CC BY
3ДЕТЕКЦИЯ И ПОДХОДЫ В ТЕРАПИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА
ОСНОВЕ ДНК-АПТАМЕРОВ Ибрагимов А.А.1, Тангияриков Б.С.2, Тё Е.М.3, Юсубахмедов А.А.4, Умаров Б.Р.5,
Мурадова И.А.6, Гулямова М.А.7
^'^Ташкентский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток
adylibh@mail.ru
2,4Республиканский государственный центр диагностики болезней животных и
безопасности продовольствия Республиканский специализированный научно-практический медицинский центр
онкологии и радиологии, М3 РУз https://doi.org/10.5281/zenodo. 8368286
Аннотация. В последние годы в области медицины активно изучают возможности использования аптамеров в качестве диагностики, профилактики и лечения бактериальных инфекций. Инфекционно значимыми бактериями для животных являются, в первую очередь бруцеллы (Brucella abortus, Brucella melitensis), сальмонеллы (Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium), стафилококки (Staphylococcus aureus), и клинически значимыми для человека. В этой статье, отведена ключевая роль в разработке технологии «ДНК-аптамеров» генам бактерии бруцеллеза и далее применения этих подходов в синтезе ДНК-аптамеров к таким бактериям - как сальмонеллы (S.Enteritidis, S.Typhimurium) и стафилококки (S. Aureus). Современные методы ПЦР, ОТ-ПЦР, ELISA и т.д., выявляют только наличие отмеченных бактериальных болезней, но не их лечения. Цель исследования. Разработка ДНК-аптамеров к генам бруцелл. Материалы и методы. Выделение из крови инфицированных животных ПЦР продуктов к генам B. abortus и B. melitensis и их использования для синтеза ДНК-аптамеров методом SELEX. Результаты. Синтезированные ДНК-аптамеры позволят таргетно воздействовать на ингибирование экспрессии генов и гибели бруцеллы. Выводы. Использование ДНК-аптамеров в диагностике, профилактике и лечения животных инфицированные бруцеллезом. В отличие от моноклональных антител, ДНК-аптамеры не иммуногены и в 100 раз дешевле в их синтезе.
Ключевые слова: ПЦР, ДНК, ДНК-аптамеры, SELEX, бруцелла, сальмонелла, стафилококк.
Abstract. In recent years, the field of medicine has been actively studying the possibilities of using aptamersfor the diagnosis, prevention and treatment of bacterial infections. Bacteria that are infectiously significant for animals are primarily Brucella (Brucella abortus, Brucella melitensis), Salmonella (Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium), Staphylococcus (Staphylococcus aureus), and clinically significant for humans. In this article, a key role in the development of "DNA aptamer" technology is assigned to the genes of the bacterium brucellosis and further application of these approaches in the synthesis of DNA aptamers to such bacteria as salmonella (S. Enteritidis, S. Typhimurium) and staphylococcus (S. Aureus) . Modern methods of PCR, RT-PCR, ELISA, etc., detect only the presence of noted bacterial diseases, but not their treatment. Purpose of the study. Development of DNA aptamers for Brucella genes. Materials and methods. Isolation of PCR products for the genes of B. abortus and B. melitensis from the blood of infected animals and their use for the synthesis of DNA aptamers using the SELEX method. Results. Synthesized DNA aptamers will make it possible to target inhibition of gene
expression and death of Brucella. Conclusions. The use of DNA aptamers in the diagnosis, prevention and treatment of animals infected with brucellosis. Unlike monoclonal antibodies, DNA aptamers are not immunogenic and are 100 times cheaper to synthesize.
Key words: PCR, DNA, DNA aptamers, SELEX, brucella, salmonella, staphylococcus.
