CC BY
47ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
©КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Е.А.Курбатова1, Э.А.Ахматов1, Н.К.Ахматова1, Д.С.Воробьев1, Н.Б.Егорова1, А.П.Батуро1, Э.Е.Романенко1, Ю.Е.Цветков2, Е.В.Сухова2, Д.В.Яшунский3, Н.Э.Нифантьев2
ДЕЙСТВИЕ ГИДРОКСИДА АЛЮМИНИЯ НА СИСТЕМУ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА И ИММУНОГЕННОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
1НИИ вакцин и сывороток им..И.И.Мечникова, 2Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского, 3НИИ биомедицинской химии им.В.Н.Ореховича, Москва
Цель. Исследование действия гидроксида алюминия на молекулярно-клеточные механизмы активации врожденного иммунитета и его адъювантное действие на иммуногенность природных бактериальных и синтетических антигенов пневмококка. Материалы и методы. Определяли поверхностные маркеры дендритных клеток (ДК), мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) и уровень цитокинов методом проточной цитометрии; титр IgG — методом ИФА. Протективную активность оценивали в опытах активной защиты мышей от заражения вирулентными штаммами пневмококка. Результаты. Гидроксид алюминия повышал содержание МЛ селезенки мышей, экспрессирующих TLR2 и TLR4. Прибавление его в культуру незрелых ДК индуцировало появление популяции клеток с маркерами зрелых ДК — CD83, CD80, CD86, хотя уровень недифференцированных клеток (CD34) и клеток с молекулами адгезии (CD11^ CD38) не изменялся. ДК продуцировали в среду культивирования IL-ф, IL-5, IL-10, IFNy. Увеличение продукции цитокинов происходило через 2 ч после однократного введения мышам и сохранялось в течение срока наблюдения (24 ч). Выработка Th1 (IFNy, TNFa) и Th2 (IL-5, IL-10, GM-CSF) цитокинов свидетельствовала о поляризации иммунного ответа по Th1/ Th2 типу После двукратного введения гидроксида алюминия мышам повышалось число МЛ с маркерами CD19+, CD5+, NK1.1+, CD25+, MHCII+ при снижении CD3+, CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. Активация адаптивного иммунитета характеризовалась высоким титром IgG к капсульному полисахариду пневмококка и защитой 90 — 100% мышей от заражения летальными дозами штаммов S. pneumoniae, выявлена при двукратной иммунизации мышей конъюгатами синтетических олигосахаридов пневмококка с БСА, сорбированными на гидрооксиде алюминия, тогда как природные бактериальные антигены обеспечивали 90 — 100% выживаемость животных при иммунизации без адъюванта. Заключение. Представлены данные о действии гидроксида алюминия на ключевые эффекторы врожденного иммунитета: ДК, NK, TLRs и продукцию цитокинов. Показано, что этот адъювант целесообразно вводить в ассоциации с конъюгатами синтетических олигосахаридов пневмококка с белком-носителем.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 59—67
Ключевые слова: гидроксид алюминия, врожденный иммунитет, дендритные клетки, цитокины, адъювантное действие, конъюгат, синтетические олигосахариды, пневмококк
E.A.Kurbatova1, E.A.Akhmatov1, N.K.Akhmatova1, D.S.Vorobiev1, N.B.Egorova1, A.P.Baturo1, E.E.Romanenko1, Yu.E.Tsvetkov2, E.V.Sukhova2, D.V.Yashunsky3, N.E.Nifantiev2
EFFECT OF ALUMINIUM HYDROXIDE ON INNATE IMMUNITY AND IMMUNOGENI-CITY OF BACTERIAL AND SYNTHETIC ANTIGENS OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
1Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, 2Zelinsky Institute of Organic Chemistry,
3Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
Aim. Study the effect of aluminium hydroxide on molecular-cell mechanisms of innate immunity activation and its adjuvant effect on immunogenicity of natural bacterial and synthetic pneumococci antigens. Materials and methods. Surface markers of dendritic cells (DC), mononuclear leukocytes (ML) and cytokine levels were determined by flow cytometry; IgG titers — by EIA. Protective activity
