаллоидина, полученного от д-ра Виланда (Хейдельберг, ФРГ); моноклональные антитела против кератина № 18 любезно предоставлены д-ром Бартеком (ЧССР). Антитела выявлены с помощью Fitc-меченых антител против иммуноглобулинов мыши (Sigma, USA) или иммуноглобулинов кролика (Sigma, USA).
Результаты. Клетки линии MDCK имеют! полигональную форму, боковые края соседних клеток плотно спаяны друг с другом на всем протяжении; спаянные клетки образуют моно-слойные эпителиальные островки в редкой культуре. В густой культуре такие островки сливаются в сплошной монослой. На свободных краях островков, лишенных контактов с соседями, клетки образуют широкие ламеллярные выросты с полукруглыми краями, лишенные органелл; на контактных краях таких ламелл нет (рис. 1,а).
После инкубации с ТФА (в концентрации 50 нг/мл) в течение 3 ч в редкой культуре MDCK морфология культур резко менялась: компактные эпителиальные островки исчезали, превращаясь в группы клеток, расположенных на том или ином расстоянии друг от друга.
Протяженные «линейные» контакты между клетками исчезали почти полностью, сохранялось иногда лишь небольшое число узких «точечных контактов». Менялась и форма отдельных клеток: они становились более вытянутыми и поляризованными, на некоторых участках краев клеток имелись веерообразные широкие ламеллы, тогда как на других участках периферии образовывались узкие, почти прямые, иногда ветвящиеся отростки длиной, равной 5—7 диаметрам тела клетки. На концах отростков видны небольшие ламеллы (рис. 1,6).
Антитела против тубулина в контроле окрашивали хорошо развитую радиальную систему микротрубочек. В клетках, обработанных ТФА, микротрубочки образовывали толстые тяжи на протяжении всей длины отростка.
Окрашивание фаллоидином выявляло в контроле в клетках много прямых пучков актиновых микрофиламентов (стресс-фибрилл) и хорошо выраженные краевые тяжи актина в области кле-
Рис. 1. Фазово-контрастное изображение клеток МЭСК
а — контрольная культура. Плотно упакованные в островок полигональные клетки; б — через 3 ч после инкубации в ТФА (50 нг/мл): контакты между клетками в островках нарушены, клетки приобретают широкие ламеллы и длинные отростки.
Рис. 2. Окрашивание клеток линии МОСК. родамин-меченым фаллоидином.
а — островок клеток в контроле. Много стресс-фибрилл и тяжей микрофиламентов в области клеточных контактов; б — через 3 ч после инкубации в ТФА (50 нг/мл). Стресс-фибриллы исчезают, цитоплазма диффузно окрашена.
А
точных контактов (рис. 2, а). Инкубация клеток в ТФА приводила к исчезновению стресс-фибрилл, клетки имели более или менее диффузное окрашивание цитоплазмы. Часто узкие отростки окрашивались слабее, чем ламеллы (рис. 2,6).
Окрашивание клеток антителами против человеческого кератин № 18 выявило тонкую сеть филаментов в цитоплазме и более толстые пучки в подмембранных областях. Окрашивание клеток, обработанных ТФА, показало, что в островках присутствовали хорошо выраженные пучки кера-тиновых филаментов.
Исследование виментинового цитоскелета с помощью моноклональных антител в контрольных клетках показало, что в них присутствует хорошо развитая сеть филаментов. Окрашивание ТФА-об-работанных клеток антителами против виментина показало, что толстые пучки филаментов присутствовали во всех отростках.
