CC BY
25
Гематология и трансфузиология. 2016; 61(4)
DOI http://dx .doi.org/10.18821/0234-5730-2016-61-4-200-204
Оригинальная статья
2. Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P. J., East C., Fourouclas N., Swanton S., et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet. 2005; 365(9464): 1054-61.
3. Catalog of somatic mutations in cancer. http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic
4. Scott L.M. The JAK2 exon 12 mutations: a comprehensive review. Am. J. Hematol. 2011; 86(8): 668-76.
5. Wu Z., Zhang X., Xu X., Chen Y., Hu T., Kang Z., et al. The mutation profile of JAK2 and CALR in Chinese Han patients with Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms. J. Hematol. Oncol. 2014; 7: 48. doi: 10.1186/s13045-014-0048-6.
6. Pardanani A., Lasho T.L., Finke C., Hanson C.A., Tefferi A. Prevalence and clinicopathologic correlates of JAK2 exon 12 mutations in JAK2V617F-negative polycythemia vera. Leukemia. 2007; 21(9): 1960-3.
7. Passamonti F., Elena C., Schnittger S., Skoda R.C., Green A.R., Girodon F., et al. Molecular and clinical features of the myeloproliferative neoplasm associated with JAK2 exon 12 mutations. Blood. 2011; 117(10): 2813-6.
8. Pietra D., Li S., Brisci A., Passamonti F., Rumi E., Theocharides A., et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negative myeloproliferative disorders. Blood. 2008; 111(3): 1686-9.
9. Scott L.M., Tong W., Levine R.L., Scott M.A., Beer P.A., Stratton M.R., et al. Green AR. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idio-pathic erythrocytosis. N. Engl. J. Med. 2007; 356(5): 459-68.
10. Percy M.J., Scott L.M., Erber W.N., Harrison C.N., Reilly J.T., Jones F.G., et al. The frequency of JAK2 exon 12 mutations in idiopathic eryth-rocytosis patients with low serum erythropoietin levels. Haematologica. 2007; 92(12): 1607-14.
11. Jones A.V., Cross N.C., White H.E., Green A.R., Scott L.M. Rapid identification of JAK2 exon 12 mutations using high resolution melting analysis. Haematologica. 2008; 93(10): 1560-4.
12. Ugo V., Tondeur S., Menot M.L., Bonnin N., Le Gac G., Tonetti C., et al.; French Intergroup of Myeloproliferative disorders. Interlaboratory development and validation of a HRM method applied to the detection of JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera patients. PLoS One. 2010; 5(1): e8893.
13. Schnittger S., Bacher U., Haferlach C., Geer T., Müller P., Mittermüller J., et al. Detection of JAK2 exon 12 mutations in 15 patients with JAK2V617F negative polycythemia vera. Haematologica. 2009; 94(3): 414-8.
14. Laughlin T.S., Moliterno A.R., Stein B.L., Rothberg P.G. Detection of exon 12 Mutations in the JAK2 gene: enhanced analytical sensitivity using clamped PCR and nucleotide sequencing. J. Mol. Diagn. 2010; 12(3): 278-82.
15. Furtado L.V., Weigelin H.C., Elenitoba-Johnson K.S., Betz B.L. A multiplexed fragment analysis-based assay for detection of JAK2 exon 12 mutations. J. Mol. Diagn. 2013; 15(5): 592-9.
16. Dunaeva E.A., Mironov K.O., Dribnokhodova O.P., Subbotina T.N., Bashmakova E.E., Olkhovskiy I.A., Shipulin G.A. The quantitative testing of V617F mutation in gen JAK2 using pyrosequencing technique.
Russian Clinical Laboratory Diagnostics Journal (Klinicheskaya labo-ratornaya diagnostika). 2014; 59(11): 60-3. (in Russian)
17. Mironov K.O., Dunaeva E.A., Dribnokhodova O.P., Shipulin G.A. Detection of genetic polymorphism with the use of Genetic analysis based on pyrosequencing PYROMARK Q24. Directory manager of clinical laboratory diagnostics. Russian Journal (Spravochnik zaveduyushchego KDL). 2011; 4: 39-48. (in Russian)
20. Lillie R.D. Histopathologic technic and practical histochemistry. New York: McGraw Hill Book Co; 1965.
21. Kjœr L., Westman M., Hasselbalch Riley C., H0gdall E., Weis Bjerrum O., Hasselbalch H. A highly sensitive quantitative real-time PCR assay for determination of mutant JAK2 exon 12 allele Burden. PLoS One. 2012; 7(3): 1-8.