was evaluated in experiments with active protection of mice from infection with virulent pneumococci strains. Results. Aluminium hydroxide increased the ML content of mice spleen expressing TLR2 and TLR4. Its addition into the culture of immature DC induced the appearance of a population of cells with mature DC markers — CD83, CD80, CD86, however, the level of undifferentiated cells (CD34) and cells with adhesion molecules (CD11c, CD38) did not change. DC produced IL-ф, IL-5, IL-10, IFNy into the cultivation medium. An increase of cytokine production took place 2 hours after the administration into mice and was retained for the observation period (24 hours). Thi (IFNy, TNFa) and Th2 (IL-5, IL-10, GM-CSF) cytokine production gave evidence on immune response polarization by Th1/Th2 type. After 2 administrations of aluminium hydroxide into mice the number of ML with CD19+, CD5+, NK1.1+, CD25+, MHCII+ markers increased during decrease of CD3+, CD4+ and CD8+ T-lymphocytes. Adaptive immunity activation was characterized by high IgG titers to pneumococci capsule polysaccharide and protection of 90 — 100% of the mice against infection with lethal doses of S. pneumoniae strains, was detected during 2-fold immunization of mice with conjugates of synthetic pneumococci oligosaccharides with BSA, sorbed onto aluminium hydroxide, whereas natural bacterial antigens provided 90 — 100% survival of animals during immunization without the adjuvant. Conclusion. Data are provided on the effect of aluminium hydroxide on key effectors of innate immunity: DC, ML, TLRs and cytokine production. A reasonable administration of this adjuvant was shown to be in association with conjugates of pneumococci synthetic oligosaccharides with a carrier protein.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 59—67
Key words: aluminium hydroxide, innate immunity, dendritic cells, cytokines, adjuvant effect, conjugate, synthetic oligosaccharides, pneumococcus
ВВЕДЕНИЕ
Принцип усиления иммунного ответа на антигены микробного происхождения с помощью адъювантов сформулирован Г.Рамоном и А.Т.Гленни (1926 г.), предложивших использовать для этой цели соли алюминия [5, 16, 17]. Несмотря на последующие открытия других стимуляторов иммунитета, основными адъювантами в составе вакцин для иммунизации человека и животных остаются гидроксид и фосфат алюминия [12, 21].
В 80-е годы ХХ века на основе достижений молекулярной биологии и генной инженерии начался период перехода к новым современным технологиям конструирования вакцин, включающим рекомбинантные, субъединичные, синтетические и другие препараты. К настоящему времени известно, что большая часть вакцин, полученных при использовании указанных технологий, обладает слабой иммуногенно-стью. Это объясняется отсутствием или недостаточным содержанием в них патоген-ассоциированных структур микроорганизмов (ЛПС, пептидогликан, тейхоевые кислоты и др.), необходимых для взаимодействия с паттерн-распознающими рецепторами клеток системы врожденного иммунитета (семейство ТоП-подобных, NOD-подобных рецепторов и др.), запускающих каскад сигналов для активации иммунных реакций.
Недостатки этих антигенных препаратов компенсируют адъювантами, разработка которых является приоритетным направлением современной вакцинологии. Экспериментально исследуют большое количество новых адъювантов различной природы [3, 6, 7], однако разрешены к применению в клинической практике только соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59.
Несмотря на многолетнюю историю применения гидроксида алюминия, механизм его адъювантного действия не до конца понятен. До последнего времени существовало мнение, что гидроксид алюминия, введенный в организм в ассоциации с антигеном, создает депо, откуда антиген медленно элиминирует. При этом возникает воспалительный очаг, привлекающий антигенпрезентирующие клетки (АПК). Адсорбированные на гидрооксиде алюминия антигены активнее фагоцитируются макрофагами и дендритными клетками и становятся более иммуногенными [8, 9, 15, 19]. Прямого лиганд-рецепторного действия гидроксида алюминия с АПК не уста-
новлено. По данным Sun H. et al., гидроксид алюминия не вызывал созревания дендритных клеток in vitro [20].
В последние годы знания о механизме действия адъювантов существенно дополнены на основе современных достижений, раскрывших новые функциональные возможности системы врожденного иммунитета. Механизм активации гидроксидом алюминия сигнальных путей, приводящих к развитию антигенспецифического адаптивного иммунитета, в настоящее время дискутируется в литературе. Полагают, что в регуляции иммунного ответа участвуют внутриклеточные NOD-подобные рецепторы (NOD-like receptors, NLRs) [23]. NLRP3 активирует каспазу-1, запуская секрецию IL-1ß и IL-18 по инфламмасома-опосредованному пути [4, 10, 11].
Отсутствие достаточных сведений о механизме действия этого адъюванта на функциональную активность системы врожденного иммунитета и имеющаяся у нас возможность исследовать эти вопросы при введении гидроксида алюминия с природными и синтетическими антигенами пневмококка явились предпосылкой для проведения настоящего исследования.