Для выяснения роли микротрубочек в наблюдаемых эффектах клетки инкубировали с колце-мидом (0,5 у/мл), избирательно деполимеризую-щим эти структуры. Окраска антителами к тубу-лину подтвердила, что после 7 ч такой инкубации микротрубочки в клетках полностью отсутствовали. Такая инкубация в целом не меняла морфологию клеток и приводила лишь к небольшому увеличению ламеллярной цитоплазмы. Ес-;ли клетки перед ТФА в течение 4 ч инкубировали в колцемиде (а затем колцемид присутствовал еще 3 ч вместе с ТФА) или, наоборот, вначале инкубацию проводили 3 ч в ТФА, а затем в смеси колцемида и ТФА, то количество отростков и их длина резко уменьшались по сравнению с клетками, обработанными одним ТФА, клетки в островках сохраняли протяженные контакты друг с другом, однако полного снятия морфологического эффекта действия ТФА не было. Распределение актина, кератиновых и виментиновых филаментов после обработки одним колцемидом было таким же, как в контрольных клетках, а после инкубации с колцемидом и ТФА — таким же, как после одного ТФА.
Обсуждение. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что ТФА вызывает в эпителиальных клетках изменения формы и цитоскелета, в основных чертах сходные с теми, которые ранее обнаружены нами при действии этого опухолевого промотора на клетки иного тканевого типа — фибробласты [4, 7, 1]. В обеих системах наблюдается интенсивное перераспределение актиновых микрофиламентов относительно других цитоскелетных структур: микротрубочек и промежуточных филаментов. Именно это ускоренное перераспределение актина приводит к сходному морфологическому эффекту: образованию отростков, а также к разрушению предшествующих пучков актиновых микрофиламентов. Разрушение актиновых стресс-фибрилл при действии ТФА наблюдалось, помимо линии МОСК, и в других эпителиальных культурах [10].
Наряду с характеристиками, общими для разных типов клеток, действие ТФА на эпителий имеет свои особенности. В частности, здесь ярко выявляется разобщение клеток: под влиянием ТФА контакты в островках эпителия распадаются, клетки становятся изолированными друг от друга. Ранее многими исследователями [2, 12,
17, 18] было отмечено вызываемое ТФА исчезновение проницаемых межклеточных контактов и так называемой «метаболической связи», т. е. способности передавать из клетки в клетку через контакты различные метаболиты, участвующие в регуляции внутриклеточных процессов. Некоторые авторы считают [2, 11, 17, 18], что такая регуляционная изоляция может приводить к пролиферации отдельных опухолевых клеток, содержащихся в ткани, т. е. является центральным звеном механизма промоции. Полученные нами данные указывают на то, что эта изоляция клеток друг от друга может быть одним из следствий описанной выше перестройки цитоскелета, вызываемой ТФА.
Другим проявлением того же эффекта ТФА является то, что эпителиальные клетки приобретают поляризованную форму, несколько сходную с формой фибробластов, расползаются из островка, т. е. становятся подвижными. Сходные изменения эпителиальных клеток были ранее отмечены и при стабильной опухолевой трансформации [3, 6].
Приобретение индивидуальной подвижности может делать клетки способными к миграции из эпителиальной структуры в другие ткани, т. е. к инвазии.
Суммируя сказанное, можно сделать вывод о том, что опухолевый промотор ТФА вызывает обратимые морфологические изменения культивируемых клеток, причем основой этих изменений, по-видимому, является стимуляция внутриклеточного механизма, ответственного за перераспределение актиновых микрофиламентов относительно микротрубочек и промежуточных филаментов. Эти реорганизации цитоскелета могут играть важную роль в механизмах канцерогенеза, например в возникновении взаимной изоляции клеток в ткани, а также в появлении у клеток способности к инвазии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бершадский А. Д., Тинт И. С., Гельфанд В. И. и др. // Онтогенез.— 1979.— Т. 10, № 3.— С. 231—234.
2. Будунова И. В., Миттельман Л. А., Белицкий Г. А., Чайлахян Л. М. Ингибирующее действие опухолевых промоторов на межклеточный обмен люциферовым желтым в культуре трансформированных фибробластов джунгарского хомячка. // Докл. АН СССР.— 1986.— Т. 290, № 5.— С. 1334—1338.
3. Васильев Ю. М., Гельфанд И. М., Чайлахян Л. М., Ямазаки X. Взаимодействие нормальных и неопластических клеток со средой.— М., 1981.— С. 220—225.