Аннотация. Сунгги йилларда тиббиёт соуаси аптамерлардан бактериал инфекцияларни ташхислаш, олдини олиш ва даволаш сифатида фойдаланиш имкониятларини фаол урганмоцда. %айвонлар учун юцумли бактериялар, биринчи навбатда, бруcелла (Brucella abortus, Brucella melitensis), сальмонеллы (Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium), стафилококклар (Staphylococcus aureus) ва одамлар учун клиник ауамиятга ега. Ушбу мацолада "ДНК аптамер" технологиясини ишлаб чицишда ва Salmonella (S.Enteritidis, S.Typhimurium) каби бактерияларга ДНК аптамерларини синтез цилишда ушбу ёндашувларни янада цуллашда бруцеллёз бактерияси генларига асосий рол берилган ва стафилококклар (S. Aureus). ПЗР, РТ-ПЗР, ELISA ва уоказоларнинг замонавий усуллари., фацат белгиланган бактериал касалликларнинг мавжудлигини аницланг, аммо уларни даволаш емас. Тадцицот мацсади. Бруcелла генлари учун ДНК аптамерларини ишлаб чициш. Материаллар ва усуллари. B. abortus ва B. melitensis ген маусулотларини ПЗР орцали юцтирган уайвонларнинг цонидан ажратиш ва улардан SELEX усули билан ДНК аптамерларини синтез цилиш учун фойдаланиш. Натижалар. Синтезланган ДНК аптамерлари ген експрессионини ва бруcелла улимини инуибе цилишга имкон беради. Хулоса. Бруцеллёз билан касалланган уайвонларни ташхислаш, олдини олиш ва даволашда ДНК аптамерларидан фойдаланиш. Моноклонал антикорлардан фарцли улароц, ДНК аптамерлари иммуноген емас ва уларнинг синтезида 100 баравар арзон.
Калит сузлар: ПЗР, ДНК, РНК, аптамерлар, SELEX, бруселла, салмонелла, стафилококк.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы в молекулярной медицине активно изучают возможности использования нуклеиновых кислот в качестве терапевтических и диагностических препаратов. Это связано с открытием свойства олигонуклеотидов, получивших название «аптамеры», специфически связываться с разнообразными молекулами-мишенями. В чем же преимущества такого подхода?
Аптамерами называют одноцепочечные молекулы ДНК или РНК, которые могут образовывать сложную трехмерную пространственную структуру, комплементарную другим поверхностям, и поэтому способную «узнавать» другие молекулы или даже проявлять каталитическую активность.
Как известно, под комплементарностью в химии, молекулярной биологии и генетике подразумевают взаимное соответствие молекул биополимеров либо их фрагментов, обеспечивающее образование связей между пространственно взаимодополняющими (комплементарными) фрагментами, молекул или их структурных фрагментов вследствие супрамолекулярных взаимодействий (образование водородных связей, гидрофобных, электростатических взаимодействий заряженных функциональных групп и т.п.).
Абстрактная формула аптамера [Замай А.С., 2014]
Однако следует отметить, что такие пространственные структуры могут быть образованы только одноцепочными ДНК или РНК, поскольку их двухцепочные формы имеют структуру двойной спирали независимо от последовательности.
Аптамеры получили свое название от латинского слова aptus — подходящий. Они представляют собой небольшие (обычно от 20 до 60 нуклеотидов) одноцепочечные молекулы РНК или ДНК, способные с высокой аффинностью и специфичностью связываться с молекулой-мишенью. К настоящему времени аптамеры могут быть получены практически к любым мишеням: белкам, полисахаридам, малым органическим молекулам, вирусам, целым клеткам бактерий и млекопитающих [Замай А.С., 2014; Коловская О.С., 2022].
Как же получают аптамеры? Суть процедуры получения аптамеров, названной SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment — системная эволюция лигандов экспоненциальным обогащением), заключается в следующем. Например, в пробирке искусственно синтезируют короткие однонитевые РНК, состоящие из трех частей: по краям последовательности нуклеотидов у всех молекул РНК одинаковые, а вот центральная часть (длиной около 20-30 нуклеотидов) у всех РНК вариабельная. Как показывает расчет, из двух десятков этих нуклеотидов можно создать «астрономическое» число отличающихся друг от друга нуклеотидных последовательностей (примерно 17 -значное число вариантов!). Выяснилось, что в таком гигантском наборе разнообразных коротких РНК (его называют комбинаторной библиотекой) практически всегда найдется один или даже несколько вариантов молекул, которые способны специфически связываться, например, с белком-мишенью и подавлять его биологическую активность.
Аптамеры могут найти применение в качестве средств целевой доставки радиоизотопов, цитотоксичных агентов и других традиционных лекарственных средств.
Олигонуклеотиды, не связавшиеся с мишенью, удаляют, а связавшиеся амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции. Данный цикл многократно повторяют, в результате чего происходит обогащение последовательностями, имеющими сродство к молекуле-мишени. После этого молекулы аптамеров клонируют в составе плазмид и индивидуально проверяют их свойства.