22. Theocharides A., Passweg J.R., Medinger M., Looser R., Li S., Hao-Shen H., et al. The allele burden of JAK2 mutations remains stable over several years in patients with myeloproliferative disorders. Haematologica. 2008; 93(12): 1890-3.
23. Li S., Kralovics R., De Libero G., Theocharides A., Gisslinger H., Skoda R.C. Clonal heterogeneity in polycythemia vera patients with JAK2 ex-on12 and JAK2-V617F mutations. Blood. 2008; 111(7): 3863-6.
24. Tsiatis A.C., Norris-Kirby A., Rich R.G., Hafez M.J., Gocke C.D., Eshle-man J.R., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J. Mol. Diagn. 2010; 12(4): 425-32.
25. Dribnokhodova O.P., Mironov K.O., Dunaeva E.A., Demidova I.A., Barinov A.A., Voytsekhovskaya Ya.A., et al. The detection of activating somatic mutations in gene kras using pyrosequencing technique. Russian Clinical Laboratory Diagnostics Journal (Klinicheskaya laboratornaya diagnostika). 2013; 58(6): 49-51. (in Russian)
26. Xie G., Xie F., Wu P., Yuan X., Ma Y., Xu Y., et al. The mutation rates of EGFR in non-small cell lung cancer and KRAS in colorectal cancer of Chinese patients as detected by pyrosequencing using a novel dispensation order. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2015; 34(1): 63. doi: 10.1186/ s13046-015-0179-9.
27. Milbury C.A., Li J., Makrigiorgos G.M. Ice-COLD-PCR enables rapid amplification and robust enrichment for low-abundance unknown DNA mutations. Nucleic Acids Res. 2011; 39(1): e2. doi: 10.1093/nar/gkq899/
Поступила 23.09.15 Принята к печати 12.07.16
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.155.392.2-036.11-036.86-07
Комков А.Ю.12, Мирошниченкова А.М.2, Ольшанская Ю.В.2, Мякова Н.В.2, Дьяконова Ю.Ю.2, Минервина А.А.1, Мамедов И.З.1, Лебедев Ю.Б.1, Масчан А.А.2, Масчан М.А.2
ДЕТЕКЦИЯ ПЕРЕСТРОЕК ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ ГЕНОВ ПРИ ОСТРЫХ ЛИМФОБЛАСТНЫХ ЛЕЙКОЗАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ
1ФАНО России ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, 117997, г. Москва. Россия; 2ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии, иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, 117997, г. Москва. Россия
Мониторинг минимальной остаточной болезни является одним из важнейших инструментов при терапии острых лимфобластных лейкозов. Однако применение его в клинической практике имеет ряд существенных ограничений, связанных с методологическими сложностями, высокой стоимостью и зачастую неоднозначностью интерпретации результатов. В данной работе описывается система для идентификации клональных перестроек в локусах иммуноглобулиновых генов с использованием метода высокопроизводительного секвенирования нового поколения. Проведена апробация системы на 17 клинических образцах, взятых у детей, больных В-клеточным острым лимфобластным лейкозом. Для 16 исследованных образцов обнаружено от 1 до 6 различных перестроек иммуноглобулиновых генов. Сравнение новой системы с традиционно используемой системой BIOMED-2 показало высокую корреляцию результатов. Дальнейшее развитие системы позволит создать высоконадежный и чувствительный метод для мониторинга минимальной остаточной болезни.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз; минимальная остаточная болезнь; перестройки иммуноглобулиновых генов; высокопроизводительное секвенирование.
