CC BY
56
_НОВЫЕ МЕТОДЫ И ИНСТРУМЕНТЫ_
УДК 612.112.9.014.43
РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ОКОЛОНУЛЕВЫХ ТЕМПЕРАТУР
Евгений Павлович Сведенцов, Денис Сергеевич Лаптев, Татьяна Витальевна Туманова, Ольга Нурзадиновна Соломина, Оксана Олеговна Зайцева, Андрей Николаевич Худяков,
Лаборатория криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (директор — акад. РАН, проф. Ю.С. Оводов) ), г.Сыктывкар, e-mail: ddic@yandex.ru
Реферат
Предложен эффективный, доступный и экономичный метод сохранения морфофункциональных свойств лейкоцитов крови человека в условиях околонулевых температур (от 0о до +2оС) в течение 6 суток с использованием оригинального ограждающего раствора.
Ключевые слова: лейкоциты, ограждающий раствор, околонулевые температуры
Длительное сохранение лейкоцитов в биологически полноценном состоянии при положительных температурах затруднено из-за их выраженного метаболизма и быстрого истощения энергетического потенциала. Известно [3, 7], что при +4оС жизнедеятельность лейкоцитов удается поддержать до 24 часов. В первую очередь страдает жизнеспособность грануло-цитов, которые имеют более сложную морфологическую организацию. Показано [5], что в
течение 48 часов в этих клетках происходят уплотнение ядерной мембраны, частичный лизис митохондрий, вакуолизация цитоплазмы. Поэтому для поддержания лейкоцитов и прежде всего гранулоцитов в жизнеспособном состоянии в условиях околонулевых (от 0о до +2оС) температур необходимо применение ограждающего раствора, позволяющего сохранить энергетические резервы клетки и способствующего быстрому восстановлению ее функциональной активности после отогрева.
Целью настоящей работы являлась разработка эффективного доступного и экономичного метода сохранения жизнеспособности лейкоцитов крови человека при околонулевых 558
температурах (от 0о до +2оС) с использованием оригинального ограждающего раствора.
Объектом исследования были лейкоцит-ные концентраты, полученные из цельной крови доноров-добровольцев путем цитофере-за (центрифуга Sorvell с ускорением 2500g и охлаждением в течение 5 минут, консервант CDF). Среднее количество биообъекта в плас-тикатном контейнере «Компопласт-300» составляло 25±5 мл.
Подготовка к охлаждению предусматривала выделение биоматериала в максимально жизнеспособном состоянии и смешивание его в соотношении 1:1 с консервантом. Всего использовали три варианта ограждающего раствора, отличавшихся друг от друга концентрацией ингредиентов (табл. 1): криопро-тектора смешанного действия гексаметилен-
бистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ), который стабилизирует фракции внутри- и внеклеточной воды; реставрирующей добавки 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина сукци-ната (ОМЭПС), обладающей антиоксидант-ным, антигипоксическим, мембраностабили-зирующим действиями, восстанавливающей нарушенные структуры и функции мембран клеток, а также тормозящей процессы пере-кисного окисления липидов, имеющие место при криоконсервации; желатиноля (кровезаменитель); цитрата натрия (антикоагулянт); глюкозы, которая, наряду с энергетической и пластической функциями, обладает также слабым протекторным действием. Данные
Таблищ 1
Состав трех вариантов ограждающего раствора с конечной концентрацией ингредиентов после смешивания с взвесью лейкоцитов для сохранения при 0—+2оС
Номер варианта раствора ГМБТОЭМ, % ОМЭПС, % Глюкоза, % Желатиноль, % Цитрат натрия, %
1 7,0 0,075 0,35 8,0 0,1
2 10,0 0,1 0,35 8,0 0,1
3 13,0 0,35 0,35 8,0 0,1
Таблищ 2
Морфофункциональные показатели лейкоцитов крови человека, подвергнутых охлаждению (от 0о до +2оС) с различными вариантами ограждающего раствора в течение 6 суток
Примечание: данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение; количество наблюдений для 1, 3-го вариантов раствора и контроля = 5; число наблюдений для 2-го варианта раствора = 9.
* Различия с данными по второму варианту раствора (р<0,05); # различия с данными контроля (р<0,05).
