Действие метцинкиновой металл0пр0теиназы бацилл на перевиваемые культуры клеток животных Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

72

Оригинальные исследования

ДЕЙСТВИЕ МЕТЦИНКИНОВОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ БАЦИЛЛ НА ПЕРЕВИВАЕМЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ

Ю.И. Данилова, Ю.М. Кириллова, НЛ. Рудакова, Л.М. Богомольная,

Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова

Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

The action of Bacillus’ metzinc metalloproteinase on cultured animal cell lines

J.I. Danilova, J.M. Kirillova, N.L. Rudakova, L.M. Bogomolnaya,

N.P. Balaban, M.R. Sharipova

Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

Микробные ферменты, обладающие высокой активностью, все шире применяются в медицинской практике при изготовлении медикаментов для лечения ожоговых поражений, заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также в системной энзимотерапии. Одним из основных требований к таким препаратам является отсутствие токсичности, как для клеток, так и для организма в целом.

Настоящее исследование направлено на определение действия бактериальной метцинкиновой эндопептидазы бацилл на перевиваемые линии клеток животных с целью определения ее цитотоксичности. Установлено, что бактериальная метцинкиновая эндопептидаза в концентрации 155 мкг/мл оказывает цитотоксическое действие на перевиваемые линии клеток ЛЭК, Vero, РК-15. Однако меньшие концентрации фермента — 75 и 15 мкг/мл не являются цитотоксичными.

Ключевые слова: металлопротеиназа, цитотоксичность, перевиваемые линии клеток, жизнеспособность.

Масштабное накопление информации о секвени-рованных геномах бактерий и развитие технологий генной инженерии позволяют в настоящее время получать любые микробные ферменты. Непатогенные легко культивируемые микроорганизмы — прекрасный источник разнообразных белков, в том числе протеиназ [1]. Интерес к этим ферментам обусловлен их перспективностью для применения в медицинской практике. Так, протеиназы бацилл, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами, с успехом могут заменить дефицитные и дорогостоящие препараты животного происхождения. Поэтому поиск новых микробных ферментов с высокой биологической активностью и низкой токсичностью является актуальным. Показано, что бактерии Bacillus pumilus, наряду с традиционными сериновыми протеазами, секретируют в среду мет-цинкиновую металлоэндопептидазу, последовательность гена (mprBi) которой установлена и занесена в Международную базу данных (Gen Bank accession number ACE75740.2). Изучена экспрессия гена в рекомбинантном штамме B. subtilis [2], белок выделен в гомогенном состоянии и подробно охарактеризован [3], однако цитотоксические свойства его в полной мере не известны.

В этой связи, цель работы заключалась в изучении действия метцинкиновой металлопротеиназы B. pumilus на перевиваемые линии клеток животных: легких эмбриона коровы (ЛЭК), почек африканской зеленой мартышки (Vero), почек свиньи (РК-15), невриномы Гассерова узла крысы (НГУК) — для определения ее цитотоксичности.

Microbial enzymes with high activity are increasingly used in medical practice in development of drugs for treatment of burn injuries, diseases of gastrointestinal tract, as well as in systemic enzyme therapy. One of crucial requirements for such drugs is the absence of toxicity, both on cellular and organism levels.

The aim of the present study was to evaluate cytotoxic effect of Bacillus pumilus metzinc metalloproteinase on animal cell lines. Cytological changes in LEK, Vero and PK-15 cell lines were observed after cell treatment with 155 u/ml enzyme. However, lower enzyme concentrations — 75 and 15 u/ml did not show any toxicity.

Key words: metzinc metalloproteinase, cytotoxicity, cultured cell lines, viability.

Материал и методы

Объектом исследования служила металлопротеиназа B. pumilus, выделенная из среды, в которой культивировали рекомбинантный штамм, полученный путем трансформации плазмиды pSA1 в протеазо-дефицитный штамм B. subtilis JB 2036 (штамм любезно предоставлен проф. E. Ferrarri, Genencor Int. Inc., USA). Мультикопийная плазмида pSA1 сконструирована на основе экспрессионного вектора pCB22 [4] и несет ген металлопротеиназы B. pumilis (mprBi) под собственным промотором. Гомогенный фермент получали по методу, описанному ранее [3].

Действие металлопротеиназы изучали на перевиваемых линиях клеток животных: ЛЭК, Vero, РК-15 и НГУК. Клеточные линии были получены из банка клеточных культур АТСС (http://www.lgcstandards-atcc.org/). Культивирование клеток проводили по стандартной методике [5] на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, инактивированной в течение 30 мин. при +56°С. Для всех экспериментов клетки высевали в стандартной концентрации 2х105 кл/мл в 24-луночные планшеты и инкубировали 24 ч при 37°С и 5% СО2 в СО2 инкубаторе (BINDER, Германия). После формирования 80% монослоя ростовую среду тщательно удаляли и заменяли раствором Хэнкса. Раствор Хэнкса служил основной средой для приготовления разведений фермента, который добавлялся непосредственно в лунки с клеточным монослоем. В работе использовали следующие концентрации фермента: 15, 75

е-mail: [email protected]

Гены & Клетки Том IX, № 1,2014

Оригинальные исследования

73

и 155 мкг/мл. Контролем служили лунки с раствором Хэнкса без добавления фермента.