Для цитирования: Комков А.Ю., Мирошниченкова А.М., Ольшанская Ю.В., Мякова Н.В., Дьяконова Ю.Ю., Минер-вина А.А., Мамедов И.З., Лебедев Ю.Б., Масчан А.А., Масчан М.А. Детекция перестроек иммуноглобулиновых генов при острых лимфобластных лейкозах с использованием высокопроизводительного секвенирования нового поколения. Гематология и трансфузиология. 2016; 61(4): 200-204. DOI: http://dx.doi.Org/:10.18821/0234-5730-2016-61-4-200-204
Original article
KomkovA.Yu.1,2, Miroshnichenkova A.M.2, Olshanskaya Yu.V.2, Myakova N.V.2, Diakonova Yu.Yu.2, Minervina A.A.1, Mamedov I.Z.1, Lebedev Yu.B.1, Maschan A.A.2, Maschan M.A.2
DETECTION OF IMMUNOGLOBULIN GENES REARRANGEMENTS IN PATIENTS WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA USING HIGHTHROUGHPUT NEXT GENERATION SEQUENCING
1Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry Russian Academy of Sciences, Moscow, 117997, Russian Federation 2D. Rogachev Federal Research Center for Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, 117997, Russian Federation
Monitoring of minimal residual disease (MRD) proved to be a valuable tool for predicting relapse in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). However, the universal use of MRD monitoring in routine clinical practice is limited because current MRD assays have some methodological difficulties, high price and ambiguity of assay results interpretation. Here we describe next generation sequencing based system for the detection of clonal rearrangements in immunoglobulin genes loci. We performed testing of the system on 17 initial bone marrow samples from B-ALL patients. We revealed 1 to 6 characteristic immunoglobulin genes rearrangements in each of 16 samples. These results are in a good accordance with the results obtained by traditional BIOMED-2 assay. Further improvement of the reported system will provide highly reliable and sensitive technique for MRD monitoring.
Keywords: acute lymphoblastic leukemia; minimal residual disease; immunoglobulin genes rearrangements; highthroughput sequencing.
For citation: Komkov A.Yu., Miroshnichenkova A.M., Olshanskaya Yu.V., Myakova N.V., Diakonova Yu.Yu., Minervina A.A., Mamedov I.Z., Lebedev Yu.B., Maschan A.A., Maschan M.A. Detection of immunoglobulin genes rearrangements in patients with acute lymphoblastic leukemia using highthroughput next generation sequencing. Hematology and Transfusiology. Russian Journal (Gematologiya i transfusiologiya). 2016; 61(4): 200-204. (in Russian). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0234-5730-2016-61-4-200-204
Acknowledgments. The study was supported by Grant of Ministry of Education and Science of the Russian Federation (RFMEFI60414X0118). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Received 10 November 2016 Accepted 22 November 2016
Определение минимальной остаточной болезни (МОБ) при лейкозах является одним из важнейших инструментов прогнозирования течения заболевания и определения терапевтической стратегии [1]. Для мониторинга МОБ используют различные маркеры и методологические подходы. В опухолевых клетках при острых лимфобластных лейкозах (ОЛЛ) достаточно часто обнаруживаются перестройки локусов им-муноглобулиновых рецепторов, которые происходят по механизму У(Э^-рекомбинации. Поскольку в результате У(О) J-рекомбинации может образоваться огромное количество вариантов, такой вид маркера удобно использовать для мониторинга МОБ: конкретная перестройка отсутствует в нормальных клетках и уникальна для абнормального клона, а значит ее обнаружение в костном мозге после химиотерапии однозначно указывает на наличие лейкемических клеток. Первичная идентификация иммуноглобулиновых перестроек, характерных для патогенного клона при ОЛЛ, на первый взгляд не представляет существенной проблемы: содержание опухолевых клеток в клиническом образце костного мозга или крови пациента составляет от 20 до 95%. Такую идентификацию стандартно проводят с использованием набора BЮMED-2 [2]. Данная система основана на ПЦР-амплификации локусов генов иммуноглобулиновых рецепторов с помощью не-
Для корреспонденции:
Масчан Михаил Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заместитель генерального директора, директор Высшей школы молекулярной и экспериментальной медицины ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. E-mail: mmaschan@yandex.ru.
For correspondence:
Maschan Michael A, MD, PhD, deputy-director of the Dmitriy Rogachev Research Center for pediatric hematology, oncology and immunology. Moscow, 117997, Russian Federation. E-mail: mmaschan@ yandex.ru.