консервирующие растворы нетоксичны и не требуют отмывания от клеточной суспензии после отогрева. После 20 минут экспозиции при комнатной температуре биообъект в полипропиленовых пробирках по 1,5 мл помещали в холодильник (от 0о до +2оС). В контрольной серии экспериментов лейкоциты выдерживали в условиях околонулевых температур (от 0о до +2оС) без консерванта.
Исследования первой серии по изучению эозинорезистентности лейкоцитов, находящихся при температуре (от 0о до +2оС) в течение 8 суток показали, что количество жизнеспособных клеток значительно снижается до 35,67±3,21% (от исходного уровня) на 7-е сутки. Поэтому дальнейшие эксперименты проводились при сроке наблюдения до 6 суток включительно. Отогрев производили в условиях комнатной температуры в течение 2-3 минут при покачивании пробирки 2 раза в секунду. Показатели исходной и отогретой суспензий оценивали по следующим тестам: подсчет количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы определяли с использованием общепринятых в клинико-лабораторной практике методов, жизнеспособность лейкоцитов — с помощью витального красителя эозина по методу R. Schreck [8], фагоцитарную активность нейтрофилов — по методу С. Г. Потаповой и др. [4], микробицидность нейтрофилов — путем выявления лизосомально-катионных белков (ЛКБ) по методу А.А. Славинского, Г.В. Никитиной [6]. Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью критерия Уилкоксона [2].
При проведении контрольной серии опытов установлено (табл. 2), что введение в гипотермию без применения ограждающего раствора после отогрева биообъекта снижает относительное количество лейкоцитов (p<0,05), число эозинорезистентных клеток, гранулоци-тов, нейтрофилов, содержащих ЛКБ, а также нейтрофилов, способных к фагоцитозу, по сравнению с результатами, полученными в опытах с суспензией лейкоцитов при использовании ограждающего раствора. В опытной серии исследований с использованием ограждающих растворов установлено (табл. 2), что после отогрева лейкоцитного концентрата через 6 суток хранения в условиях гипотермии относительное количество клеток уменьшается не более чем на 12-18 %.
Анализ морфологического состава лейкоцитов, перенесших гипотермию (от 0о до +2оС), еще раз подтвердил большую устойчивость к
Варианты раствора Количество Относительное количество в % к исходному уровню
до охлаждения после отогрева
Абсолютное количество клеток в 1 мкл
1 8350±0,00 8340±1045 99,72±12,57#
2 17140±7886 16700±6575 88,83±6,79#
3 28500±0,00 27400±3984 95,40±14,79#
Контроль 45330±3904 36090±5378 75,7±9,10
Гранулоциты, %
1 33,00±0,00 17,00±2,16 51,47±6,57 #*
2 38,67±8,05 24,44±6,44 62,86±8,69 #
3 24,00±0,00 8,75±2,21 36,36±9,27 #*
Контроль 37,00±0,00 7,00±0,00 19,00±0,00
Моноциты, %
1 20,00±0,00 28,40±3,21 142,00± 16,05 #*
2 15,50±7,12 16,50±8,11 107,50±19,28
3 9,00±0,00 12,25±2,63 135,80±28,93
Контроль 24.00±0,00 27,50±0,71 114,00±2,82
Лимфоциты, %
1 48,00±0,00 59,40±6,35 117,20±13,22 #
2 48,89±0,92 61,67±3,67 125,80±8,21 #
3 63,00±0,00 80,75±4,99 128,00±8,16 #
Контроль 41,00±0,00 65,50±0,71 159,00±1,41
Эозинорезистентность, в %
1 100,00±0,00 84,80±3,63 84,80±3,63 #
2 99,25±1,03 81,12±9,53 81,88±8,75
3 100,00±0,00 66,40±8,20 66,40±8,20*
Контроль 99,00±0,00 66,00±15,56 66,00±15,56
Фагоцитарная активность нейтрофилов, в %
1 80,00±0,00 26,10±5,10 32,51±6,20 #*
2 66,17±5,60 35,60±7,71 52,66±8,59 #
3 45,00±0,00 16,50±0,70 37,00±1,40 #*
Контроль 86,00±0,00 11,25±6,72 13,08±7,81
Содержание лизосомально-катионных белков в ней-трофилах по ЛКБ-тесту
1 2,54±0,00 2,20±0,30 86,70±10,81
2 2,53±0,03 2,46±0,22 96,89±7,93 #
3 2,24±0,00 1,72±0,29 76,60±12,99*
Контроль 2,32±0,00 1,53±0,66 65,50±28,00
повреждающим факторам лимфоцитов и моноцитов, меньшую — гранулоцитов, что объясняется их более сложной структурной организацией [1]. Количество лимфоцитов и моноцитов ввиду снижения числа гранулоцитов в лейко-концентрате после отогрева относительно увеличивается (табл. 2). Установлено, что второй вариант ограждающего раствора лучше сохраняет морфологическую целостность гранулоци-тов, чем 1 и 3-й варианты (р<0,05).
