CC BY
27
ty of 9.6-17.6% was noted in the meat of bulls that received nanostructured vermiculite in the diet, with the introduction of vermiculite, the increase was less effective - 2.0-2.6%, in comparison with the control analogues. According to the functional and technological properties, the meat of bulls fed in the diet with feed additives of nanostructured vermiculite was more qualitative and attractive for further technological processing.
УДК 619:615.038:616.71-001
ДЕЙСТВИЕ НОВОГО БИСФОСФОНАТА НА ОСНОВЕ ЭТИДРОНАТА ИОНОВ ЛАНТАНОИДОВ И КАЛЬЦИЯ НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ У ЖИВОТНЫХ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Житлова Е.А. - аспирант, Шакирова Ф.В. - д.в.н., Коробейникова Д.А. - аспирант ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: кролик, дефекты кости, репаративный остеогенез.
Keywords: rabbit, defects of bone, reparative osteogenesis.
Поиск возможных способов устранения костных дефектов, возникающих в результате метаболических нарушений в структуре костного обмена, в том числе и при заполнении дефектов образованных после резекции костных опухолей, является одним из наиболее сложных и актуальных вопросов современной ветеринарной хирургии[7]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в настоящее время при применении остеоиндук-торов и остеокондукторов для восстановления костных дефектов, активно продолжается разработка новых материалов [8]. Перспективными средствами активации костной репарации являются комплексные соединения, содержащие ряд минеральных компонентов - органических стимуляторов функции остеоцитов. Так, для лечения переломов костей разной степени сложности, предложен новый препарат, в состав которого входят 1-гидроксиэтилидендифосфоновая кислота, хлорид кальция безводный, нитрат гадолиния (III) гексагидрат, хлорид диспрозия (III) гексагид-рат[2], однако, морфологические изменения, возникающие при его применении, изучены недостаточно.
Цель исследования - Изучить влияние препарата на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция на процесс репаративного остеогенеза, используя модель дефекта боль-шеберцовой кости в эксперименте.
Материалы и методы исследований. Исследования выполнены согласно ГОСТ ИСО 10993 (Р) и одобрены Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (протокол заседания №9 от 25 ноября 2014). В качестве реципиентов использовались кролики (п=36) в воз-
расте 6 - 10 месяцев с массой тела 2500-2800г. Животные были подобраны по принципу аналогов.
В опыте для изучения репаративного остеогенеза у животных использована экспериментальная модель несквозного дефекта в проксимальном отделе большеберцовой кости с медиальной поверхности [9] с применением нейролептаналгезии (Rometar 2%: 0,15 - 0,2 мл/кг; 2о1еШ 100: 10 - 15 мг/кг). Оперативный доступ осуществляли через разрез кожи и подкожной клетчатки на 2 см ниже бедро-берцового сочленения. Высверливали отверстие в одном кортикальном слое диаметром три мм. Рану ушивали прерывисто-узловатыми швами. Эксперимент выполнен введением исследуемого препарата на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция в модельный дефект костей животных, которые были разделены на две группы: первая - сравнения, без введения препарата на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция, заживление дефекта под свертком крови; вторая - опытная с введением препарата в дефект кортикальной пластинки на 3 и 5 сутки после операции в дозе 0,2 мл.
Сам этидронат представлят собой дву-натриевую соль 1 -
гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты, являющийся производным этидроновой кислоты.
1 -Гидроксиэтилидендифосфоновая кислота (H4L) относится к классу бисфосфо-натов и находит применение в медицине для предупреждения чрезмерного выхода кальция из костей, патологической кальцификации мягких тканей. Благодаря высокому сродству к фосфатам при добавлении комплексов ионов лантаноидов к гидроксиапатитам, образующим
основу костной ткани, они прочно связываются с минералами, не нарушая структуру гид-роксиапатитов. Лантаноиды подавляют развитие клеток (остеокластов), отвечающих за резорбцию костной ткани. Эта способность ионов лантаноидов подражать функциям ионов кальция позволяет не только моделировать поведение последних с помощью ионов лантаноидов, но и реально использовать лантаноиды в качестве компонентов для терапии заболеваний костной ткани.
Считается, что гадолиний (III) является «парамагнитным зондом», моделирующим поведение кальция в биосистемах в отсутствие и в присутствии 1 -гидроксиэтилиден-
дифосфоновойкислоты, регулирующей кальциевый метаболизм, важно сопоставление поведение этих ионов, выявление сходство и различие в химизме (стехиометрии и устойчивости) комплексообразования с 1 -гидроксиэтилидендифосфоновой кислотой. Рабочее неофициальное название препарата -«Инрок».