После отбора молекул РНК (реже ДНК), которые специфически связываются, например, с определенным белком, проводят еще одну селекцию: отбирают те аптамеры, которые не только соединяются с белком, но и подавляют его активность. В случае успеха исследователи получают мощный специфический агент, направленный на единственную мишень. После привнесения в клетку такой аптамер окажет влияние исключительно на тот единственный белок-мишень, для которого он был предварительно отобран, и при этом не вызовет каких-либо побочных эффектов.
Перспективным направлением биофармацевтики может стать создание аптамеров к инфицированным живым клеткам для выявления их в организме и целевой доставки к ним токсинов. Кроме того, после окончания действия такое лекарство полностью биодеградируется, поскольку ДНК не является для клетки ксенобиотиком, то есть никакого накопления побочных продуктов не происходит. Следовательно, аптамеры в принципе являются потенциально весьма перспективным классом соединений для создания новых лекарств.
Разработка ДНК аптамеров для детекции Brucella abortus и Brucella melitensis методом CELL SELEX
Бруцеллез — инфекционное, особо опасное зоонозное заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, которые являются грамотрицательными, факультативными бактериями со способностями к внутриклеточному паразитированию и трансмиссивной передачей от животных к человеку [Pappas G. et al., 2006].
Бруцеллез представляет актуальную проблему для здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 500 тыс.впервые выявленных случаев бруцеллеза у людей. Бруцеллез у людей протекает с рецидивами и переходит в хроническую форму, устойчивую к терапии антибиотиками [Byndloss M. X. et al., 2016].
Наиболее патогенным для человека является вид B. melitensis (основной хозяин — мелкий рогатый скот), затем следуют B. suis (свиньи, зайцы, олени, грызуны), B. abortus (крупный рогатый скот) и вид B. canis (собаки), опасный для иммунодефицитных людей [Corbel M.J. et al., 1997].
Бруцеллез характеризуется вариабельным инкубационным периодом и заболеванием с тяжелыми клиническими проявлениями, которое требует значительных ресурсов для длительного лечения. Бруцелла демонстрирует выраженный тканевый тропизм и обладает способностью размножаться и персистировать внутри вакуолей макрофагов, дендритных клеток, плацентарных трофобластов и в разнообразных типах клеток млекопитающих: микроглиях, фибробластах, эпителиальных и эндотелиальных клетках. Внутри клеток Brucella ограничивает воздействие хозяйских врожденных и адаптивных иммунных ответов, укрывается от воздействия антибиотиков и вызывает фазовые особенности протекания [Wolfram J.H. et al., 2010].
До настоящего времени профилактические и терапевтические мероприятия при хроническом бруцеллезе людей являются дорогостоящими и неэффективными, в этой ситуации правильное понимание молекулярных механизмов, ответственных за персистенцию бактериального патогена, будет иметь решающее значение для разработки инновационных средств контроля, профилактики и лечения этой инфекции.
В настоящее время у животных и человека, методом ИФА и особенно ПЦР с использованием специфических праймеров к генам B. melitensis, B. abortus, B. suis и B. canis
определяют тип инфекции. Однако ИФА и ПЦР методы только идентифицирую тип бруцеллы.
Учеными ветеринарами инфекционистами из Ирана и Германии разработали ДНК аптамеры для детекции Brucella Abortus и Brucella Melitensis методом Cell Selex [Nosaz Z., et al., 2018]. Авторами этих исследований были получены два аптамера названные термином B20 и B21, которые показали самую высокую специфичность при скрининге в распознавании B. abortus и B. melitensis. Аптамеры B20 и B21 показали высокую толерантность для других бактерий бруцеллеза, B. suis и B. canis, которые влияют на ложные положительные результаты серологических тестов. Ими разработаны аптамеры в определении типа бруцелл, но и в профилактике B. abortus и B. melitensis этих инфекций, как у животных, так и у человека [Nosaz Z. et al., 2018].
Высокоспецифичные ДНК-аптамеры к Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium
Аптамеры могут быть получены не только с использованием отдельных молекул -мишеней, но и на основе связывания с более сложными структурами, включающими живые клетки, в том числе бактериальные (Cell-SELEX). Следует отметить, что технологически Cell-SELEX является весьма эффективной процедурой, поскольку в роли твердой фазы выступает сама мишень, снижая, таким образом, вероятность селекции неспецифически связывающихся аптамерных молекул.