Information about authors:
Komkov A.Yu., http://orcid.org/0000-0001-9113-698X; Miroshnichenkova A.M., http://orcid.org/0000-0003-1833-0430; Olshanskaya Yu.V., http://orcid.org/0000-0002-2352-7716; Myakova N.V., http://orcid. org/0000-0002-4779-1896; Diakonova Yu.Yu. http://orcid.org/0000-0002-8725-7532; Minervina A.L., http://orcid.org/0000-0001-9884-6351; Mamedov I.Z., http://orcid.org /0000-0002-3992-9285; Lebedev Yu.B., http:// orcid.org/0000-0003-4554-4733; Maschan A.A., http://orcid.org/0000-0002-0016-6698; Maschan M.A., http://orcid.org/0000-0003-1735-0093.
скольких смесей праймеров с последующим секвенирова-нием полученных ампликонов по методу Сэнгера. Несмотря на широкое использование данной системы на протяжении последних 15 лет, она имеет ряд недостатков, наиболее существенным из которых является невозможность идентификации диагностических перестроек, произошедших в обоих аллелях одного локуса. Кроме того, использование набора BIOMED-2 достаточно трудоемко и для идентификации перестройки требуется довольно много времени. В связи с этим несколькими исследовательскими группами был предложен подход, при котором детекцию перестроек проводят с использованием высокопроизводительного секвенирования нового поколения (High Throughput Sequencing - HTS или Next Generation Sequencing - NGS) [3-5]. Использование нового метода позволяет различать перестройки двух аллелей в одном локусе и при определенных условиях сократить время и стоимость анализа в расчете на один образец. На основе проведенных исследований были разработаны коммерчески доступные наборы (например, LymphoTrack, InvivoScribe). Однако созданные наборы не позволяют анализировать полную панель перестроек, так как содержат набор праймеров лишь для части иммуноглобулиновых генов.
В данной работе мы описываем созданную оригинальную систему для первичной детекции перестроек иммуногло-булиновых локусов. Разработанная система позволяет проводить детекцию перестроек во всех иммуноглобулиновых локусах, используемых в стандартном наборе BIOMED-2. Проведена апробация системы на наборе из 20 первичных образцов, взятых у больных ОЛЛ.
Материал и методы
В исследование были включены 17 детей больных ОЛЛ в возрасте от 1 года до 15 лет (медиана возраста 4 года) В выборку были включены больные с различным типом В-ОЛЛ по результатам исследования с цитофлюориметрическим окрашиванием образцов (см. таблицу). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФНКЦ ДГОИ.
Библиотеки для массированного секвенирования получали в ходе двух этапов ПЦР-амплификации. На обоих этапах каждую ПЦР проводили в объеме 25 мкл, содержащем 1X Tersus Buffer («Евроген», Россия), 1Х полимеразу Tersus («Евроген», Россия), 5 нмоль каждого нуклеозидтрифосфата ("Thermo Scientific", США).
Гематология и трансфузиология. 2016; 61(4) Оригинальная статья
Геномная ДНК
V D J С
¡5 | 1 ПЦР ¡7 /
¡5 CDR3 | 2 ПЦР ¡7
CDR3
Схема получения библиотек для секвенирования на платформе Illumina. Прямоугольниками разных цветов обозначены геномные сегменты (V, D, J) из которых формируется перестройка в результате рекомбинации. CDR3 - гипервариабельный участок; i5 и i7 - 8-нуклеотидные баркоды образца Illumina.