4. Дугина В. Б., Васильев Ю. М., Гельфанд И. М. Обратимые изменения цитоскелета клеток в культуре, вызванные форболовым эфиром. // Докл. АН СССР.— 1987,—Т. 291,— С. 985—988.
5. Турусов В. С. //Экспер. онкол.— 1985.— № 3.— С. 5—9.
6. Bannikov G. A., Guelstein V. /., Montesano R. et al. // J. cell. Sci.— 1982.— Vol. 54,— P. 47—67.
7. Brown A. F., Dugina V., Dunn G. A., Vasiliev J. M. // Cell Biol. Intern. Rep.—1989,—Vol. 13, N 4,—P. 357— 365.
8. Diamond L. // Pharmac. Ther.— 1984.— Vol. 26.— P. 89— 145.
9. Dugina V. B., Switkina Т. М., Vasiliev J. М., Gel-fand /. M. //Proc. nat. Acad. Sci.— 1987.— Vol. 84.— P. 4122—4125.
10. Kellie S., Holme Т. C., Bissell M. S.// Exp. Cell Res.— 1985,—Vol. 160.—P. 259—274.
11. Lockwood A. H., Murphy S. K-, Borislow S. et al.// J. Cell Biochem.— 1987,— Vol. 33.— P. 237—255.
12. Murray A. W., Fitzgerald D. S. // Biochem. biophys. res. com.— 1979.— Vol. 91, N 2.— P. 395—401.
13. Nishizuka Y.//J. nat. Cancer Inst.— 1986,—Vol. 76.— P. 3—370.
14. Nishizuka У.//Science.— 1986,—Vol. ‘233.—P. 305—311.
15. Rosengurt £., Rodrigues-Pena A., Coombs М., Sinnett-Smith /.//Proc. nat. Acad. Sci.— 1984.— Vol. 81.— P. 5748—5752.
16. Vandenbark G. R., Kuhn L. G., Niedel G. E.//J. Clin. Invest.— 1984,— Vol. 73,— P. 448—457.
17. Yamasaki //., Enomoto Т., Martel N. et al.//Exp. Cell Res.— 1985,—Vol. 146,—P. 297—308.
18. Yott L. P., Chang С. C., Trosko J. E. // Science.— 1979.— Vol. 209,— P. 1089—1091.
Поступила 18.01.90
ACTION OF TUMOUR PROMOTER 12-O-TETRADECANOYL PHORBOL-13-ACETATE ON CULTURED EPITHELIAL CELLS
Yu. M. Vasiliev, I. D. Karavanova
Incubation of epithelial cells of the MDCK line with 12-0-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA), in 50 ng/ml concentration lead to dissociation of cell-cell contacts and to striking alteration of cell shape, namely, to separation of cell periphery into wide lamellas and narrow processes. Alterations of cytoskeleton accompanying these shape changes were studied by the method of immunofluorescent microscopy using monoclonal antibodies against various individual cytoskeletal proteins. It was found that TPA — treated cells, in contrast to control ones, had no actin microfilament bundles. The predominant cytoskeletal structures in the processes were microtubules and intermediate filaments of two types, containing keratins o vimentin. In is suggested that these reorganizations of cytoskeleton play an important role in the mechanisms of the promotion stage of carcinogenesis, especially, in the development of mutual isolation of cells within the tissue.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК: 616.71-006.3.04:612.015
Н. Е. Кушлинский, А. М. Новиков, Л. С. Бассалык
ТИПИРОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ КОСТНЫХ САРКОМ ПО ФРАКЦИОННОМУ СОСТАВУ СИАЛОГЛИКО-ЛИПИДОВ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
НИИ клинической онкологии
Процесс злокачественной трансформации клеток сопровождается глубокими изменениями в биосинтезе сиалогликолипидов — структурных компонентов клеточных мембран. Эти изменения могут выражаться в незавершенном синтезе, «неосинтезе» отдельных сиалогликолипидов, изменении их структуры и организации в клеточной мембране [3]. Результатом этих комбинаций является изменение фракционного состава и накопление маркеров гликолипидной природы, специфичных для данного вида опухолевых клеток. В числе таких маркеров были найдены ганглиозид йоз в меланоме [6], раке яичников человека [1] и при некоторых видах лейкозов [7], сложные фукозосодержащие моносиалоганглиозиды при неоплазмах желудочно-кишечного тракта [4] и мелкоклеточном раке легкого [5], ганглиозид 0[)2 при нейробластоме человека [8, 10]. Поскольку каждый тип опухолевых клеток имеет специфический профиль гликолипидов, типирова-ние опухолей по этому признаку может в ряде случаев иметь диагностическую значимость.