Цель работы — исследование действия гидроксида алюминия на молекулярно-клеточные механизмы активации системы врожденного иммунитета и его адъювант-ное действие на иммуногенность природных бактериальных и синтетических антигенов пневмококка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использованы мыши линии СВА и BALB/c массой 14 — 16 г самки/самцы из питомника НЦ биомедицинских технологий (филиал «Андреевка»); штаммы S. pneumoniae из коллекции НИИВС им.И.И.Мечникова; гидроксид алюминия (Alum hydroxide gel A1H3O3 фирмы «Sigma-Aldrich»).
Бактериальные препараты S. pneumoniae получены двумя методами. При использовании первого метода антигены получали осаждением ацетоном из культуральной надосадочной жидкости [1]. По химическому составу препараты содержали 4 — 8% белка и 1 — 6% углеводов. При использовании второго метода получали комплекс антигенов клеточной стенки S. pneumoniae [2]. Для этого микробные клетки высушивали ацетоном и проводили водную экстракцию. По химическому составу препарат содержал 51% белка и 8,3% углеводов. Полученные препараты использовали для иммунизации животных в дозах 10 и 50 мкг в расчете на мышь соответственно. Гидроксид алюминия прибавляли к препаратам из расчета 0,5 мл на 1 мг, сорбцию проводили в течение ночи при 4°C.
Конъюгаты синтетических олигосахаридов, отражающих участки цепи капсуль-ного полисахарида S. pneumoniae серотипов 3 и 14, с БСА, получали скваратным методом. Конъюгат дисахарида — повторяющегося участка капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3 с БСА [ßG1cA-(1-4)ß-G1c-O-spaсer]l9-BSA содержал 19% углеводов; конъюгат гексасахарида, отражающего фрагмент цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, с БСА [ß-Gal-(1-4)-ß-Glc-(1-6)-[ß-Gal-(1-4)]-ß-GlcNAc-(1-3)-ß-Gal-(1-4)-ß-Glc-O-spacer]15-BSA содержал 9% углеводов. Разовая иммунизирующая доза конъюгатов дисахарида и гексасахарида составляла 8 и 10 мкг/ мышь соответственно в расчете на олигосахарид.
Иммунизацию проводили двукратно внутрибрюшинно с интервалом 14 суток. Определение титров IgG и протективную активность оценивали через 2 недели после второй иммунизации.
При определении титра сывороточных IgG к капсульному полисахариду S. pneumoniae в качестве покрывающих лунки антигенов использовали препараты бактериальных капсульных полисахаридов соответствующих серотипов пневмококка в дозе 1 мкг в расчете на лунку.
Протективную активность препаратов определяли при внутрибрюшинном заражении иммунизированных мышей штаммами серотипов 3 и 14 через 2 недели после
последней иммунизации. Для контроля заражающей дозы S. pneumoniae использовали интактных животных. Гибель мышей регистрировали в течение 10 суток.
Дендритные клетки генерировали из костного мозга мышей линии СВА. Костный мозг 6 мышей гомогенизировали в среде RPMI-1640 (Sigma, США), трижды осаждали центрифугированием при 250 g в течение 5 мин и переводили в обогащенную среду культивирования (106 клеток в 1 мл среды RPMI-1640 с добавлением 100 мкг/ мл гентамицина сульфата и 10 % термоактивированной эмбриональной телячьей сыворотки — ЭТС), содержащей по 20 нг/мл рекомбинантных GM-CSF и IL-4 (Biosource, США). Для оценки индукции созревания дендритных клеток на шестые сутки производили смену среды с добавлением 12,5 мкл/мл гидроксида алюминия. В качестве положительного контроля использовали TNFa (20 нг/мл, Biosource, США).
Оценку поверхностных антигенов и TLRs на мононуклеарных лейкоцитах селезенки мышей проводили с использованием моноклональных антител (Caltag Laboratories, США) против соответствующих антигенов. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и окрашивали FITC (флюоресциинизотиоционат) и PE (фикоэритрин)-меченными антителами согласно инструкции производителя. Результаты учитывали на проточном цитометре FC-500 (Beckman Culter, США). На дендритных клетках, полученных из клеток костного мозга мышей, исследовали уровень экспрессии молекул CD34, CD11^ CD38, CD80, CD86, CD83, МНС класса II. На монокулекарных лимфоцитах селезенки мышей исследовали уровень экспрессии СD3, CD4, CD8, CD19, CD5, CD25, NK1.1, MHC класса II, TLRs 2, 4 и др. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10000 клеток в гейте.
Уровень цитокинов определяли в сыворотках крови мышей методом проточной цитофлуорометрии при использовании коммерческих тест-систем «FlowCytomixMouse Thl/Th2 10 plex» (фирма «BenderMedSystems»).