Цитотоксическое действие фермента определяли по изменению морфологии клеток, клеточного монослоя и их жизнеспособности. Изменения морфологии клеток и клеточного монослоя до и после обработки ферментом оценивали визуально с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse TS 100 по следующим параметрам: адгезия и распластывание клеток, изменение их конфигурации в целом, наличие вакуолизации, изменение общей цитоархитектоники клеточного монослоя. Жизнеспособность клеток определяли в камере Горяева с использованием красителя трипановый синий по соотношению количества живых и мертвых клеток. Спустя 24 ч инкубации клеток с ферментом производили подсчет выживших клеток в процентах, принимая количество клеток в лунках без образца за 100%.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием непараметрических методов (U-критерий Манна — Уитни, критерий Вилкоксона) при уровне значимости различий р<0,05.с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Результаты представлены как средние арифметические со стандартным отклонением.

Результаты и обсуждение

В ходе визуального наблюдения за изменениями морфологии клеток и клеточного монослоя перевиваемой линии ЛЭК установлено, что инкубация с металлопротеиназой в концентрации 155 мкг/мл уже в течение 2 ч. приводила к образованию в клетках мелких множественных вакуолей. Однако при использовании меньших концентраций фермента (75 и 15 мкг/мл) вакуолизация клеток наблюдалась только через 24 ч инкубации. Тем не менее, общая целостность монослоя с сохранением межклеточных контактов не нарушалась при всех концентрациях фермента (рис. 1).

Внесение металлопротеиназы в концентрации 155 мкг/мл в лунки с клеточным монослоем перевиваемых линий Vero и РК-15 приводило к увеличению размеров и формы клеток, образованию мелких множественных вакуолей и последующим дегенеративным изменением монослоя (рис. 2А, 3А). Показано, что фермент в меньших концентрациях, а именно: 75 мкг/мл и 15 мкг/мл, не оказывал такого действия, клеточный монослой оставался без изменений (рис. 2Б, В; 3Б, В).

Перевиваемая линия НГУК также оказалась чувствительна к ферменту в концентрациях 155 мкг/мл и 75 мкг/мл — через 24 ч инкубации адгезии не наблюдалось (рис. 4).

“Г £ ч л*: »(О®»»" ^ "V ^ if £/■ '

Б

Jr

- 7" 1-11 fV ■ ■ f*. J Ip -I .

•Г>-Л ■ : U,

i ^ , Ой.* Л : ri -

’ ■r'' ■ i’d»4» s* и1 a.: ■ -

■Ф J ^

J 4 1

e‘-

■* •'/

w 'si

t ■ J,...''-It * ■ ^ \<

1 v>;t- •< JSv ' r

• ife.4-■ -ЧЧ; ■••••• •#«$:

Ч ъ -Ч v* V * 'Bp,, * • THTI. - . *4T - ■

■_l L. t p ?-a /;-A:z \J-

Рис. 7.

Монослой перевиваемой линии клеток ЛЭК через 24 ч после внесения металлопротеиназы в разных концентрациях:

А — 155 мкг/мл;

Б — 75 мкг/мл;

В — 15 мкг/мл.

Световая микроскопия.

Ув. х100

Гены & Клетки Том IX, № 1,2014

74

Оригинальные исследования

Рис. 2

Монослой перевиваемой линии клеток Vero через 24 ч после внесения металлопротеиназы в разных концентрациях:

А — 155 мкг/мл;

Б — 75 мкг/мл;

В — 15 мкг/мл.

Световая микроскопия.

Ув. х100

Рис. 3.

Монослой перевиваемой линии клеток РК-15 через 24 ч после внесения металлопротеиназы в разных концентрациях:

А — 155 мкг/мл;

Б — 75 мкг/мл;

В — 15 мкг/мл.

Световая микроскопия.

Ув. х100

Гены & Клетки Том IX, № 1,2014

Оригинальные исследования

75

Мл

rvv^r

с; * т.^ * К_^ .

. - ,\ ;Ч^Й'

= ^# Лъ

о:

•1 -ч ■-" <*■

■ Л ■&'.-

£•

■*япД ©

■*- *

Ч.ЬГ- t

%У

*

Ч

г

* -.,

t

1ч*> •?>

' J-. *~

■ °СЧч

- -Г s “W

' ' ^

*.4 ^ ; £ ei

г _ ^ щ

~ ’^Рг « ^ «■*

,.;# - * • , d . ^ ■ V л

l ,.■“!. "л •*> t' n- VS

" 4£?v* -Д<-Л “ v *

r.