На первом этапе для каждого образца ДНК выполняли 8 мультиплексных ПЦР, каждая из которых содержала по 40 нг геномной ДНК и соответствующий набор олигонуклеотидных прай-меров (5 пмоль каждого). Амплификацию проводили методом "touchdown": предварительный прогрев 95 °С 2 мин, затем четыре цикла с профилем 95 °С 20 с, 68 °С 20 с, 72 °С 40 с, каждые следующие четыре цикла ПЦР осуществляли при пониженной на 2 °С температуре отжига вплоть до достижения 60 °С, затем на последних 15 циклах амплификации температуру отжига поднимали до 72 °С. По завершении ПЦР из каждой реакционной смеси отбирали по 5 мкл, смешивали и экстрагировали ДНК с помощью 0,8 объема магнитных частиц AmPure XP Beads ("Beckman Coulter", США). Реакционная смесь для второго этапа амплификации в дополнение к указанным выше компонентам содержала в качестве матрицы экстрагированные ампликоны, полученные на первом этапе, и пару олигонуклеотидных прай-меров (5 пмоль каждого). Температурный профиль амплификации включал предварительный прогрев 2 мин при температуре 95 °С и 15 циклов с профилем 95 °С 20 с, 55 °С 20 с, 72 °С 40 с. Из полученных реакционных смесей с помощью 0,8 объема магнитных частиц AmPure XP Beads экстрагировали ДНК, которую затем секвенировали на платформе Illumina (MiSeq, длина чтения 2х150). Анализ данных секвенирования проводили с помощью веб-платформы Galaxy (https://usegalaxy.org) и программы IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast).
Результаты
Описание и принцип действия системы
При разработке системы для инициальной детекции перестроек мы использовали принцип, примененный в работах [3-5] для идентификации перестроек локуса IGH. Общий принцип такого подхода проиллюстрирован на рисунке. Для получения библиотек, содержащих перестройки иммуногло-булиновых локусов, адаптированных для высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina, проводят ПЦР-амплификацию в две стадии. На первой стадии в качестве матрицы используют геномную ДНК, выделенную из инициального образца костного мозга больных ОЛЛ. Для амплификации всех локусов проводят параллельную амплификацию с 8 разными наборами праймеров, соответствующих генам иммуноглобулинов (IGH, IGL, IGK) и Т-клеточных рецепторов (TRB, TRG, TRD). Наборы праймеров позволяют детектировать как полные (VDJ), так и неполные (DJ) перестройки локусов TRB и IGH. Каждый из 66 праймеров, составляющих 8 наборов, состоит из специфической 3'-ча-сти, соответствующей своему иммуноглобулиновому локусу и универсальной 5'-части, содержащей олигонуклеотиды, необходимые для секвенирования. На второй стадии амплификации вводят последовательности, необходимые для гибридизации на сиквенсовую ячейку Illumina и 8 нуклео-тидные баркоды образцов с двух сторон каждой молекулы
DOI http://dx .doi.org/10.18821/0234-5730-2016-61-4-200-204
(см. рисунок, i5 и i7). Использование двойного баркодирова-ния потенциально позволяет проанализировать до 384 индивидуальных клинических образцов за один запуск секвена-тора. После двухстадийной амплификации проводят очистку полученных библиотек, после чего они напрямую секвени-руются в приборе Illumina MiSeq. Общее время подготовки библиотек с момента получения геномной ДНК до запуска прибора составляет около 6 ч.
Проверка и валидация системы на клинических образцах ОЛЛ
Для проверки разработанной системы была проведена детекция перестроек шести иммуноглобулиновых локусов в 17 первичных образцах ОЛЛ (см. таблицу). В результате проведенного секвенирования и анализа полученных данных в 16 образцах были выявлены клональные маркеры опухолевых лимфобластов, каждый из которых представляет собой ну-клеотидную последовательность V(D)J-перестройки одного из иммуноглобулиновых локусов с аномально высокой долей среди всего массива сиквенсов данного локуса. Число обнаруженных в одном образце перестроек варьировало от 1 до 6. Доля сиквенсов, представляющих собой перестройку, варьировала от 17 до 78%. Для 1 образца перестройки не были обнаружены, а распределение численности отдельных сик-венсов каждого из анализируемых локусов соответствовало таковому у здорового человека. Был проведен анализ структуры каждого из выявленных маркеров и идентифицированы V, D и J-сегменты, образовавшие каждую перестройку. Для 4 исследованных образцов было проведено определение перестройки традиционным методом, основанным на амплификации с набором праймеров BIOMED-2 и секвени-рованием методом Сэнгеру. Полученные результаты совпадают с результатами, полученными с использованием разработанной нами NGS-системы.