Статистическую обработку данных проводили c использованием компьютерных программ Microsoft Exсel 2007, Biostat и Statistica 10. Обработка данных проточной цитометрии проведена при помощи программного пакета WinMDI 2.8.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Показатели активации врожденного иммунитета под действием гидроксида алюминия определяли по уровню экспрессии TLR2 и TLR4 на мононуклеарных лейкоцитах селезенок мышей, созреванию дендритных клеток и продукции цитокинов.
На 7 сутки после однократного введения гидроксида алюминия увеличивалось число клеток, экспрессирующих TLR2, до 20,2±2,1% против 3,6±0,3% у интактных мышей. После двукратного введения этот показатель значимо увеличивался до 50,0±4,4% по сравнению с однократным введением. Повышение TLR4 выявлено только после первого введения адъюванта.
Таблица 1. Иммунофенотип дендритных клеток, генерированных из костного мозга мышей на 9 сутки культивирования
Индуктор созревания Количество клеток, экспрессирующих поверхностные молекулы, % (M±m)
дендритных клеток CD34 CD11c CD38 CD14 CD80 CD86 CD83 МНСП
Гидроксид алюминия 41,1+3,6 9,5+0,8 0,2+0,02 23,3+2,1 54,8+5,2* 5,1+0,4* 22,0+1,8* 20,3+3,4*
Контроль (без индукто- 38,6±2,9 4,8+0,4 0,3+0,1 22,9+2,1 11,3+1,3 2,1+0,3 3,1+0,2 6,5+0,6
ра созревания)
Контроль (+), 10,7+0,6 39,5+2,9 37,5+3,1 69,3+5,1 75,2+5,3 9,6+1,0 42,8+3,3 52,3+4,1
инд. созр. — TNFa *)** *)** *)** *)**
Примечание. * Достоверность различий с контролем (без индуктора созревания), р<0,05; ** между гидроксидом алюминия и положительным контролем. Мыши линии СВА, самки, п=6.
Таблица 2. Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей в разные сроки после однократного внутрибрю-шинного введения гидроксида алюминия
Препарат Время, Содержание цитокинов в сыворотке крови мышей, пкг/мл (М±т)
ч ПЛР 1Ь-2 1Ь-4 1Ь-5 1Ь-6 1Ь-10 1Ь-17 TNFa GM-CSF №N7
Гидроксид 2 10,2+1,0* 1,9+0,2 3,6+0,3 2,9+0,4 5,1+0,4 11,3+1,1* 11,0+1,2 26,7+2,5* 43,5+0,4* 6,2+0,2*
алюминия 4 14,8+1,7* 2,4+0,4 7,7+0,5 7,3+0,3* 4,4+0,4 15,5+0,9* 12,1+1,8 29,7+3,3* 12,3+1,7* 7,1+0,6*
8 19,2+1,5* 2,6+0,3 5,2+0,6 10,1+0,9* 5,9+0,6 16,8+1,4* 12,7+1,6 37,2+3,2* 14,2+1,6* 9,3+0,5*
24 12,3+0,9* 2,8+0,4 5,3+0,6 9,2+0,4 8,3+0,5 19,3+1,7* 14,3+1,7 25,2+2,6* 11,3+1,0* 9,6+1,1*
Контроль — 5,1+0,6 2,2+0,3 3,3+0,2 3,2+0,2 6,9+0,7 7,5+0,5 8,8+0,5 18,5+1,7 3,9+0,4 3,0+0,4
(интакные)
Примечание. * Различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05. Мыши линии СВА, самки, п=6.
Для оценки влияния гидроксида алюминия на созревание дендритных клеток его прибавляли в среду культивирования незрелых дендритных клеток (табл. 1). Опыт сопровождали положительным контролем (опухоль-некротизирующий фактор — TNFa). Выявлены определенные особенности действия гидроксида алюминия на созревание дендритных клеток. Во-первых, не изменялось количество недифференцированных клеток (CD34+) и клеток с молекулами адгезии (CD11c+ и CD38+), тогда как дендритным клеткам, созревшим под действием классического индуктора созревания TNFa, свойственна динамика этих маркеров. Во-вторых, существенно повышался, по сравнению с контролем (без индуктора созревания), процент зрелых дендритных клеток с маркером CD83+, клеток с костимуляторными молекулами CD86+, CD80+ и молекулами антигенного представления МНСП+. Однако все показатели, характерные для зрелых дендритных клеток, были существенно ниже, чем при их созревании под действием TNFa. Вероятно, под действием гидроксида алюминия формировалась популяция зрелых клеток с фенотипом CD83, CD80, CD86, несущих на своей поверхности молекулы антигенного представления МНС класса II.