Компьютерную томографию проводили: на 7, 21 и 56 сутки эксперимента на муль-тиспиральном компьютерном томографе Brilliance 64 (Philips) в режиме поперечного сканирования. Для количественной оценки плотности кортикальной пластинки осуществляли обработку сагиттальных срезов регенерата в режиме мультипланарной реконструкции (MPR). На полученных изображениях в интерактивном режиме выделяли область дефекта и высчитывали ее плотность в единицах Хаунс-филда (HU)[3]. При помощи программного обеспечения «Vitrea Vital 2.2» проводили 3D-реконструкции зоны регенерата.
Морфологический анализ края костного дефекта и ткани, заполнявшей перфоратив-ное отверстие, проводили на 7, 14, 28 и 56 сутки опыта. Для этого материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, декальциниро-вали по специальной методике
[6],обезвоживали и заливали в парафин. На микротоме «Leica SM 2000R» изготавливали гистологические срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по ван Гизону. Для количественной оценки площадей изучаемых структур применялся морфометрический ме-тод[1]. Расчет производился в % от общей площади гистологического среза. [5].
Изучение объектов проводилось с использованием микроскопа «Axioscop» фирмы «Цейс». Изучение остеобластной активности исследуемого препарата in vitro проводили общепринятым методом с использованием
коммерческого набора In Vitro Osteogenesis Assay Kit (Millipore, USA) и клеточной линии МС3Т3-Е1, полученной из американского банка клеточных культур АТСС. Набор и вышеуказанная клеточная линия на протяжении многих лет используются для оценки остеобластной активности исследуемых веществ in vitro. Мелатонин входил в данный набор и был нами использован (согласно протоколу) в качестве положительного контроля, т.е. индуктора остеобластной активности у исследуемой клеточной линии. Т.е. были культуры клеток, инкубированные с различными концентрациями исследуемого соединения, а также культуры клеток, инкубированные с мелатонином (положительный контроль) и без внесения каких-либо веществ (отрицательный контроль). Нами было показано, что остеобластная активность изучаемого соединения в концентрациях 500 мкМ и 1 мМ превышала показатели положительного контроля. Более того, для исследуемого соединения был показан четкий дозо-зависимый эффект, свидетельствующий об индукции остеобластной активности. На основании вышеизложенного был сделан вывод о том, что одним из возможных молекулярных механизмов действия исследуемого соединения является его способность повышать активность остеобластов в местах повреждения.
Статистическая обработка проводилась с использованием пакета программ SPSS (v.13.0). Нормальность распределения показателей оценивалась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения показателей двух групп использовался критерий Стью-дента. При сравнении показателей трех и более групп применялся дисперсионный анализ. Последующее межгрупповое сравнение проводилось с использованием критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Отличия полагались статистически значимыми при P < 0,05. Данные представлены в виде M±m, где M - среднее арифметическое значение, m - стандартная ошибка среднего.
Результаты исследований. Кролики хорошо переносили общее обезболивание и оперативное вмешательство. Через 30 минут после операции у животных восстанавливалась двигательная активность, а уже через 5 часов они принимали пищу. Послеоперационные раны заживали первичным натяжением. Нагноения операционных ран, аллергических реакций и других осложнений у животных не наблюдалось.
При проведении мультиспиральной компьютерной томографии (МСКТ) костей
голени интактных кроликов выявили, что плотность кортикальной пластинки больше-берцовой кости в зоне средней трети диафиза составляла 2412,4±69,3 HU. У животных опытной группы на 7 сутки эксперимента
наблюдалось достоверное повышение плотности регенерата (р=0,001),что превышало аналогичные значения у животных группы сравнения в 2,5 раза (916,6±26,5 HU и 366,6±33,6 HU соответственно) (рис.4).
Рисунок 1 - Измерение плотности большой берцовой кости по MPR.7 сутки эксперимента: а) группа сравнения, б) опытная группа.
Рисунок 2 - 3D-реконструкция зоны регенерата. 7-е сутки эксперимента. Группа сравнения.