Ранее нами было проведено сравнительное исследование фракционного состава ганглиози-дов остеогенных и хондросарком и установлена связь этого показателя с метастатическим потенциалом костных опухолей. В настоящей ра-
боте определено содержание и изучен фракционный состав ганглиозидов клеток других костных опухолей: гигантоклеточной опухоли, саркомы
Юинга, злокачественной фиброзной гистиоцитомы и фибросаркомы.
Изучено 18 оперированных костных опухолей больных в возрасте от 18 до 42 лет. Всем больным до операции лечение не проводилось. Клинико-рентгенологический диагноз опухолей у обследованных больных подтвержден данными морфологического исследования. Гигантоклеточная опухоль обнаружена у 6, саркома Юинга — у 5, злокачественная фиброзная гистиоцитома — у 5 и фибросаркома кости — у 2 больных.
Ткани опухоли получали после оперативного ее удаления, замораживали в жидком азоте и хранили при —70 °С. Ганглиозиды выделяли из опухолевой ткани и очищали по ранее описанному методу [2]. Содержание липидно-связанных сиаловых кислот в образце ганглиозидов определяли резорциновым методом [9]. Ганглиозиды разделяли и идентифицировали с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках НРТЬС (10X10 см) с силикагелем 60 («Е. Мегск», ФРГ) в системе: хлороформ—метанол — 0,2 % СаСЬ— 60:35:6. Пластинки предварительно не активировали, камеру насыщали 4 ч. В качестве стандарта использовали ганглиозиды известного строения из нормальных и опухолевых тканей человека и животных. Фракционный состав ганглиозидов определяли на сканирующем денситометре «СЬгошозсап-200» фирмы «Лоусе-ЬоеЫ» (Англия).
Уровни липидно-связанных сиаловых кислот (ЛСК) в суммарных фракциях ганглиозидов изученных опухолей представлены в табл. 1. Как видно из представленных данных, содержание липидно-связанных сиаловых кислот широко варьирует в различных морфологических типах костных сарком. При этом в саркоме Юинга обнаружены более высокие значения липидно-связанных сиаловых кислот по сравнению с другими изученными опухолями костей. Не выявлено достоверных различий между гигантоклеточной опухолью и злокачественной фиброзной гистиоци-томой в средних значениях липидно-связанных сиаловых кислот.
На рис. 1 представлены хроматограммы ганглиозидов исследованных опухолей. Фракционный состав ганглиозидов костных опухолей приведен в табл. 2. Денситограммы ганглиозидов некоторых опухолей костей представлены на рис. 2.
Следует отметить, что основными ганглиози-
Таблица 1
Содержание липидно-связанных сиаловых кислот (ЛСК) в общей фракции ганглиозидов костных опухолей различного морфологического типа (мкг/г ткани)
Морфологический вариант опухоли Коли- чество обследо- ванных образцов Уровень ЛСК (М ± гл) Разброс ЛСК в обследованных образцах
Гигантоклеточная опухоль 6 29,2+6,9 13,6—47,0
Саркома Юинга 5 69,0+16,3 20,1 — 165,0
Злокачественная фиброз- 5 32,5+12,4 19,0—57,3
ная гистиоцитома
Фибросаркома 2 50,0
25,8