Одним из показателей зрелости дендритных клеток является продукция ими цитокинов в среду культивирования. Под действием гидроксида алюминия дендритные клетки продуцировали в культуральную среду ^-ф, ^-5, ^-10, №N7 при снижении продукции GM-CSF.
Важно отметить, что под действием гидроксида алюминия в среде культивирования по сравнению с контролем (без индуктора созревания) происходило существенное повышение провоспалительного цитокина ^-1р, противовоспалительных цитокинов ^-5 и ^-10, а также №N7 в количестве, сопоставимом с действием классического индуктора созревания дендритных клеток TNFa.
Наряду с этим исследовали профиль и уровень цитокинов в сыворотке крови мышей через 2, 4, 8 и 24 ч после однократного введения гидроксида алюминия (табл. 2).
В этом исследовании получены важные данные об увеличении продукции цито-кинов ^-1р, ^-10, TNFa, GM-CSF, №N7 уже через 2 ч после введения мышам ги-дроксида алюминия, что являлось следствием активации клеток системы врожденного иммунитета. Существенное увеличение указанных цитокинов, в том числе ^-5, наблюдали в течение всего срока исследования. Выработка ТЫ (1К№у, TNFa) и ТИ2 (^-5, ^-10, GM-CSF) цитокинов свидетельствовала о реакции иммунной системы и поляризации иммунного ответа по ТЬ1/ТЬ2 типам.
Иммунный ответ на введение мышам гидроксида алюминия также проявлялся в изменении иммунофенотипа мононуклераных лейкоцитов селезенки мышей (табл.3). На 7 сутки после введения гидроксида алюминия увеличивалось содержание CD19+, CD5+ (В1), Тге§+, МНС11+клеток и снижалось по сравнению с контролем количество CD4 +, CD8+ Т-лимфоцитов.
Таблица 3. Иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов мышей на 7 и 14 сутки после однократного вну-трибрюшинного введения гидроксида алюминия
Срок исследования, сут Количество клеток, экспрессирующих поверхностные молекулы, % (M+m)
Препарат CD3 CD4 CD8 CD19 CD5 (В1) NK yST CD25 Treg MHC II
Гидроксид 7 32,0±3,7 10,9+1,3# 7,0+0,5# 25,2+2,6* 30,6+3,3* 13,1+1,7 3,3+0,4 1,2+0,2 2,2+0,3* 37,5+2,9*
алюминия
Контроль интактные 40,6+3,7 21,3+2,7 16,0+1,5 10,7+0,7 2,2+0,2 13,8+0,4 6,2+5,0 1,6+0,3 1,3+0,2 28,5+3,1
Гидроксид 14 22,9+2,4# 18,3+1,4 5,3+0,3# 5,4+0,5 9,8+0,7* 52,0+4,2* 5,9+0,5 9,8+0,7* 2,8+0,2* 50,7+4,7*
алюминия
Контроль интактные 32,4+3,2 20,6+2,0 11,7+0,7 6,8+0,2 1,5+0,3 13,9+1,1 4,1+0,3 1,5+0,3 2,4+0,3 35,2+3,3
Примечание. * Достоверность различий с контролем; # снижение показателя по сравнению с контролем, p<0,05. Мыши линии СВА, самки, n=6.
Более выраженные изменения отмечали на 14 сутки после однократного введения гидроксида алюминия. В этот срок повышалась число клеток с маркерами CD5+, NK, CD25+, Treg, MHCII+ при снижении CD3+ и CD8+, появлялся рецептор к IL-2 (CD25+) и значительно увеличивалось содержание NK-клеток на фоне снижения общих Т-лимфоцитов (CD3+). Сниженным в этот срок оставалось содержание CD8 Т-лимфоцитов.