В 2012 г. были получены высокоспецифичные ДНК-аптамеры к Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium методом селекции библиотек аптамеров с использованием в качестве мишеней живых интактных клеток (Cell-SELEX). Константы диссоциации отобранных аптамерных пулов составляли 7 и 25 нМ. Аптамеры показывали высокую специфичность, а именно: они не связывались с термоинактивированными культурами Salmonella и неповрежденными культурами Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Citrobacter freundii. В итоге, в соответствии с показателями наиболее высокой аффинности были выбраны 10 аптамеров для S. enteritidis и 9 — для S. typhimurium. Антибактериальные эффекты воздействия аптамеров были определены путем сравнения и подсчета количества колоний на чашках Петри в культуре, обработанной аптамерами, и в контроле, что отобразилось в виде существенного ингибирования роста [Zamay G.S. et al., 2015].
Механизм подавления роста бактерий не был до конца изучен, однако выяснилось, что бактериостатическое действие вызвано влиянием аптамеров на клеточную стенку бактерий. В экспериментах по окрашиванию Родамином-123 обработанных аптамерами сальмонелл выяснилось, что присутствие аптамеров вызывало сильную деполяризацию клеточной стенки после 30-минутной инкубации. Эффект наблюдался на протяжении 18 ч и сопровождался реверсией. Эффекты взаимодействия аптамеров с поверхностью бактериальных клеток практически не изучены и, возможно, что модуляция физико -химических процессов в бактериальных оболочках является новым перспективным направлением применения аптамеров как для научных целей, так и для создания новых антибактериальных средств [Зенинская Н.А., и др. 2016].
In vitro селекция специфических РНК аптамеров для бактерии
Staphylococcus aureus
Серьезной проблемой инфекционной микробиологии является неэффективность антибиотиков против инфекций, вызванных бактериальными биопленками [Bjarnsholt Т., 2013; Мурадова И.А. и др., 2023]. Staphylococcus aureus — это бактерия, образующая биопленки, которая известна тем, что вызывает широкий спектр персистирующих инфекций, связанных с тканями и имплантатами [Bhattacharya M.W. et al., 2015]. Искоренение этих биопленочных инфекций затруднено, поскольку бактерии в биопленках заключены в самостоятельно вырабатываемый внеклеточный матрикс, состоящий из белков, полисахаридов и внеклеточной ДНК, который защищает их от иммунной системы хозяина и противомикробных агентов. Более того, бактерии в биопленках могут перейти в состояние низкого метаболизма, что резко повышает их толерантность к антибиотикам [Otto M., 2008). В результате бактерии в биопленках могут переносить концентрации антибиотиков в 1000 раз выше, чем их планктонные аналоги [H0iby N. et al., 2010]. Возникает проблема: антибиотики нельзя дозировать в концентрации, достаточной для уничтожения биопленки, не вызывая при этом вредных побочных эффектов для пациента. Единственным выходом является хирургическое удаление биопленки; однако эта процедура связана с высокими затратами, а в некоторых случаях неосуществима [Forier K. et al., 2014). Лечение инфекций биопленки Staphylococcus aureus с использованием традиционной антибиотикотерапии является сложной задачей, поскольку пациентам можно безопасно вводить только сублетальные для биопленки дозы. Staphylococcus aureus - распространенный бактериальный патоген пищевого происхождения. Только в США ежегодно регистрируется 250 000 случаев заболеваний пищевого происхождения, вызванных S. aureus.
Известно, что этот вид бактерий заражается через раны и вызывает остеомиелит, эндокардит и бактериемию [O'Riordan K. Lee, 2004; Scallan E. et al., 2011]. Более поздним событием стало увеличение во всем мире штаммов S. aureus, устойчивых к антибиотикам.
Таким образом, потенциальным решением этой проблемы в лечении этой бактерии является в решении и создания таргетного воздействия S. aureus на основе аптамеров -диагностика, профилактика и терапия.
Как было отмечено выше, Staphylococcus aureus является основным патогеном пищевого происхождения. Грамположительные бактерии содержат уникальные тейхоевые кислоты в качестве компонентов клеточной стенки. Для идентификации специфичных для бактерий лигандов разработаны РНК - аптамер против тейхоевой кислоты S. aureus с использованием технологии SELEX. С этой целью [Seun Ryul Han, Seong-Wook Lee, 2013] использовали метод селекции на основе полистирола с 96 лунками и подтвердили активность связывания РНК-аптамера с тейхоевой кислотой с помощью ОТ-ПЦР. Следует отметить, что специфичный для тейхоевой кислоты РНК-аптамер также связывался с бактериальными клетками S. aureus. Таким образом, этот РНК-аптамер может быть полезен в качестве как, диагностического лиганда против заболеваний пищевого происхождения, связанных с S. aureus, так и в профилактике и лечения этой бактерии.