Рис. 4.

Монослой перевиваемой линии клеток НГУК через 24 ч после внесения металлопротеиназы в разных концентрациях:

А — 155 мкг/мл;

Б — 75 мкг/мл;

В — 15 мкг/мл.

Световая микроскопия.

Ув. х100

Однако, несмотря на это, клетки не окрашивались трипановым синим, что свидетельствует об отсутствии повреждений цитоплазматических мембран.

При оценке жизнеспособности клеток было установлено, что изменение их состояния и целостности клеточного монослоя при инкубации с металлопротеиназой в концентрации 155 мкг/мл сопровождалось снижением числа жизнеспособных клеток перевиваемых линий ЛЭК, Vero, РК-15 в 2 раза, при этом количество жизнеспособных клеток линии НГУК не уменьшалось. В меньших дозах фермент не обладал цитотоксическим действием по отношению ни к одной исследуемой линии (табл.).

Высокая биологическая активность и отсутствие цитотоксичности протеиназ объясняют интерес к ним как к перспективным действующим веществам лекарственных препаратов. Одним из таких фер-

ментов является бэфибриназа Bacillus sp. AS-S20-I, обладающая фибринолитическими свойствами и не являющаяся токсичной по отношению к эукариотическим клеткам [6]. Известна также металлопротеиназа Bacillus thuringiensis IMV B-7324, обладающая тромболитическими свойствами, однако цитотоксические свойства ее не охарактеризованы [7].

Мы исследовали цитотоксичность металлопротеиназы рекомбинантного штамма B. subtilis JB 2036. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что степень токсического эффекта металлопротеиназы являлась дозозависимой для перевиваемых линий ЛЭК, Vero, РК-15, тогда как линия НГУК, несмотря на нарушения целостности клеточного монослоя, оказалась нечувствительной к данному ферменту. Возможно выявленный столь неоднозначный эффект обусловлен способностью клеток по-разному

Жизнеспособность клеток через 24 час инкубации с метцинкиновой металлопротеиназой

Концентрация фермента, мкг/мл Жизнеспособность, %

Перевиваемая линия клеток

ЛЭК НГУК Vero РК-15

155 41±4,1* 106,7±6,2 55,8±3,4* 48±5,3*

75 78±5,8* 117,2±7,3 92,04±4,7 106±7,1

15 121±7,8* 124±6,9* 96±3,1 108±6,3

0 100±0,2 100±0,15 100±1,3 100±0,3

— различия при сравнении с контролем (0 мкг/мл) статистически значимы, p<0,05.

Гены & Клетки Том IX, № 1,2014

76

Оригинальные исследования

реагировать на изменения окружающей их среды, и, в частности, на присутствие метцинкиновой металлопротеиназы. Кроме того, вероятно, действие фермента на клетки связано с нарушением функционирования плазматической мембраны, что, однако не всегда сопровождается гибелью самих клеток.

Благодарности

Выполнение данного научного исследования финансировалось за счёт государственного контракта ФЦП Министерства образования и науки РФ

ЛИТЕРАТУРА:

1. Шарипова М. Р., Шакиров Е.В., Балабан Н.П. и со-

авт. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedius. Микробиология 2000; 69(5):

660-7.

2. Сабирова А.Р. Структура гена новой металлопротеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии [Диссертация]: Казанский (Приволжский) федеральный ун-т: Казань; 2011.

3. Рудакова Н.Л., Балабан Н.П., Данилова Ю.В. и др. Характеристика цинкзависимой эндопептидазы Bacillus intermedius. Биохимия 2010; 75(10): 1462-70.

№ П344 от 07.05.2010. Работа частично выполнена на оборудовании Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

4. Sorokin A.V., Khazak V.E. Expression unit from the replication region of the Streptococcal plasmid pSM19035. Mol. Biol. 1990; 24: 993-1000.

5. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. [М]: Мир; 1983.

6. Mukherjee A.K., Rai S.K., Thakur R. et al. Bafibrinase: A nontoxic, non-hemorrhagic, direct-acting fibrinolytic serine protease from Bacillus sp. strain AS-S20-I exhibits in vivo anticoagulant activity and thrombolytic potency. Biochimie. 2012; 94(6): 1300-8.

7. Nidialkova N.A., Matseliukh O.V., Varbanets L.D. Physicochemical properties of Bacillus thuringiensis IMV B-7324 fibrinolytic peptidase. Mikrobiol Z. 2013; 75(4): 3-7.

Поступила 25.09.2013

Гены & Клетки Том IX, № 1,2014