На фоне выявленных особенностей действия гидроксида алюминия на систему врожденного иммунитета исследовали его адъювантное действие на активацию адаптивного антимикробного иммунитета при введении с бактериальными антигенами пневмококка, полученными из микробных клеток S. pneumoniae, и методами химического синтеза. Сравнение проводили с теми же антигенами, но не сорбированными на гидрооксиде алюминия. Результаты оценивали на 14 сутки после двукратной иммунизации по титру IgG и защите от заражения гомологичными серотипами пневмококка
Выявлены существенные различия в адъювантном действии гидроксида алюминия при введении с антигенами, выделенными из микробных клеток S. pneumoniae, и синтетическими олигосахаридами S. pneumoniae, конъюгированными с БСА. Установлено, что природные бактериальные антигены S. pneumoniae при введении без адъюванта обеспечивали выживаемость 80 — 100%, тогда как при сорбции их на гидроксиде алюминия протективная активность снижалась до 20 — 40%. Напротив, конъюгаты синтетических олигосахаридов, отражающие участки цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae соответствующего серотипа, с БСА, при сорбции на гидроксиде алюминия способствовали выработке IgG к капсульному полисахариду (1:1600 — 1:9600) гомологичного серотипа S. pneumoniae. Несорбированные препараты не вызывали повышения уровня IgG, и их уровень оставался таким же, как у интактных мышей (1:150 — 1:200). Сорбированные на гидрооксиде алюминия глико-конъюгаты обеспечивали 90 — 100% защиту от заражения, а несорбированные — не обладали протективной активностью. При проведении комбинированной иммунизации (первая сорбированным, вторая несорбированным гликоконъюгатом) титр IgG и протективная активность несколько снижались.
Полученные данные свидетельствуют о том, что неочищенные бактериальные антигены S. pneumoniae не требуют сорбции на гидроксиде алюминия, тогда как синтетические олигосахариды, конъюгированные с БСА, нуждаются в присутствии адъюванта.
ОБСУЖДЕНИЕ
Представлены данные о механизме действия наиболее распространенного и разрешенного для клинического использования адъюванта — гидроксида алюминия на систему врожденного иммунитета, а также его действие на активацию адаптивного иммунитета при введении с бактериальными и синтетическими антигенами пневмококка.
Проведена оценка действия гидроксида алюминия на эффекторы врожденного иммунитета: экспрессию TLR2/TLR4 и поверхностных маркеров мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей, созревание дендритных клеток, профиль и уровень цитокинов в среде культивирования дендритных клеток и в сыворотке крови животных.
Показано, что гидроксид алюминия приводит к повышению числа клеток, экс-прессирующих TLR2 и TLR4 на мононуклеарных лейкоцитах селезенки мышей. До сих пор нет единого мнения о возможности прямой активации клеток к экспрессии TLRs под влиянием этого адъюванта. Есть данные, что адъювантное действие гидрок-сида алюминия связано со стрессовым воздействием на клетки иммунной системы белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа, активирующего последующий каскад иммунных реакций [13, 22]. В то же время, не исключается прямое воздействие адъюванта на TLR2, как это показано для насыщенной пальмитиновой кислоты, не имеющей патоген-ассоциированных молекулярных структур [18]. Есть и другие данные: так, N-propionyl cysteaminylphenol-maleimide-dextran стимулировал продукцию TNFa и IL-8 моноцитарной клеточной линией THP-1, однако при добавлении анти-TLR4 моноклональных антител в культуру клеток происходило ингибирование секреции TNFa (Mizote Y et al., 2013). Это свидетельствует о связи продукции TNFa с активацией TLR4.
В наших исследованиях при оценке действия гидроксида алюминия на созревание дендритных клеток получен неоднозначный результат. Число недифференцированных клеток (CD34) и молекул адгезии (CD11^ CD38) оставалось на исходном уровне. При этом увеличивалось число клеток с маркерами, характеризующими их как зрелые, несущие маркер терминальной дифференцировки CD83, костимуляторные молекулы CD80 и CD86, а также молекулы антигенного представления МНС класса II. Возможно, среди общей популяции клеток образовывалась фракция зрелых дендритных клеток, продуцировавших в среду культивирования IL-1P, IL-5, IL-10 и IFNy. Полученные данные отличаются от результатов Sun H. et al. [20] показавших, что алюминий не вызывает созревания дендритных клеток, генерированных из костного мозга мышей. При этом авторы оценивали только экспрессию костимуляторных молекул и МНС класса II.
Данные, полученные в работе, свидетельствуют о том, что выявленное in vitro созревание дендритных клеток (хотя и в значительно меньшей степени, чем при действии классического индуктора созревания TNFa) могло быть вызвано взаимодействием адъюванта с рецепторным аппаратом дендритных клеток (TLRs/NLRs), поскольку действие гидроксида алюминия происходило не в организме, а в среде культивирования с последующей активацией транскрипционного ядерного фактора NF-kB и экспрессией генов провоспалительных цитокинов. Таким образом, в этом исследовании показана активация гидроксидом алюминия дендритных клеток, сопровождающаяся усилением их функциональной активности, а именно продукцией цитокинов в среду культивирования.