Распознавание различных классов лигандов аптамерами РНК очень специфично, так что этот подход можно использовать для распознавания только одной метильной группы лигандов [Hermann T., Patel D.J, 2000]. Более того, РНК-аптамер может различать даже очень похожие домены отдельных молекул одних и тех же классов [Bae SюJ., et al., 2002]. Таким образом, РНК-аптамер, разработанный в этом исследовании, будет
высокоселективным в связывании с отдельными областями тейхоевой кислоты, которые невозможно обнаружить у других бактерий.
Таким образом, аптамер может быть применен в качестве лиганда в биосенсорной системе для ранней, быстрой, недорогой, чувствительной и специфической диагностики S. aureus в загрязненных пищевых продуктах или клинических образцах [Seun Ryul Han, Seong-Wook Lee, 2013].
В лечении S. aureus был разработаны новые подходы, адресная доставка лекарств на основе липосом с использованием аптамеров. Так [Pernille Ommen et al, 2022] адаптировали липосомальную систему доставки лекарств, нацеленную на аптамер, для накопления и доставки антибиотиков локально в биопленку S. aureus. В поисках подходящего нацеливающего лиганда, авторы этой работы, идентифицировали шесть ДНК-аптамеров, которые связываются с клетками S.aureus в биопленках, и продемонстрировали, что один из этих аптамеров может способствовать накоплению липосом вокруг клетки и внутри биопленки S. aureus. Липосомы, нацеленные на аптамер, инкапсулирующие комбинацию ванкомицина и рифампицина, были способны уничтожить биопленку S. aureus за 24 часа лечения in vitro. Их результаты указывают на то, что доставка антибиотиков, нацеленная на аптамер, является потенциально новой стратегией лечения инфекций биопленок S. aureus.
ВЫВОДЫ. В этой статье рассмотрены новые подходы и технологии в конструировании молекулярных аптамеров в целях диагностики, профилактике и лечения инфекционных таких бактерий как бруцеллез, сальмонеллез и стафилококк.
REFERENCES
1. Коловская О.С. Адресная коррекция опухолевых процессов многофункциональными молекулярными конструкциями с распознающими элементами - ДНК-аптамерами // Дисер. докт. биол. наук. - Новосибирск, 2022г. - 287 с.
2. Alhamhoom Y., Sobeai H.M., Alsanea S., Alhoshani A. Aptamer - based therapy for targeting key mediators of cancer metastasis // International journal of oncology 60: 65, 2022.
3. Ni S., Zhuo Z., Pan Y., et al, (2021). Recent Progress in Aptamer Discoveries and Modifications for Therapeutic Applications. ACS Applied Materials and Interfaces, 13(8), 9500-9519.
4. Замай А.С. Технологии получения и использования ДНК-аптамеров для разработки новых средств диагностики и терапии // Дисер. докт. биол. наук. Красноярск - 2014. -334 с.
5. Nosaz Z., Rasoulinejad S., Mousavi Gargari, S. L. Development of a DNA aptamer to detect Brucella abortus and Brucella melitensis through cell SELEX. Iranian Journal of Veterinary Research, Shiraz University. LJVR 2020, Vol. 21, No. 4, Ser. No. 73, P. 294-300.
6. Ибрагимов А.А. Изучение механизмов действия новых оригинальных противоопухолевых препаратов, полученных на основе трополоновых алкалоидов из местного растительного сырья // Дисер. докт. биол. наук. - Ташкент, 2022г. - 211 с.
7. Абдухалилова Г.К., Ибрагимов А.А., Ахмедова Х.Ю., и др. Способ получения плазмид Salmonella typhimurium // Патент на изобретение №№ IAP 05610 от 01.05. 2018 г.
8. Seung Ryul Han & Seong-Wook Lee. In vitro selection of RNA aptamer specific to Staphylococcus aureus. BMC. Part of Springer Nature, Annals of Microbiology. Ann Microbiol (2014) 64:883-885. DOI 10.1007/s13213-013-0720-z.
9. Pernille Ommen, Line Hansen, Bente K Hansen, Hieu Vu-Quang, Jorgen Kjems, Rikke L Meyer. Aptamer-Targeted Drug Delivery for Staphylococcus aureus Biofilm. Front Cell Infect Microbiol. 2022. doi: 10.3389/fcimb.2022.814340.