Обсуждение
Мониторинг МОБ является важным инструментом прогнозирования риска развития рецидива как у взрослых, так и у детей, страдающих ОЛЛ. Если до недавнего времени единственным методом профилактики рецидива при перси-стенции МОБ у больных лейкозами из предшественников В-лимфоцитов являлась токсичная и применимая далеко не у всех больных миелоаблативная терапия с трансплантацией гематопоэтических предшественников, то c появлением инновационных методов иммунотерапии - биспецифических активаторов Т-лимфоцитов (блинатумомаб) и Т-лимфоцитов с химерными рецепторами (CART), которые способны эффективно элиминировать МОБ, открывает совершенно новые возможности в лечении ОЛЛ [6].
До недавнего времени для детекции МОБ применяли либо проточную цитометрию с мониторингов клеток с «лейке-мическим иммунофенотипом», либо поиск и секвенирование по Сэнгеру специфичных для конкретного больного реарран-жировок генов Т-клеточного рецептора и иммуноглобулинов. Оба этих метода имеют свои недостатки и малоприменимы для массовых исследований, особенно в странах с большой территорией и сложной логистикой перемещения биологических образцов.
Метод высокопроизводительного секвенирования нового поколения находит все более широкое применение в клинической практике, в том числе и для мониторинга МОБ [1, 4, 5, 7-11]. Несмотря на кажущуюся дороговизну метода, его использование дает ряд существенных преимуществ по сравнению с традиционным секвенированием по Сэнгеру при сравнимой стоимости анализа в пересчете на один образец. К таким преимуществам относятся возможность различать множественные перестройки для одного иммуноглобулино-вого локуса, идентифицировать минорные варианты лимфо-идных клонов, оценивать общее распределение патогенных и нормальных перестроек в образце. Другими словами, детекция иммуноглобулиновых перестроек с использованием NGS является более чувствительной и достоверной по
Original article
Характеристика больных и результаты идентификации перестроек иммуноглобулиновых локусов
Образец Тип ОЛЛ Локус V* D* J* CDR3**
10802 B3 IGH V4-39 D2-2 J6 ARDRGL##YQLLWTLGLGVLLRYGR
IGH V3-30 D2-2 J6 ARG#YQLLWTLGLGVLLRYGR
IGH D3-3 J5
11160 B2 IGL V3-25 J3 QSADSSGTYPYWV
IGH V3-11 D2-2 J6 ARD#TGYCSSTSCFTRQQTTTTTVWT
TCRG V11 J1 AL#E
11525 B3 IGK V1-37 J5 QRTYNAPPPA
TCRB V14 D2 J2 GREGTDTQY
10575 B IGH V3-74 D1-26 J6 ASRSSHYQWELLEATTTTTWTS
IGH D1-26 J6
16113 B2 IGH V3-23 D2-15 J6 AQEGIL#WW#LLLRATTTTVWTS
IGH V4-39 D2-15 J4 AREKQGCSGGSCYVVATLTT
IGH V3-30 D2-15 J4 ARDDIVVVVAATLLLL#L
TCRG V2 JP2 ATWDGQSDWIKT
IGK V2-30 J2 MQGTHWPQH
16294 B2 IGH V4-34 D2-2 J5 ARAESPYCSSTSCSTGSTP
IGH D3-9 J4
IGH D2-2 J4
TCRD V3 D3 J1 AFPRLPPG#GWPINSS
TCRD V3 D3 J1 ALILSSYGGGYAATDKLI
16398 B3 IGH V2-26 D1-26 J4 ARMTAHWKDQALEDIVGATRRALT
IGH D3-16 J4
IGH D1-26 J4
TCRG V11 JP1 ACWTQAGWFKI
15801 B2 TCRG V4 J1 ATWDGPPENYYKK
IGH V3-74 J6 YGMDV
TCRB V14 J2-3 ASSPKLRS
TCRB V27 J2-5 ASSLTPPCHSGDPV
IGH V4-34 D1-7 J4 ARKLEL#L
IGL V3-25 J1 QSADSSGTYV
13452 B2 IGH V1-2 D3-22 J5 ITTKGGSTP
TCRG V11 J1 ACWIRRIIIR
TCRG V3 J1 ATWDRGRGLL#E
13630 B2 IGH V3-33 D2-8 J6 AREKRNPLGELGYCTNGVCYTTTTW
IGH V3-7 D7-27 J3 ARAGTGDRG#GF#Y
IGK V-26 J5 ARCTRSGVT
14006 B IGL V3-1 J2 QAWDSSK
IGK V1-37 J4 QRTYNAPPRSPLT
IGH V3-53 D6-6 J4 ARGGSSSSYFDY
TCRG V2 J1 ATWDGPEVR
14108 B IGL V2-14 J2 SSYTSSSTPGG
14199 B3 TCRG V9 J1 ALWRDYYKK