Примерно те же цитокины (IL-1P, IL-5, IL-10, TNFa, GM-CSF и IFNy) продуцировали мононуклеарные лейкоциты селезенки мышей при однократном внутрибрю-шинном введении адъюванта. Содержание цитокинов определяли через 2, 4, 8 и 24 часа после ведения адъюванта. Увеличение цитокинов IL-1P, IL-10, TNFa, GM-CSF и, что очень важно, IFNy выявлено уже через 2 часа. Продукция IFNy, являющегося одним из ключевых индукторов активации иммунного ответа по TM^^^ выявленная в среде культивирования дендритных клеток и в сыворотке крови мышей, имеет значение в проявлении адъювантных свойств гидроксида алюминия. Такая динамика цитокинов сохранялась в течение срока наблюдения (24 часа) и свидетельствовала об активации Th1/Th2 лимфоцитов. Эти данные также не исключают возможность непосредственной активации TLRs под действием гидроксида алюминия.
После однократного введения гидроксида алюминия снижалось содержание CD4
5. ЖМЭИ 6 № 34
65
и CD8 Т-лимфоцитов при повышении CD19 и CD5 В-лимфоцитов. В более поздние сроки исследования появлялись клетки с маркером CD25 (рецептор к IL-2) и существенно повышалось содержание NK клеток, играющих, вероятно, важную роль в реализации адъювантного действия гидроксида алюминия. Это положение имеет подтверждение в результатах, полученных Lore K. et al., показавших, что гидроксид алюминия через молекулу NALP3 активирует В-клетки при участии NK [14].
Исследование адъювантного действия гидроксида алюминия при введении в ассоциации с неочищенными бактериальными и синтетическими антигенами пневмококка выявило существенные различия в активации адаптивного иммунитета, который оценивали по титрам IgG и протективной активности при заражении вирулентными штаммами S. pneumoniae.
Установлено, что полученные препараты бактериальных антигенов пневмококка обладают протективной активностью, которая при сорбции на гидрооксиде алюминия снижалась. Напротив, сорбция на гидрооксиде алюминия конъюгатов синтетических олигосахаридов пневмококка с БСА приводила к существенному повышению титра IgG к капсульному полисахариду и защите от заражения летальными дозами S. pneumoniae 90 — 100% животных. Полученные данные показали целесообразность сорбции на гидрооксиде алюминия конъюгатов синтетических олигосахаридов с белком-носителем.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев Д.С., Семенова И.Б., Волох Ю.В., Кудряшов А.В., Маркова М.Е., Романенко Э.Е., Батуро А.П., Михайлова Н.А. Изучение протективной активности белоксодер-жащего комплекса антигенов Streptococcus pneumoniae в гомологичной системе. Журн. микрбиол. 2013, 1: 21-26.
2. Курбатова Е.А., Воробьев Д.С., Егорова Н.Б., Батуро А.П., Романенко Э.Е., Маркова М.Е., Елкина С.И., Волох Ю.В., Цветков Ю.Е., Сухова Е.В., Яшунский Д.В., Нифантьев Н.Э., Михайлова Н.А. Штаммовые различия внутривидовой иммуногенной активности антигенных компонентов Streptococcus pneumoniae. Журн. микробиол. 2013, 5: 60-69.
3. Allison A.C., Byars N.E. Immunological adjuvants: desirable properties and side-effects. Mol. Immunol. 1991, 28: 279-84.
4. Franchi L., NMez G. The NLRP3 Inflammasome is critical for alum-mediated IL-1 Psecretion but dispensable for adjuvant activity. Eur. J. Immunol. 2008, 38 (8): 2085-2089.
5. Glenny A.T., Pope C.G., Waddington H., Wallace V. The antigenic value of toxoid precipitated by potassium-alum. J. Path. Bact. 1926, 29: 38-45.
6. Johnson A.G., Gaines S., Landy M. Studies on the O-antigen of Salmonella typhosa. V Enhancement of antibody response to protein antigens by the purified lipopolysaccharide. J. Exp. Med. 1956, 103: 225-246.
7. Kensil C.R. Saponins as vaccine adjuvants. Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 1996, 13: 1-55.
8. Kool M., Soullie T., van Nimwegen M. et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J. Exp. Med. 2008, 205: 869-882.
9. Kool M., Edge C. Alum adjuvant stimulates inflammatory dendritic cells through activation of the NALP3 inflammasome. J. Immunol. 2008, 181: 3755-3759.
10. Li H., Nookala S., Re F. Aluminum hydroxide adjuvants activate caspase-1 and induce IL-1beta and IL-18 release. J. Immunol. 2007, 178: 5271-5276.
11. Li H., Willingham S.B., Ting J. P-Y. et al. Inflammasome activation by Alum and Alum's adjuvant effect are mediated by NLRP3. J. Immunol. 2008, 181 (1): 17-21.