На 7 сутки эксперимента на фоне снижения интенсивности воспалительной реакции у животных опытной группы, по сравнению с группой сравнения (27,1±2,8%), уменьшалась площадь незаращенного перфоративного отверстия - до 15,6±1,9% (р< 0,05). В большинстве наблюдений начинался процесс регенерации с пролиферацией кровеносных сосудов и миграцией фибробластов. Мезенхимальные элементы при этом располагались между сосудистыми петлями, т.е. формировалась грануляционная ткань. Иногда по краю дефекта ко-
сти имели место некротические изменения с наличием запустевших полостей остеоцитов и очагов обызвествления (рис.3а). Объем грануляционной ткани увеличивался до 70,9±1,6% (р< 0,05), тогда как у животных группы сравнения он составлял 54,5+4,1% (рис.3б). Ни в одном из наблюдений опытной группы не встречались лейкоцитарно-некротические массы или отсутствие признаков репаративной регенерации. При этом признаки репарации в группе сравнения отсутствовали.
1Г
- г
[
б
Рисунок 3 - а) Некроз и обызвествление костной б) Грануляционная ткань. Опытная группа. 7 сут-ткани по краю перфоративного отверстия. Груп- ки эксперимента. Гематоксилин и эозин. Ок.х па сравнения. 7 сутки эксперимента. Гематокси- 10, об.х 40. лин и эозин. Ок.х 10, об.х 40.
На 14 сутки происходило уменьшение площади грануляционной ткани и увеличение соединительной - до 7,2±1,4% (р< 0,05) и 67,5±3,5% (р< 0,05) соответственно (рис.4а). На этих же сроках в опытной группе уже наблюдались случаи со сформированной гру-боволокнистой костью (18,3±0,8%, р< 0,05), балки которой были связаны с краями перфо-
ративного отверстия (рис.4б). Дефект при этом был частично закрыт и имел площадь всего 1,5±1,0% (р< 0,05). Костеобразование через образование хряща наблюдалось значительно реже. Проявления воспалительной реакции на фоне репаративных процессов были незначительными или отсутствовали.
Рисунок 4 - а) Трансформация грануляционной и б) Грубоволокнистая кость с балочным строени-соединительной ткани в хрящевую. Группа ем, заполняющая перфоративное отверстие. сравнения. 14 сутки эксперимента. Гематоксилин Опытная группа. 14 сутки эксперимента. Ге-
и эозин. Ок.х 10, об.х 40.
матоксилин и эозин. Ок.х 10, об.х 40.
Результаты компьютерной томографии выявили сохранение тенденции к увеличению плотности регенерата у животных обеих групп в последующие сроки эксперимента:
На 21 сутки у кроликов опытной группы плотность регенерата составила 993,2±52,2 HU, что на 9,3% выше значений, чем у животных группы сравнения (900,8±57,9 HU).
Во всех наблюдениях на 28 сутки, пер-форативное отверстие было замещено грубо-волокнистой костью с диффузным объизвеств-лением балок (рис 5 а). Хрящевая ткань практически отсутствовала (1,6±0,1%), а костный
мозг был насыщен гемопоэтическими элементами, располагавшимися среди сформированных костных трабекул. В большинстве наблюдений на конец четвертой недели эксперимента костный дефект большеберцовой кости был полностью закрыт. У животных группы сравнения имелась сформированная грубоволокни-стая кость, площадь которой составляла 86,0±1,9%. По краям бывшего отверстия тра-бекулы частично резорбировались и началась перестройка кости в пластинчатую, объем которой был еще незначителен (1,2±0,3%). В случаях, когда в процессе заживления дефекта
образовывалась хрящевая ткань, на данном этапе происходило её рассасывание, обызвествление и замещение костной тканью. При этом, в отдельных случаях имело место закрытие дефекта с наличием по краям хрящевой ткани (без явления оссификации), а в центре присутствовала незрелая грубоволокнистая
Рисунок 5 - а) Трансформация хрящевой ткани в грубоволокнистую кость. Группа сравнения. 28 сутки эксперимента. ван Гизон. Ок.х 10, об.х 40.
На 56 сутки плотность регенерата у животных опытной группы составляла 1120,6±27,1 HU, что на 4% больше чем у животных группы сравнения (1078,2±57,4 HU). Результаты плотностных характеристик регенерата на 21 и 56 сутки не были достоверными. На 56 сутки эксперимента, в большинстве наблюдений, у животных группы сравнения была сформирована пластинчатая кость, занимавшая 88,7±0,6% от площади среза. В то же время, следует отметить сохранение в отдельных случаях фрагментов грубоволокнистой
кость. У животных опытной группы на этом сроке наблюдений, перфоративное отверстие было замещено грубоволокнистой костью (92,2±0,9%) с диффузным обызвествлением балок, которая в 2,66 раза чаще чем в группе сравнения трансформировалась в пластинчатую (рис. 5б).