IGH V3-30 D6-19 J4 KGDGRLVL#L
IGH V1-45 D5-24 J6 ATEENYYYGMDV
14379 B TCRG V3 J1 ATWDPQG#E
14501 B3 IGH V3-23 D2-8 J6 AKDLQGILY#WCMLLLLRYGR
IGH V3-30 D2-8 J6 ATSKEYCTNGVCYYYYGMDV
TCRG V5 J1 ATWD##IIIR
TCRB V4-1 D2 J2-5 ASSLAGGGGETQY
IGL V3-19 J3 NSRDSSGNHLGV
IGK V2-29 J3 MQGV
13603 B IGH V4-30 D2-21 J6 AEWGLNCGGDCYSDLLLLRYGR
TCRD V3 D3 J1 AFKTARWGIGSDKLI
Примечание. * - указаны V, D и J-сеmенты образовавшие перестройку. В случае неполной перестройки локусов ЮН, ТКВ и ТКС ^сегмент отсутствует; ** - аминокислотные последовательности CDR3 для каждой перестройки; # - стоп-кодон для неполных перестроек локусов ЮН, ТКВ и ТКС последовательность CDR3 не приводится.
Гематология и трансфузиология. 2016; 61(4)
DOI http://dx .doi .org/10.18821/0234-5730-2016-61-4-204-208
Оригинальная статья
сравнению с традиционным подходом. Однако разработка надежной тест-системы для детекции перестроек была ограничена некоторыми методическими сложностями, к которым относятся прежде всего разработка оптимальных смесей олигонуклеотидных праймеров и алгоритм интерпретации результатов секвенирования. В приведенном исследовании разработана и протестирована такая система для детекции клональных перестроек лейкозных клеток при ОЛЛ с использованием высокопроизводительного секвенирования. В отличие от ранее разработанных наборов данная система позволяет детектировать одновременно перестройки всех иммуноглобулиновых локусов, для которых показаны перестройки при ОЛЛ.
Проведенное тестирование системы показало как ее высокую чувствительность, так и достаточно высокую достоверность при сравнении с традиционно используемым аналогом. Дальнейшее развитие данной работы предполагает исследования на большей выборке пациентов и совершенствование программного обеспечения для анализа данных секвенирования. Следующим этапом является создание интегрированной тест-системы, позволяющей проводить не только детекцию перестроек в исходном образце, но и определение непосредственно МОБ в образцах после химиотерапии. Успешная реализация данного проекта приведет к созданию высокопроизводительного метода для высокочувствительного мониторинга МОБ при ОЛЛ.
Финансирование. Исследование было поддержано грантом Министерства образования и науки Российской Федерации, уникальный идентификатор проекта RFMEFI60414X0118.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Л И Т Е РА Т У РА / REFERENCES
1. van Dongen J.J., van der Velden V.H., Bruggemann M., Orfao A. Minimal residual disease diagnostics in acute lymphoblastic leukemia: need for sensitive, fast, and standardized technologies. Blood. 2015; 125(26): 3996-4009.
2. van Dongen J.J., Langerak A.W., Bruggemann M., Evans P.A., Hummel M., Lavender F.L., et al. Design and standardization of PCR primers
and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 2003; 17(12): 2257-317.
3. Kotrova M., Muzikova K., Mejstrikova E., Novakova M., Bakardjieva-Mihaylova V., Fiser K., et al. The predictive strength of next-generation sequencing MRD detection for relapse compared with current methods in childhood ALL. Blood. 2015; 126(8): 1045-7.
4. Wu D., Sherwood A., Fromm J.R., Winter S.S., Dunsmore K.P., Loh M.L., et al. High-throughput sequencing detects minimal residual disease in acute T lymphoblastic leukemia. Sci. Transl. Med. 2012; 4(134): 134ra163. doi: 10.1126/scitranslmed.3003656.