12. Lindblad E.B. Aluminium compounds for use in vaccines. Immunol. Cell. Biol. 2004, 82: 497-505.
13. Lindblad E. B. Are mineral adjuvants triggering TLR2/TLR4 on dendritic cells by a secondary cascade reaction in vivo through the action of heat shock proteins and danger signals? Vaccine. 2006, 24: 697-698.
14. Lore K. et al. Novel adjuvants for B cell immune responses. Curr. Opin. HIV AIDS. 2009, 4 (5): 441-446.
15. Mannhalter J.W., Neychev H.O., Zlabinger G.J. et al. Modulation of the human immune
response by the non-toxic and non-pyrogenic adjuvant aluminium hydroxide: effect on antigen uptake and antigen presentation. Clin. Exp. Immunol. 1985, 61: 143-151.
16. Ramon G. Precedes pour accroitre la production des antitoxins. Ann. Inst. Pasteur. 1926, 40: 1-10.
17. Ramon G. Sur l'augmentation anormale de l'antitoxine chez les chevaux producteurs de serum antidiphterique. Bull. Soc. Centr. Med. Vet. 1925, 101: 227-234.
18. Snodgrass R.G., Huang S., Choi I.W. et al. Inflammasome-mediated secretion of IL-1ß in human monocytes through TLR2 activation; modulation by dietary fatty acids. J. Immunol. 2013, 191 (8):4337-4347.
19. Sokolovska A., Hem S.L. et al. Activation of dendritic cells and induction of CD4(+) T cell differentiation by aluminum-containing adjuvants. Vaccine. 2007, 25: 4575-4585.
20. Sun H., Pollock K.G., Brewer J.M. Analysis of the role of vaccine adjuvants in modulating dendritic cell activation and antigen presentation in vitro. Vaccine. 2003, 21: 849-855.
21. Vogel F.R., Powell M.F. A summary compendium of vaccine adjuvants and excipients. New York, Plenum Publishing Corp., 1995.
22. Wang Y., Rahman D., Lehner T. A comparative study of stress-mediated immunological functions with the adjuvanticity of alum. J. Biol. Chemistry. 2012, 287 (21): 17152-17160.
23. Williams A., Flavell R.A., Eisenbarth S.C. The role ofNOD-like Receptors in shaping adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 2010, 22 (1): 34-40.
Поступила 20.03.14
Контактная информация: Курбатова Екатерина Алексеевна, д.м.н., проф.,
105064, Москва, М. Казенный пер., 5А, р.т. (495)917-57-74
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
© И.В.ГЛАДЫШЕВА, С.В.ЧЕРКАСОВ, 2014
И.В.Гладъшева, С.В.Черкасов
РОЛЬ ФИБРОНЕКТИНА В АДГЕЗИИ КОРИНЕБАКТЕРИЙ К ВАГИНАЛЬНЫМ ЭПИ-ТЕЛИОЦИТАМ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Определение роли фибронектина в адгезии коринебактерий к вагинальным эпителиоцитам. Материалы и методы. Использованы микроорганизмы рода СогупеЪа^е-гшт и первичные эпителиоциты, выделенные из нижнего отдела репродуктивного тракта женщин. Адгезивную способность коринебактерий изучали на полистироловых планшетах к фиксированному фибронектину и на модели вагинальных эпителиоцитов. Оценивали изменение адгезии коринебактерий к вагинальным эпителиоцитам после обработки последних фибронектином. Результаты. Все исследуемые штаммы обладали способностью адгезии к фибронектину и вагинальным эпителиоцитам. Одни и те же штаммы были отнесены к группам высоко-, средне-, и низкоадгезивных с использованием как планшетного метода, так и метода с использованием модели вагинальных эпите-лиоцитов, что говорит об их сопоставимости. При добавлении к эпителиоцитам фибро-нектина происходило усиление адгезии у всех исследуемых штаммов коринебактерий. Показатель адгезии у штаммов, выделенных от здоровых женщин, в среднем увеличивался на 46,6%, индекс адгезии на 10,5 бактер. кл/эпител. У штаммов, выделенных от женщин с микроэкологическими нарушениями, усиление адгезии было на 15,3% и 4,9 бактер. кл/ эпител. соответственно. Заключение. Фибронектин является фактором, определяющим адгезию коринебактерий к вагинальным эпителиоцитам, и, таким образом, имеет значение для формирования ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин. Полученные данные открывают перспективу использования фибронектина в целях повышения колонизирующей способности пробиотиков.