Определение жизнеспособности лейкоцитов с помощью витального красителя эозина [8] показало, что лучшими ограждающими свойствами обладают 1 и 2-й варианты раствора. Под их защитой в течение 6 суток сохраняется соответственно 84,80±3,63% и 81,80±8,75% (от исходного уровня) клеток с целостной мембраной, тогда как 3-й вариант раствора достоверно (р<0,05) снижает этот показатель.
Биологическую полноценность нейтрофи-лов определяет их фагоцитарная активность (ФАН). Её оценка в пробах с латексом [4] показала, что при использовании 1 и 3-го вариантов раствора после отогрева через 6 суток лишь 32,51±6,20% и 44±12,17% нейтрофилов соответственно сохраняют способность к фагоцитозу, что ниже (р<0,05), чем при использовании 2-го варианта ограждающего раствора (52,66±8,60%).
Показателем, обеспечивающим микроби-цидность нейтрофилов без участия кислорода, является количество ЛКБ. После 6 суток экспозиции со 2-м вариантом ограждающего раствора содержание ЛКБ составляло 96,89±7,93%, что выше (р<0,05) результатов, полученных в опытах с 3-м вариантом (76,60±12,99%). Результаты, полученные при использовании 1 и 2-го вариантов раствора, достоверных отличий не имеют. Общий итог исследований показал, что наилучшими ограждающими свойствами по большинству показателей обладает 2-й вариант ограждающего раствора, на который нами получен патент РФ №2311027 от 27 ноября 2007г.
ВЫВОДЫ
1. Полученные результаты свидетельствуют о возможности сохранения в течение 6 суток морфофункциональных свойств лейкоцитов крови человека в условиях околонулевых (от 0о до +2оС) температур с использованием 2-го варианта рецептуры оригинального консервирующего раствора.
2. Предложенный способ сохранения ядерных клеток крови является доступным, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов и может быть использован в научно-исследовательской практике учреждений медицинского и биологического профиля.
ЛИТЕРАТУРА
1. БелоусА.М., Грищенко В.И. Криобиология. — Киев: Наукова думка, 1994.
2. Гланц С. Медикобиологическая статистика. — М., Практика, 1998.
3. Основы трансфузиологии [под ред. М. Ф. Зарив-чацкого]. Пермь: Изд-во Пермского ун-та, 1995. — 318 с.
4. Потапова С.Г., Хрустиков В.С., Демидова Н.В., Козинец Г.И. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса// Пробл. гематол. и перелив. крови. — 1977. — № 9. — С. 58-59.
5. Мовшев Б.Е., Витвицкий В.М., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Трансфузионные среды: перспективы. // Новое в трансфузиол. — 2001. — № 28. — С. 38.
6. Славинский А.А., Никитина Г.В. Цитохимическое выявление катионных белков в гранулоцитах крови амидочерным 10Б для визуальной оценки и компьютерного анализа изображения // Клин. лаб. диагн. — 1999. — № 2. — С.35-37.
7. Румянцев А.Г., Аграненко О.А. Клиническая транс-фузиология. — М.: ГЭОТАР Медицина, 1998.
8. Schreck R. A method for couting the viable cells in normal and malignant cell suspension// Ann. J. Cancer. — 1936. — Vol. 28 — P. 389-391.
Поступила 29.02.07.
DEVELOPMENT OF A NEW METHOD OF PRESERVING VIABLE LEUKOCYTES IN NEAR-ZERO TEMPERATURE CONDITIONS
E.P. Svedentsov, D.S. Laptev, T.V. Tumanova,
O.N. Solomina, O.O. Zaitseva, A.N. Khudyakov
Summary
An effective and economical method of preservation of viable leukocytes in near-zero temperature conditions for 6 days by using an original protective solution is described.