5. Wu J., Jia S., Wang C., Zhang W., Liu S., Zeng X., et al. Minimal Residual Disease Detection and Evolved IGH Clones Analysis in Acute B Lymphoblastic Leukemia Using IGH Deep Sequencing. Front. Immunol. 2016; 7: 403.
6. Topp M.S., Gökbuget N., Zugmaier G., Degenhard E., Goebeler M.E., Klinger M., et al. Long-term follow-up of hematologic relapse-free survival in a phase 2 study of blinatumomab in patients with MRD in B-lineage ALL. Blood. 2012; 120(26): 5185-7. doi: 10.1182/ blood-2012-07-441030.
7. Campana D. Minimal residual disease monitoring in childhood acute lymphoblastic leukemia. Curr. Opin. Hematol. 2012; 19(4): 313-8. doi: 10.1097/M0H.0b013e3283543d5c.
8. Clemente M.J., Przychodzen B., Jerez A., Dienes B.E., Afable M.G., Husseinzadeh H., et al. Deep sequencing of the T-cell receptor repertoire in CD8+ T-large granular lymphocyte leukemia identifies signature landscapes. Blood. 2013; 122(25): 4077-85. doi: 10.1182/ blood-2013-05-506386.
9. Faham M., Zheng J., Moorhead M., Carlton V. E., Stow P., Coustan-Smith E., et al. Deep-sequencing approach for minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2012; 120(26): 517380. doi: 10.1182/blood-2012-07-444042.
10. Ladetto M., Bruggemann M., Monitillo L., Ferrero S., Pepin F., Drandi D., et al. Next-generation sequencing and real-time quantitative PCR for minimal residual disease detection in B-cell disorders. Leukemia. 2014; 28(6): 1299-307.
11. Logan A.C., Vashi N., Faham M., Carlton V., Kong K., Buno I., et al. Immunoglobulin and T cell receptor gene high-throughput sequencing quantifies minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia and predicts post-transplantation relapse and survival. Biol. Blood Marrow Transplant. 2014; 20(9): 1307-13. doi: 10.1016/j.bbmt.2014.04.018.
Поступила 10.11.16 Принята к печати 22.11.16
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.382.041
Берковский А.Л., Сергеева Е.В., Суворов А.В., Гурвиц И.Д., Анисимова Е.В., Савченко В.Г.
ПОЛУЧЕНИЕ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ПЛАЗМЫ С СОХРАНЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ
ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, 125167, Москва, Россия
Применение лиофилизированной плазмы имеет ряд преимуществ перед свежезамороженной плазмой (СЗП) как для оказания трансфузионной помощи в полевых условиях, так и для проведения диагностических исследований системы гемостаза. Выполнение диагностических исследований требует наличия биологических стандартов, плазм-калибраторов и контрольных материалов с высокой стабильностью целевых показателей при хранении лиофилизированных реагентов. Процесс лиофили-зации плазмы вызывает значительные изменения коагулологических показателей и сопровождается повышением ее рН. Целью работы являлось получение лиофилизированной плазмы крови человека без выраженных при лиофилизации и хранении изменениях активности факторов свертывания крови. Показано, что подкисление пулированной СЗП от не менее 20 доноров перед лиофилизацией до значений рН 7,0-7,1 буферным раствором HEPES в конечной концентрации 50 мМ повышало стабильность факторов системы гемостаза и сохраняло физиологический уровень рН плазмы после лиофилизации. В условиях ускоренного хранения именно такие лиофилизированные плазмы характеризовались большей стабильностью всех определяемых коагулологических показателей. Таким образом, предложенный подход позволяет получать стабильные при хранении лиофилизированные формы диагностических реагентов и контрольных материалов.
Ключевые слова: лиофилизированная плазмы; рН; методы стабилизации; факторы свертывания крови; плазмы-калибраторы; гемостазиологические стандарты.
Для цитирования: Берковский А.Л., Сергеева Е.В., Суворов А.В., Гурвиц И.Д., Анисимова Е.В., Савченко В.Г. Получение лиофилизированной плазмы с сохраненной активностью факторов свертывания. Гематология и трансфузиология. 2016; 61(4): 204-208. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0234-5730-2016-61-4-204-208