б) Диффузное обызвествление костных балок. Опытная группа. 28 сутки эксперимента. Гематоксилин и эозин. Ок.х 10, об.х 40.
кости (7,1±0,4%), участков рассасывания хрящевой ткани с оссификацией , а также наличие очагов некроза и деструкции как хряща, так и кости (рис.ба). В целом хрящевая ткань сохранялась на 4,2±0,2% площади перфоративного отверстия. На 56 сутки эксперимента в опытной группе имело место полное неосложнен-ное заживление. На месте перфоративного отверстия была пластинчатая кость 98,8±0,2% (р<0,001) с развитой системой гаверсовых каналов и восстановленным костным мозгом, а также окружающих мягких тканей (рис. 6 б.)
Рисунок 6 - а) Пластинчатая кость с наличием б) Пластинчатая костная ткань. Опытная группа.
фрагмента хрящевой ткани и очагами некроза. 56 сутки эксперимента. Ван Гизон. Ок.х 10, об.х
Группа сравнения. 56 сутки эксперимента. 4 0 . Гематоксилин и эозин. Ок.х 7, об.х 40.
Заключение. Посредством компьютерной томографии изучали количественное измерение плотности кортикальной пластинки в зоне остеорепарации. Достоверно значимые различия в плотности кортикальной пластинки у животных опытной группы проявились на 7-е сутки эксперимента. Перестройка костной ткани в зоне сформировавшегося регенерата у животных с локальным введением этидроната, происходила в более ранние сроки в отличие от группы сравнения, что определялось плотностью регенерата, это может являться признаком достаточно высокой степени биосовместимости костной ткани и этидроната ионов лантаноидов, и кальция.
Применение препарата, относящегося к группе бисфосфонатов, в эксперименте показало его стимулирующее влияние на регенераторные процессы в костной ткани. Как показали данные исследований динамики заживления костных дефектов под кровяным сгустком (группа сравнения), без введения препарата на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция, новообразование костного регенерата протекало медленнее. Сам регенерат был построен, главным образом, из фиброзной соединительной ткани. Превалирующими на 56 сутки наблюдений в плотном компоненте регенерата были костно-хрящевые структуры. При использовании остеоиндуцирующих материалов на месте дефектов в течение 2-х месяцев развивалась полноценная пластинчатая кость. Данные сравнительного морфологического анализа свидетельствуют о типичной динамике остеорепаративного процесса в месте введения исследуемого препарата на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция, обладающего остеоиндуцирующими свойствами.
Суммируя приведенные данные этапного рентгенологического исследования, можно сделать следующее заключение. У животных исследуемых групп к концу опыта полного возмещения дефекта не происходило. Введение исследуемого препарата на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция, способствовало формированию регенерата с высокими показателями плотности. Начиная с 7-х суток эксперимента, плотность регенерата статистически значимо (р<0,001) превышала таковую у животных группы сравнения.
Обобщая приведенные выше результаты гистологического исследования динамики репаративного остеогенеза, можно сделать следующее заключение: в группе без введения
препарата на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция на протяжении всего опыта количественный и качественный состав тканей, заполнивших перфоративное отверстие, достоверно значимо (р< 0,001) отличался от группы сравнения. Введение препарата на основе этидронатов лантаноидов и кальция полного возмещения дефекта не происходило. Введение исследуемого препарата на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция способствовало формированию регенерата с высокими показателями плотности. Полученные данные могут отображать раннее образование соединительнотканной мозоли и начало ее перестройки в костную ткань.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Автандилов, Г.Г. Медицинская
морфометрия.- М.Медицина,1990.- 384 с.
2. Девятов Ф.В., Холмогорцев Е.Г. Способ регенерации костной ткани в эксперименте // Патент RU 22482101.
3. Захаров, И.С. Лучевая диагностика остеопороза - современное состояние проблемы / И.С. Захаров // Политравма. -2015. - №1. - С. 69-73.
4. Корж, Н.А. Имплантационные материалы и остеогенез. Роль оптимизации и стимуляции в реконструкции кости / Н.А. Корж, Л.А. Кладченко, С.В. Малышкина // Ортопедия,травматология и протезирование. -2008. - №4. - С.5-14.
5. Коржевский, Д.Э. Краткое изложение основ гистологической техники для врачей и лаборантов-гистологов. - СПб: Кроф, 2005. - 48 с.
6. Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие / Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Лабора, 2009. Т.2. 304с.
7. Накоски, А.Н. Ксеноимпланта-ция матрикса костной ткани при замещении дефектов кости у кроликов / А.Н. Накоски, О.В. Дюрягина, М.А. Ковинька // Ветеринария Кубани. - 2016. - №6. - С.19-21.
8. Предеин, Ю.А. Костные и клеточные имплантаты для замещения дефектов кости / Ю.А. Предеин, В.В. Рерих // Современные проблемы науки и образования. - 2016. -№6 - С.132-146.
9. Талашова, И.А. Сравнительная количественная оценка репаративного процесса при имплантации биокомпозитных материалов в костные дефекты / И.А. Талашова, Н.А. Осипова, Н.А. Кононович // Гений ортопедии. - 2012. - №2. - С.68-71
ДЕЙСТВИЕ НОВОГО БИСФОСФОНАТА НА ОСНОВЕ ЭТИДРОНАТА ИОНОВ ЛАНТАНОИДОВ И КАЛЬЦИЯ НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ У ЖИВОТНЫХ В
ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Житлова Е.А., Шакирова Ф.В., Коробейникова Д.А.
Резюме
Экспериментальной моделью явились 36 кроликов в возрасте 6 - 10 месяцев с массой тела 2500-2800г, которым моделировали повреждение путем рассверливания одной кортикальной пластинки в проксимальном отделе большеберцовой кости. На 3 и 5 сутки в сформированный дефект животным опытной группы двукратно вводили препарат на основе ионов лантаноида и кальция в дозе 0,2 мл. Морфологический анализ края костного дефекта и ткани, заполнявшей перфоративное отверстие, проводили на 7, 14, 28 и 56 сутки. Контрольные исследования локальных изменений в зоне травмы проводили на компьютерном томографе Brilliance 64 (Philips). Обработка срезов зоны репарации осуществлялась в режиме мультипланарной реконструкции в сагиттальной плоскости.
Изучаемый препарат улучшал процесс заживления костного дефекта уже на 7 сутки эксперимента, что выражалось в уменьшении площади перфоративного отверстия и объема лейкоцитарно-некротических масс. К 14 суткам показатели репаративной регенерации также достоверно отличались от таковых в группе сравнения: уменьшалась площадь грануляционной ткани с трансформацией ее в соединительную, что приводило на 28 сутки к закрытию дефекта грубоволокнистой костью. На поздних сроках в области травмы визуализировалась сформированная пластинчатая кость. Результаты исследований методом компьютерной томографии показали, что среднее значение плотности в первые 10 дней после оперативного вмешательства у кроликов опытной группы в 1,5-2 раза превышало таковые у кроликов группы сравнения.
THE NEW BISPHOSPHONATE ON THE BASIS OF ETIDRONATE IONS OF LANTHANIDES
AND CALCIUM TO RESTORE BONE DEFECTS IN ANIMALS IN THE EXPERIMENT
Gitlova E.A., Shakirova F. V., Korobeinikova, D. A.
Summary
As an experimental model were used 36 rabbits aged 6 - 10 months with body masses 2500-2800g, which were injured by perforating a cortical plate in the proximal section of the tibia. On the 3rd and 5th days in the test group of animals a preparation of a lanthanide and calcium ions in a dose of 0.2ml were twice injected into the formed defects. Morphological analysis of the bone defect edges and tissue, filling the perforated hole, was performed on the 7th, 14th, 28th and 56th days. For the local change control on the injury zone researches were conducted on the computer tomography Brilliance 64 (Philips). A cut processing of reparative zone was conducted in the multiplanaris reconstruction mode in sagittalis plate.
The investigated drug has improved the healing process of the bone defect already on the 7th day of the experiment that was characterized by a smaller area of the perforated hole and a smaller amount of leu-kocyte-necrotic masses in the hole. By the 14th day the reparative regeneration parameters were also significantly different from the control ones: the area of granulation tissue was reducing simultaneously transforming into the connective tissue that led to the defect closing with nonlamellar bone by the 28th day. At the later stages in the area of injury a formed lamellar bone was visualized. The average value of the density in the first 10 days after surgery in rabbits of the test group (where the drug was injected into the experimentally made bone defect) is 1.5-2 times higher than that in the rabbits of the comparison group. Further terms of the experiment were characterized by a continuing trend towards increasing the density of regenerate in both groups.
